基因工程法生產(chǎn)乙肝疫苗（課堂PPT）

1、.1基因工程法生產(chǎn)乙肝疫苗主講人：張俊班級:生物工程（1）班學(xué)號：201230141.2主講內(nèi)容l 乙肝疫苗研制的發(fā)展l目的基因的獲取lDNA的重組l基因的克隆l目的基因克隆的篩選l目的基因克隆的鑒定l基因的表達(dá)l綜述.3乙肝疫苗研制的發(fā)展 國際上先后研制出了第一代血源性乙肝疫苗和第二代基因工程乙肝疫苗。 第一代血源性乙肝疫苗主要運(yùn)用乙肝病毒攜帶者血清中提取純化出的的乙肝病毒表面抗原，先后經(jīng)過減毒處理和添加佐劑后注入人體預(yù)防接種。但是由于對血源性疫苗安全性存在顧慮，人們進(jìn)一步著手開發(fā)第二代乙肝疫苗，也就是基因重組疫苗。.4目的基因的獲取 獲得乙肝疫苗目的DNA片段的方法主要有兩種，一是直接從細(xì)

2、胞基因組中分離，二是人工合成。.5DNA的重組 將乙肝疫苗的DNA片段和載體在體外連接重組，成為重組DNA分子，多采用連接酶的方法連接。.6DNA的克隆 即將乙肝疫苗重組體DNA分子，引進(jìn)合適的宿主細(xì)胞(大腸桿菌、酵母)中增殖。根據(jù)所用載體的不同，可選用轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)。 轉(zhuǎn)染是以質(zhì)粒作載體時(shí)，重組體DNA分子以此種方式進(jìn)入感受態(tài)的宿主細(xì)胞，以獲得轉(zhuǎn)化子菌落。 轉(zhuǎn)染是以噬菌體作載體時(shí)，構(gòu)成的重組體DNA分子，以此種方式進(jìn)入宿主細(xì)胞，可轉(zhuǎn)染得到噬菌斑。 轉(zhuǎn)導(dǎo)是噬菌體DNA與外源DNA組成的重組體DNA分子，與噬菌體蛋白組裝成具有感染力的噬菌體顆粒，即人工包裝的噬菌體顆粒，引入宿主細(xì)胞的方法，往宿

3、主細(xì)胞引入重組體DNA分子。.7目的基因克隆的篩選 即從大量攜帶有乙肝疫苗的重組體DNA分子的細(xì)胞中分離出帶目的基因的細(xì)胞。因?yàn)椴皇撬械募?xì)胞都能獲得重組體DNA分子，為了獲得攝取了重組體DNA分子細(xì)胞，需經(jīng)篩選，才能將其與未攝取重組體DNA分子的細(xì)胞區(qū)別開來，并作進(jìn)一步鑒定。篩選含有重組體DNA分子細(xì)胞的方法，一般都是以載體DNA及目的基因的遺傳標(biāo)記及分子特征為依據(jù)，并結(jié)合受體細(xì)胞的基因表型而建立起來的。由于許多質(zhì)粒都具有抗生素等藥物的抗性標(biāo)記，因此，在含有一定濃度抗生素的選擇培養(yǎng)基上，可以很容易地把攝取了重組體DNA分子，因同時(shí)也獲得了抗生素抗性的細(xì)胞辨認(rèn)出來。但藥物篩選只是一個(gè)方面，依據(jù)

4、它只能判斷質(zhì)粒載體是否進(jìn)入了受體細(xì)胞，還不能確定受體細(xì)胞是否攝取了含有目的基因的重組體DNA分子。.8目的基因克隆鑒定 對于乙肝疫苗的重組體DNA分子的鑒別，通常是在抽提出重組質(zhì)粒DNA后，用凝膠電泳法或電鏡觀察其分子大小，用限制酶酶解，觀察其酶切圖譜進(jìn)行。還可采用菌落原位雜交法來進(jìn)行鑒定，即將菌落從最初生長的平板上轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，用堿裂解濾膜上的菌落，使DNA分子游離，變性，并固定在濾膜上，隨即用同位素標(biāo)記的與目的基因互補(bǔ)的DNA或RNA探針雜交，最后通過濾膜的放射自顯影鑒定菌落，并從最初生長的平皿上挑選出放射自顯影呈陽性的菌落。.9基因的表達(dá) 這是指宿主細(xì)胞在大量繁殖過程中外源DN

5、A在宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和翻譯，表達(dá)生成的產(chǎn)物(蛋白質(zhì))，最好在細(xì)胞內(nèi)不被分解，而分泌到細(xì)胞外面。表達(dá)產(chǎn)物若為較小的多肽，或是對細(xì)菌蛋白酶極為敏感的蛋白質(zhì)，形成后，通常即被迅速降解。為了保證外源基因表達(dá)產(chǎn)物能分泌到細(xì)胞外而不被降解，通?？梢园淹庠椿虿迦朐谳d體的某些結(jié)構(gòu)基因中間，在這種情況下，表達(dá)產(chǎn)物是融合蛋白質(zhì)，融合蛋白質(zhì)可以抵抗內(nèi)源蛋白酶的降解，又可以在細(xì)胞信號肽的引導(dǎo)下分泌到細(xì)胞外。最后，利用發(fā)酵工程培養(yǎng)重組與乙肝疫苗的工程菌.10綜述 綜上所述，用基因工程法生產(chǎn)乙肝疫苗要先經(jīng)過乙肝疫苗目的基因的獲取、DNA的重組基因的克隆、目的基因克隆的篩選、目的基因克隆的鑒定、基因的表達(dá)。最后還需通過培養(yǎng)工程菌、乙肝病毒表面