葡萄糖淀粉酶

1、題目： 葡萄糖淀粉酶結(jié)構(gòu)與功能的研究 食品學(xué)院 學(xué)院 食品科學(xué)與工程 專業(yè)班 級 食科0905班 學(xué) 號 6130112133 學(xué)生姓名 田順風(fēng) 二一三年十二月葡萄糖淀粉酶結(jié)構(gòu)與功能的研究田順風(fēng)（江南大學(xué) 食品學(xué)院 江蘇省 無錫）摘要：本文對葡萄糖淀粉酶在微生物中的分布進行了綜述，對葡萄糖淀粉酶的基本結(jié)構(gòu)及作用機理、理化性質(zhì)及在實際應(yīng)用中的問題和擬解決途徑有了初步了解，并對葡萄糖淀粉酶的應(yīng)用及研究現(xiàn)狀進行了展望。關(guān)鍵詞：葡萄糖淀粉酶；基本機構(gòu)；理化性質(zhì)Research on the structure and function of glucoamylaseTian Shunfeng(Jian

2、gnan University he School of Food Jiangsu Province WuXi)Abstract: In this paper, glucoamylase distributed in microorganisms are reviewed,and we have a preliminary understanding of the basic structure and mechanism of reaction of glucoamylase, physicochemical properties and problems in practical appl

3、ications and ways to be solved.Also the application and research status of glucoamylase are discussed.Key words: glucoamylase; basic structure; physicochemical properties引言酶作為催化劑，本身在反應(yīng)過程中不被消耗，也不影響反應(yīng)的化學(xué)平衡。酶有正催化作用，也有負催化作用，不只是加快反應(yīng)速率，也有減低反應(yīng)速率。與其他非生物催化劑不同的是，酶具有高度的專一性，只催化特定的反應(yīng)或產(chǎn)生特定的構(gòu)型。目前已知的可以被酶催化的反應(yīng)有約4000

4、種，已有數(shù)百計的酶被純化到結(jié)晶的形式。根據(jù)蛋白質(zhì)分子的組成和盤曲折疊方式，酶可分為一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)和四級結(jié)構(gòu)。一級結(jié)構(gòu)指蛋白質(zhì)分子中肽鏈的氨基酸殘基的排列順序，由于半胱氨酸側(cè)鏈巰基經(jīng)氧化后形成ss鍵，因此在蛋白質(zhì)分子的鏈內(nèi)或鏈間都有可能形成二硫橋鍵；二級結(jié)構(gòu)指蛋白質(zhì)分子肽鏈本身的三維空間的規(guī)律性，主要由肽鏈骨架之間的羰基和亞氨基間形成的氫鍵來維系；三級結(jié)構(gòu)為蛋白質(zhì)分子又可按照一定方式再盤曲折疊，主要由鹽鍵、氫鍵、疏水鍵等所維系。這樣折疊后，蛋白質(zhì)的肽鏈雖很長，但由于二、三級結(jié)構(gòu)的存在，多數(shù)蛋白質(zhì)在空間構(gòu)型上卻是緊密的球狀分子；四級結(jié)構(gòu)指由多條各自具有一級、二級、三級結(jié)構(gòu)的肽鏈通過非

5、共價鍵連接起來的結(jié)構(gòu)形式，亞基之間主要由各表面暴露的側(cè)鏈形成的鍵（如疏水鍵）所維系。葡萄糖淀粉酶（glucoamylase）的系統(tǒng)名稱為-1,4-葡聚糖葡萄糖苷水解酶或-淀粉酶，簡稱糖化酶1，是一種單鏈的酸性糖苷水解酶，具有外切酶活性。它從淀粉或類似物分子的非還原末端順序切開-1,4-糖苷鍵，生成-葡萄糖。此外，它也能水解-1,6-糖苷鍵和-1,3-糖苷鍵。目前，糖化酶的研究主要集中在耐熱高產(chǎn)菌株的篩選；糖化酶的熱穩(wěn)定性機理；利用DNA重組技術(shù)構(gòu)建優(yōu)良工程菌株等方面。酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，因此也可用分離純化蛋白質(zhì)的方法分離純化蛋白酶，傳統(tǒng)分離純化蛋白質(zhì)的方法是利用沉淀原理進行的，已廣泛應(yīng)用于實驗室

6、及工業(yè)規(guī)模蛋白質(zhì)等生物產(chǎn)物的回收、濃縮和純化。目前，用于蛋白酶的分離純化的沉淀方法主要有有機溶劑沉淀法、鹽析沉淀法、等電點沉淀法、熱變性沉淀法等。葡萄糖淀粉酶的簡要特征如表1。表1葡萄糖淀粉酶GA系統(tǒng)命名及別名-1，4-葡萄糖苷酶糖化酶-淀粉酶淀粉葡糖糖苷酶主要來源黑曲霉（A. niger)泡盛曲霉（A. awamori）米根酶（Rhizopus oryzae）臭曲霉（A. foetidus）作用機制快速水解-1,4-糖苷鍵緩慢水解-1,6-糖苷鍵和-1,3-糖苷鍵將淀粉水解成-葡萄糖應(yīng)用領(lǐng)域輕工、食品、醫(yī)藥、發(fā)酵等行業(yè)1糖化酶在微生物中的分布及組分多型性工業(yè)用糖化酶主要是從霉菌、酵母等真菌中

7、提取的，從細菌中也可得到熱穩(wěn)定的糖化酶，已報道的糖化酶中真菌為19個屬35個種(含未確定種)，細菌為3屬3種2。真菌產(chǎn)糖化酶組分多型性是常見的，Rhizopus nivenus和Chalara paradoca可分別產(chǎn)生5種和6種活性組分。Svensson等從市售的糖化酶中分離出G和G兩種組分，這兩種糖化酶均由單一的糖基化多膚鏈組成。氰化片段和N-末端氨基酸序列證明它們具有相當(dāng)?shù)耐葱浴ι矸鬯饽芰高于G，對于可溶性淀粉的水解G僅為G活性的75%，但對-1,4-，-1,6-鍵鄰接處碳鏈水解能力相同。One等利用固相Acathose柱從市售糖化酶(A.niger)中分離出6種活性組分，每種

8、活性組分均可從可溶性淀粉中釋放出單一的-D-葡萄糖終產(chǎn)物。這6種組分的分子量、沉降系數(shù)、化學(xué)組成、等電點、酶的動力學(xué)及其它性質(zhì)上各異。培養(yǎng)基的成分和生長條件對糖化酶組分型性也有影響。天然的糖化酶在微生物的培養(yǎng)或酶的制備過程中可能受葡萄糖苷酶和蛋白酶的作用而變成多型性。Aspergillus awamorivar.kawachi的G可被蛋白酶或葡萄糖苷酶水解成Gn。Takahash認為Rhizopus糖化酶轉(zhuǎn)化成三種活性組分主要是蛋白酶的作用。A.niger產(chǎn)生的四種組分糖化酶G、G、G、GIV在培養(yǎng)過程中對兩種蛋白酶有不同的敏感性。2糖化酶的基本結(jié)構(gòu)及作用機理2.1糖化酶中的糖和蛋白組成糖化酶

9、是一種糖蛋白，通常碳水化合物占4%-18%，但S.diastaticus糖化酶碳水化合物高達80%，這些碳水化合物主要是半乳糖、葡萄糖、葡糖胺和甘露糖。A.niger糖化酶I中的碳水化合物以糖昔鍵與L-蘇氨酸和L-絲氨酸相連接，其組分為20個甘露糖、11個2-0-D甘露毗喃-D-甘露糖結(jié)構(gòu)的雙糖，8個三糖和5個四糖，三糖和四糖是由D-葡萄糖、D-甘露糖和D-半乳糖以1.3或1.6糖苷鍵構(gòu)成的。在糖化酶中這種糖殘基的排列在其熱和酸堿穩(wěn)定性上有著特殊的意義。大部分糖化酶的氨基酸組成都已確定。不同組分糖化酶的氨基酸組成不同，A.nigerG的616個氨基酸序列中，1-512殘基與G相一致3。到目前為

10、止已有多種糖化酶根據(jù)它的氨基酸序列推斷出它的DNA序列，并在工程菌株的構(gòu)建上得到廣泛的應(yīng)用。A.niger糖化酶和A.saitoi糖化酶中色氨酸殘基起著酶與底物結(jié)合的作用。不同來源的糖化酶最適結(jié)合位點的氨基酸序列具有5個高度同源片段(S1一S5)，但S5不具備催化活性。Boel等4首先從A.niger的染色體文庫中分離出糖化酶的基因，它含有5個內(nèi)含子，而A.awamori中含有4個內(nèi)含子。它們均含有第5個內(nèi)含子，這個長169bp序列參與G、G mRNA的加工過程。在含淀粉培養(yǎng)基上編碼A.awamori糖化酶的2.3kb mRNA成數(shù)百倍地增長，而在含木質(zhì)素培養(yǎng)基上則無此片段。用2.3kb糖化酶

11、特異性mRNA制備的cDNA探針，從A.awamori染色體文庫中篩選出了3.4kb的糖化酶基因，序列分析后推斷可能的氨基酸序列，結(jié)果證明與已知的A.awamori糖化酶和A.niger糖化酶的氨基酸序列一致。Toshihiko等構(gòu)建了水解生淀粉的Rhizopus oryzae糖化酶基因的物理圖譜。 糖化酶是糖苷水解酶（Glycoside hydrolase）的一種。一般糖苷水解酶由催化域、連接域及結(jié)合域組成。根據(jù)這5個結(jié)構(gòu)域的位置關(guān)系，真菌糖化酶屬于糖苷水解酶的第15族，以別于第13族的-淀粉酶及第14族的-淀粉酶。黑曲霉糖化酶有型（GA）和型（GA）2種類型。型糖化酶由3個功能區(qū)組成，即催

12、化域（Catalytic domain，CD）、淀粉結(jié)合域（Starch binding domain，SBD）及用于連接CD與SBD的O-糖基化連接域（O-glycosylation connected domain）。黑曲霉型糖化酶CD為N端的1470殘基，Mr為55000；SBD為C端的509616殘基，Mr為12000。GA經(jīng)過限制性水解可轉(zhuǎn)化為GA，GA缺少SBD，少數(shù)GA甚至缺少O-糖基化連接域。2.2催化域的結(jié)構(gòu)及催化機制 泡盛曲霉X100的糖化酶CD中含有13股-螺旋，除-螺旋外11均參與折疊成“桶”狀（/）6結(jié)構(gòu)，桶的核心為一個口袋結(jié)構(gòu)，催化中心位于其中，-螺旋1、3、5、7

13、、9和11位于桶狀結(jié)構(gòu)的表面，-螺旋2、4、6、8、10和13位于桶狀結(jié)構(gòu)的內(nèi)部。黑曲霉及子囊菌酵母糖化酶CD的構(gòu)型與泡盛曲霉X100的CD構(gòu)型基本相似，但子囊菌酵母CD含有X100股CD螺旋，其中的12股-螺旋形成與泡盛曲霉、黑曲霉CD類似（/）6結(jié)構(gòu)。Sauer5等認為黑曲霉糖化酶水解-1,4-糖苷鍵的機制是典型的酸堿催化，Glu179和Glu400分別為催化中心的質(zhì)子供體和質(zhì)子受體，Glu179提供的質(zhì)子傳遞給淀粉鏈中易斷裂鍵的糖苷氧上，形成含氧碳正離子，在Glu400 協(xié)助下接受水的親核攻擊而使糖苷鍵斷裂（圖1）。同時，使水解產(chǎn)生的-D（+）-葡萄糖變成-D（+）-構(gòu)型。圖1黑曲霉糖化

14、酶催化過程中的電子傳遞路徑2.3淀粉結(jié)合域的結(jié)構(gòu)及結(jié)合淀粉的分子機制糖苷水解酶的底物結(jié)合域，又稱多聚糖結(jié)合域（Polysaccharide binding domain，PBD）6，在不同的酶中，PBD有不同的名稱。在淀粉酶中，稱為淀粉結(jié)合域（Starch binding domain，SBD）。PBD對酶的功能有重要作用，如果PBD缺失，酶水解可溶性底物的速率不變，但水解非水溶性底物的速率大大降低，如GA（缺少SBD）水解非可溶性淀粉的速率只有GA的1/25。SBD上有2個結(jié)合位點（位點1和位點2），可同時結(jié)合2分子的底物。Sorimachi等以淀粉類似物-環(huán)式糊精（-cyclodextri

15、n，CD）為底物，發(fā)現(xiàn)CD的非極性面結(jié)合到位點1和位點2的特定氨基酸的芳香環(huán)上，且該2位點的氨基酸殘基是保守的。正常情況下淀粉顆粒中的淀粉鏈之間是相互平行的，而結(jié)合在SBD的2個位點上的2條淀粉鏈的方向幾乎是相互垂直的。由此可以推斷，SBD扭轉(zhuǎn)了淀粉鏈的方向，使更多的底物向催化域中心靠近。2.4連接域的結(jié)構(gòu) 糖化酶連接域起連接CD和SBD的作用，該結(jié)構(gòu)域一般被O-糖基化修飾6。來自不同真菌的糖化酶盡管催化域和SBD的氨基酸序列有較大相似性，但在O-糖基化區(qū)域上可變性較大。泡盛曲霉GA連接域的分子動力學(xué)模型指出，在生物活性條件下，甘露糖比半乳糖更容易以O(shè)-連接方式連接到連接域的Ser和Thr殘基

16、上，平均每個Ser和Thr殘基上連有5個甘露糖，在pH4.5、57條件下該結(jié)構(gòu)域的長度為9.5nm。3糖化酶的理化性質(zhì)3.1糖化酶的熱穩(wěn)定性和pH值穩(wěn)定性工業(yè)上應(yīng)用的糖化酶都是利用它的熱穩(wěn)定性，因為到目前為止還沒有理想的常溫水解生淀粉的糖化酶產(chǎn)品。篩選熱穩(wěn)定的糖化酶生產(chǎn)菌株是世界范圍的研究課題。Fogarty曾報道Aspergiluss niger IMDCC No.1203糖化酶活性最高溫度為70。A.niger糖化酶在NaBH3CN存在可以與高碘酸氧化葡萄糖T70結(jié)合，形成一種復(fù)合體，這種復(fù)合體比天然的酶更具熱穩(wěn)定性。70，18%麥芽糊精條件下，復(fù)合體的酶活可達到天然酶活的二倍。Fogar

17、ty認為肽鏈中的氨基基團通過改變氨基的功能，然后與氧化多糖結(jié)合，以增強它的熱穩(wěn)定性。-環(huán)狀糊精(10Ommol/L)在60下，可使糖化酶的穩(wěn)定性提高。但在低溫條件下(30和40)作用不明顯。和環(huán)狀糊精及其它糖類對糖化酶的穩(wěn)定性影響較小。-環(huán)狀糊精對酶的熱穩(wěn)定性影響的機理還有待進一步研究7。細菌產(chǎn)生的糖化酶耐高溫的性能優(yōu)于真菌，Ctosrridiu，rhermodro-sufurieum糖化酶是目前已報道的糖化酶中耐熱溫度最高的酶，在50%淀粉溶液中70下酶完全穩(wěn)定。即使在85下處理1h其酶活性仍能保持50%，而且這種酶不受Ca2+、EDTA和-、-、-環(huán)狀糊精的影響。一般糖化酶都具有較寬的pH

18、適應(yīng)范圍，但最適pH多為4.5-6.0。Fogartyl報道A.niger IMDC No.1203產(chǎn)生的糖化酶pH穩(wěn)定范圍2.011.0。Candida tsukubaensis糖化酶pH范圍2.4-4.8。3.2糖化酶的底物親和性糖化酶是將麥芽糖一糊精轉(zhuǎn)化為D-葡萄糖8，底物的水解速率主要受底物分子的大小及結(jié)構(gòu)的影響，同時也受水解碳鏈序列中下一個鍵的影響。A.niger糖化酶對淀粉、麥芽三糖和麥芽糖三種底物的相對親和性分別為100%、68%和31%。碳鏈越長親和性越大，它的最大反應(yīng)速度是隨著底物碳鏈的增長而增加的，呈線性變化。Fogartyl的研究表明糖化酶水解麥芽糖的能力是異麥芽糖的10

19、0倍。6-葡萄糖基麥芽糖的水解速率僅為麥芽糖的45%，這表明鄰近-1,4鏈的-l,6糖苷鍵比獨立的-1,6鏈更易被打開。4糖化酶在實際應(yīng)用中的問題及擬解決途徑盡管糖化酶在工業(yè)生產(chǎn)中價值很大，對其基礎(chǔ)與應(yīng)用研究也取得了長足進展，但仍有許多問題尚待解決。這些問題的存在嚴重影響著糖化酶的進一步開發(fā)，甚至成為發(fā)展的瓶頸。4.1水解-1,6-糖苷鍵的性能差 生產(chǎn)中使用的原料淀粉一般是直鏈淀粉和支鏈淀粉的混合物，由于其水解-1,6-糖苷鍵的性能差，因此產(chǎn)物中含有異麥芽糖（為葡萄糖二聚體，2個葡萄糖之間以-1,6-糖苷鍵相連），從而降低其產(chǎn)量及純度。解決這個問題的方法是添加高效水解-1,6-糖苷鍵的普魯蘭酶

20、，但實際使用中發(fā)現(xiàn)很難找到二者共同的最適pH值和溫度，因而使用這2種酶共同作用僅使葡萄糖產(chǎn)量從94.5%提高到95.5%，成效低微。大多數(shù)菌株來源的糖化酶水解-1,4-糖苷鍵的活力是水解-1,6-糖苷鍵活力的500-1000倍，但來自Hormoconis 的糖化酶水解-1,4-糖苷鍵的活力只比水解-1,6-糖苷鍵的高36倍9。結(jié)構(gòu)比較發(fā)現(xiàn)，糖化酶CD的回環(huán)3和回環(huán)5與大多數(shù)糖化酶的很不相同，改變回環(huán)3和回環(huán)5結(jié)構(gòu)，其重組酶的催化活力沒有降低，但降低了酶對糖苷鍵選擇的特異性。若單獨突變2個回環(huán)結(jié)構(gòu)中的一個，將會降低酶的水解活力。糖化酶這種性質(zhì)的改變，可以為我們擴展糖化工業(yè)的原料，如僅含-1,6-

21、糖苷鍵的寡聚異麥芽糖和潘糖，可以降低對底物的純度限制，提高葡萄糖產(chǎn)量，對工業(yè)生產(chǎn)有重要意義。4.2水解特異性低 糖化酶除能高效降解-1,4-糖苷鍵外，還可以以非常低的速率降解-1,2-、-1,3-、-1,6-糖苷鍵。作為其逆反應(yīng)，糖化酶也可以重新形成這些鍵，合成以-糖苷鍵相連的葡萄糖二聚體、三聚體及四聚體。淀粉在降解過程中需要相當(dāng)高的濃度（32%），其產(chǎn)物葡萄糖的濃度也非常高（最高達95%）。如此高濃度的葡萄糖使得其逆反應(yīng)加快，產(chǎn)生含-1,6-糖苷鍵的異麥芽糖。由此可見，提高糖化酶水解特異性，減弱糖化酶逆反應(yīng)可以通過基因工程的手段來實現(xiàn)。在生產(chǎn)中，解決這一問題的另一種方法是平衡酶的計量，控制反

22、應(yīng)溫度及反應(yīng)時間，因為在反應(yīng)后期，酶的熱不穩(wěn)定性導(dǎo)致酶活的喪失，使得逆反應(yīng)減弱10。4.3熱穩(wěn)定性不夠 在工業(yè)生產(chǎn)中，淀粉液化、糖化需要很高的溫度，但酶在長時間高溫條件下易失去活性，使反應(yīng)速率下降，因此人們正試圖通過各種方法降低淀粉液化和糖化溫度，同時通過生物學(xué)手段提高糖化酶的熱穩(wěn)定性。試驗發(fā)現(xiàn)催化域中的-螺旋1和2間的回環(huán)結(jié)構(gòu)對糖化酶熱穩(wěn)定性及底物選擇性影響很大，同時控制糖化酶不可逆熱敏性，防止糖化酶發(fā)生熱變性。研究指出該回環(huán)位于催化域的440-471殘基，是一段高度O-糖基化的區(qū)域。Liu11等通過定點誘變的方法改變其個別氨基酸殘基（其中一個氨基酸位于與熱敏有關(guān)的一段O-糖基化區(qū)域），增加

23、了催化域的熱穩(wěn)定性；替換部分催化域外圍回環(huán)區(qū)的一段易引起熱不穩(wěn)定的氨基酸殘基，拉近該結(jié)構(gòu)與剩余催化域的空間距離，維持酶的折疊狀態(tài)，可提高酶的熱穩(wěn)定性。同時，也有人利用定點突變技術(shù)取代其中的某個氨基酸，如-螺旋中的Gly或Asn-Gly序列中的Asn，均在一定程度上提高了酶的熱穩(wěn)定性。4.4pH穩(wěn)定性低 糖化酶對酸堿環(huán)境的適應(yīng)性取決于催化基團的解離，這種解離受微環(huán)境的影響。Fang12等認為泡盛曲霉和黑曲霉糖化酶Glu400的極性、電荷分布及與Glu400形成的氫鍵等影響著酶的最適pH值，他們利用定點突變技術(shù)將Ser411突變?yōu)镚ly411，去除了Ser411和Glu400之間的氫鍵，則提高了酶

24、的最適pH值。因此盡管目前的糖化酶對酸堿的適應(yīng)性較低，但通過酶學(xué)改造是可以改善的。4.5解決途徑 針對上述問題，解決的途徑也許很多，包括工業(yè)流程的改進等13。我們僅從酶結(jié)構(gòu)和功能的角度提出如下幾條途徑。繼續(xù)利用常規(guī)方法選育高產(chǎn)和高活力菌株 我國是糖化酶制劑的生產(chǎn)和消費大國，生產(chǎn)酶制劑的菌種豐富，研究隊伍強大且相對穩(wěn)定，常規(guī)的物理和化學(xué)方法成效顯著，不能忽略。加強基礎(chǔ)理論研究 從本質(zhì)上說，酶學(xué)特性是受其結(jié)構(gòu)決定的，因此，繼續(xù)加強糖化酶的基礎(chǔ)理論研究，如挖掘新的基因資源、闡明酶的結(jié)構(gòu)、了解基因的特性等，對改善糖化酶特性具有重要指導(dǎo)作用。將新的分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于菌株選育研究中 如定點突變技術(shù)、定向

25、進化技術(shù)等。常規(guī)的物理和化學(xué)選育方法盡管有一定成效，但周期長，且因突變范圍有限，難以大幅度提高酶的特性。定點突變能大幅度改善酶特性，但它是理性的，需要較強的結(jié)構(gòu)F功能方面的研究基礎(chǔ)，因此應(yīng)用上受到一定程度的限制。相反，定向進化是非理性的，它利用DNA重組或擴增過程中的錯誤配對使基因的堿基發(fā)生突變，再通過定向篩選在短時間內(nèi)獲得需要的新基因、新蛋白，甚至新物種，在改造酶活力、底物特異性、酶對環(huán)境的適應(yīng)性、蛋白功能等方面取得了明顯的效果，進化的酶分子特性與對照組相比提高了數(shù)百倍、甚至數(shù)千倍，最新的報道顯示利用此技術(shù)改造的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的催化效率提高了2.1×106倍，因此定向進化技術(shù)是高效

26、改造糖化酶特性的重要技術(shù)，將為糖化酶的研究提供更廣闊的空間。5糖化酶的應(yīng)用及研究現(xiàn)狀糖化酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用非常廣泛。在酒精工業(yè)中，糖化酶制劑可代替自制麩曲，簡化生產(chǎn)工藝，提高生產(chǎn)效率。在淀粉糖工業(yè)中，利用糖化酶水解淀粉的高度專一性，避免無機酸水解淀粉糖苷鍵的隨機性，控制糖漿產(chǎn)品的糖分組成，提高產(chǎn)品純度，克服酸水解時對生產(chǎn)設(shè)備的腐蝕14。在干啤酒釀造過程中，可提高麥汁中可發(fā)酵性糖的含量。在白酒和曲酒生產(chǎn)中，以糖化酶代替酒曲，可以提高出酒率，降低糧耗，改善酒的口味，提高質(zhì)量8:9。在味精、檸檬酸等生產(chǎn)過程中，首先利用淀粉酶、糖化酶將其主要原料淀粉轉(zhuǎn)化成低分子量糖類，再經(jīng)發(fā)酵得到谷氨酸和檸檬酸。因

27、此，糖化酶在輕工、食品、醫(yī)藥、發(fā)酵等行業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用價值，受到國內(nèi)外學(xué)者的高度重視。隨著研究的深入，對其酶學(xué)結(jié)構(gòu)、作用機理、結(jié)構(gòu)+功能相關(guān)性等問題有了一定的了解，同時有人將這些研究成果應(yīng)用于菌種選育中。本文在總結(jié)糖化酶有關(guān)研究成果基礎(chǔ)上，重點對其結(jié)構(gòu)+功能關(guān)系的研究進展做一綜述，并從這一角度出發(fā)，對當(dāng)前生產(chǎn)中存在的主要問題提出了擬解決途徑15。我國對糖化酶的研究已有很大進展，管漢成等從A.niger突變菌株中純化了水解生淀粉的Gl和即不為生淀粉吸咐又不水解生淀粉的G，并對其性質(zhì)進行了研究。方善康等也從A.niger中純化了三種組分的糖化酶，它們均為酸性糖蛋白。我們實驗室于1993年開展嗜熱

28、真菌的研究，并從Thermomyces Lanuginosus中純化了-淀粉酶及糖化酶。在熱和酸堿穩(wěn)定性上T. Lanuginosus糖化酶均優(yōu)于其它霉菌產(chǎn)生的糖化酶。以上研究對于深人了解糖化酶的作用機理，分析其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系是非常必要的。近年來國內(nèi)已開始借用分子生物學(xué)手段對糖化酶的基因克隆、轉(zhuǎn)化、表達進行了系列研究。唐國敏等從A.niger糖化酶高產(chǎn)菌株中克隆了全長的糖化酶cDNA，并進行了序列分析。隨后又將合成的糖化酶cDNA，經(jīng)5、3端改造，克隆到酵母質(zhì)粒YFD18上，轉(zhuǎn)化釀酒酵母，并能有效地分泌有功能的糖化酶到胞外，羅進賢等以噬菌體gt10DNA為載體，構(gòu)建了黑曲霉3758的cDNA

29、文庫，用編碼黑曲霉葡萄糖淀粉酶329-418位氨基酸的DNA序列(456bP)作為探針從所建的文庫中篩選出葡萄糖淀粉酶cDNA?？寺〉?.1kb片段含有5端非編碼區(qū)，編碼葡萄糖淀粉酶的結(jié)構(gòu)基因及3端的非編碼區(qū)。克隆的cDNA片段在表達載體又gt11中得到表達。另有將地衣芽抱桿菌-淀粉酶基因及黑曲霉糖化酶cDNA共同重組于大腸桿菌一酵母穿梭質(zhì)粒中，然后轉(zhuǎn)化釀酒酵母，在酵母MF-21因子及磷酸甘油酸激酶基因的啟動子和終止信號控制下，糖化酶能獲得高的表達，并向胞外分泌，重組質(zhì)粒具有良好的穩(wěn)定性。參考文獻1 DUO CHUAN LI,YI-JUN YANG,YOU-LIANG PENG.Purific

30、ation and characterization of extracellular glucoamylase from the thermophilic Thermomyces lanuginosusJ.Mycol.Res.1998,102(5):568-572.2 馬麗娜,陳喜文,甘睿,等. 葡萄糖淀粉酶的結(jié)構(gòu)和功能研究進展J.生物技術(shù)通訊,2005,16(6):677-682.3 Yong-Xiao Bai,Yan-Feng Li,Ming-Tao Wang.Study on synthesis of a hydrophilic bead carrier containing epox

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