第12組激活沉默基因以獲取新型微生物次級代謝產(chǎn)物的策略研究

1、1組員：組員：季宗德季宗德 郭秋香郭秋香 張羨媛張羨媛 趙琪趙琪 激活沉默基因以獲取新型微生物次激活沉默基因以獲取新型微生物次級代謝產(chǎn)物的策略研究級代謝產(chǎn)物的策略研究2 根據(jù)根據(jù)2007 2007 年的統(tǒng)計，年的統(tǒng)計，198119812006 2006 年間國際上所有批準(zhǔn)年間國際上所有批準(zhǔn)的藥物中，超過的藥物中，超過 50%50%來源于天然產(chǎn)物、天然產(chǎn)物的衍生物或來源于天然產(chǎn)物、天然產(chǎn)物的衍生物或模擬天然產(chǎn)物藥效基團的合成化合物。模擬天然產(chǎn)物藥效基團的合成化合物。 尤其是，目前臨床尤其是，目前臨床上使用的上使用的 60%60%的抗癌藥物和的抗癌藥物和 70%70%的抗生素是天然產(chǎn)物或者基的抗生

2、素是天然產(chǎn)物或者基于天然產(chǎn)物研發(fā)的藥物于天然產(chǎn)物研發(fā)的藥物。 從微生物中發(fā)現(xiàn)和分離新型化合物是發(fā)展新型藥物的從微生物中發(fā)現(xiàn)和分離新型化合物是發(fā)展新型藥物的主要主要方向方向之一之一. 一直以來，天然產(chǎn)物在人類疾病的治療過程中發(fā)揮著重一直以來，天然產(chǎn)物在人類疾病的治療過程中發(fā)揮著重要作用。要作用。3非常值得思考的問題：非常值得思考的問題： 隨著大量微生物次級代謝產(chǎn)物的分離隨著大量微生物次級代謝產(chǎn)物的分離,從從自然界直接分離具有新結(jié)構(gòu)、新活性化合物自然界直接分離具有新結(jié)構(gòu)、新活性化合物變得越來越困難。變得越來越困難。 臨床上病原微生物的耐藥性日益嚴(yán)重，臨床上病原微生物的耐藥性日益嚴(yán)重，艾滋病、禽流感

3、等新型疾病不斷出現(xiàn)，我艾滋病、禽流感等新型疾病不斷出現(xiàn)，我們亟需新的研發(fā)策略發(fā)現(xiàn)新型天然藥物。們亟需新的研發(fā)策略發(fā)現(xiàn)新型天然藥物。4 隨著基因組測序技術(shù)隨著基因組測序技術(shù)的飛速發(fā)展和微生物基因的飛速發(fā)展和微生物基因組大規(guī)模測序的廣泛開展，組大規(guī)模測序的廣泛開展，目前已測定了超過目前已測定了超過580個個微生物的全基因組序列。微生物的全基因組序列。中國科學(xué)家更是于中國科學(xué)家更是于 2009 年年發(fā)起了發(fā)起了“萬種微生物基因組萬種微生物基因組”計劃，預(yù)計在計劃，預(yù)計在3年內(nèi)完成年內(nèi)完成1萬萬種微生物物種全基因組序列種微生物物種全基因組序列圖譜的構(gòu)建。圖譜的構(gòu)建。5 在常規(guī)培養(yǎng)條件下，大在常規(guī)培養(yǎng)條

4、件下，大多數(shù)生物合成基因簇不表多數(shù)生物合成基因簇不表達或以極低水平表達并在達或以極低水平表達并在特定條件下被激活而表達特定條件下被激活而表達活性產(chǎn)物，這些活性產(chǎn)物，這些DNADNA序列稱序列稱為為沉默生物合成基因簇沉默生物合成基因簇。 沉默生物合成基因簇包含了沉默生物合成基因簇包含了多種結(jié)構(gòu)類型的微生物次級代謝多種結(jié)構(gòu)類型的微生物次級代謝產(chǎn)物編碼信息產(chǎn)物編碼信息, , 提供了豐富的合提供了豐富的合成生物學(xué)天然元件或模塊成生物學(xué)天然元件或模塊, , 并為并為未來設(shè)計和構(gòu)建新型微生物次級未來設(shè)計和構(gòu)建新型微生物次級代謝產(chǎn)物生物合成途徑提供豐富代謝產(chǎn)物生物合成途徑提供豐富的物質(zhì)基礎(chǔ)。的物質(zhì)基礎(chǔ)。 因

5、此，如何利用現(xiàn)有的研究成果和技術(shù)手段進行激活沉默基因以獲取新型微生物天然產(chǎn)物已經(jīng)成為當(dāng)務(wù)之急.6沉默基因簇的異源表達沉默基因簇的異源表達 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控策略轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控策略 表觀遺傳調(diào)控策略表觀遺傳調(diào)控策略 41235核糖體工程策略核糖體工程策略 6宿主細胞的遺傳修飾改造宿主細胞的遺傳修飾改造 7單菌多次級代謝產(chǎn)物策略單菌多次級代謝產(chǎn)物策略7天然生產(chǎn)菌天然生產(chǎn)菌表達水平低表達水平低遺傳操作遺傳操作困難困難不容易規(guī)模不容易規(guī)模培養(yǎng)培養(yǎng) 不能應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)不能應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)生長緩慢生長緩慢沉默基因簇的異源表達沉默基因簇的異源表達 18 所謂基因的異源表達，就是將整個所謂基因的異源表達，就是將整個

6、沉默沉默合成基因簇合成基因簇克隆至質(zhì)粒、黏?；蛘呒毦斯と旧w上利用異源宿克隆至質(zhì)粒、黏?；蛘呒毦斯と旧w上利用異源宿主對其進行表達，然后利用相關(guān)的分析技術(shù)對含有該克主對其進行表達，然后利用相關(guān)的分析技術(shù)對含有該克隆的表達宿主以及對照宿主的發(fā)酵液上清或者提取物進隆的表達宿主以及對照宿主的發(fā)酵液上清或者提取物進行分析，最終對該代謝產(chǎn)物進行分離、純化和結(jié)構(gòu)鑒定。行分析，最終對該代謝產(chǎn)物進行分離、純化和結(jié)構(gòu)鑒定。9異源表達使得沉默基因在異源表達使得沉默基因在新的表達系統(tǒng)新的表達系統(tǒng)中無需按照原來的起始位點進行有效轉(zhuǎn)中無需按照原來的起始位點進行有效轉(zhuǎn)錄，對培養(yǎng)條件也無特殊要求錄，對培養(yǎng)條件也無特殊要

7、求，克服了天然生產(chǎn)菌表達，克服了天然生產(chǎn)菌表達 水平低、遺傳操作困難、水平低、遺傳操作困難、不容易規(guī)模培養(yǎng)等缺點，不容易規(guī)模培養(yǎng)等缺點，為工業(yè)化生產(chǎn)掃清障礙。另外，它還適用于生長緩慢為工業(yè)化生產(chǎn)掃清障礙。另外，它還適用于生長緩慢的微生物，的微生物，如藍細菌、真菌等如藍細菌、真菌等。由該法已發(fā)現(xiàn)多種新的生物活性物質(zhì)。由該法已發(fā)現(xiàn)多種新的生物活性物質(zhì)。10良好的異源表達宿主良好的異源表達宿主：鏈霉菌、大腸埃希菌、鏈霉菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、假單胞菌和黃色粘球菌枯草芽孢桿菌、假單胞菌和黃色粘球菌遺傳途徑遺傳途徑的轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移功能基因功能基因表達表達蛋白活性蛋白活性對宿主細對宿主細胞的影響胞的影響

8、實現(xiàn)天然產(chǎn)物異源表實現(xiàn)天然產(chǎn)物異源表達生物合成必須要解達生物合成必須要解決以下幾個問題。決以下幾個問題。11正調(diào)節(jié)基正調(diào)節(jié)基因進行組因進行組成型表達成型表達負調(diào)節(jié)基負調(diào)節(jié)基因的中斷因的中斷啟動子的啟動子的替換替換轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控策略調(diào)控策略轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控策略轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控策略 212正調(diào)節(jié)基因進行組成型表達和負調(diào)節(jié)基因的中斷沉默基因簇中含有的正調(diào)節(jié)基因沉默基因簇中含有的正調(diào)節(jié)基因和和負調(diào)節(jié)基因，控制次級代謝產(chǎn)物生物合負調(diào)節(jié)基因，控制次級代謝產(chǎn)物生物合成的開關(guān)。對成的開關(guān)。對正調(diào)節(jié)基因進行組成型表達正調(diào)節(jié)基因進行組成型表達或?qū)驅(qū)ω撜{(diào)節(jié)基因進行阻斷負調(diào)節(jié)基因進行阻斷, 可以可以激活激活沉默基因簇

9、沉默基因簇, 獲得微生物新型次級代謝產(chǎn)物。獲得微生物新型次級代謝產(chǎn)物。Laureti 等對生二素鏈霉菌的不轉(zhuǎn)錄表達的途徑特異性正調(diào)節(jié)基因samR0484進行組成型表達后，激活了沉默基因簇, 最終得到新型天然產(chǎn)物stambomycins，并可能成為抗腫瘤藥物開發(fā)的先導(dǎo)化合物。余貞等中斷變鉛青鏈霉菌的負調(diào)控基因nsdA，最終合成放線紫紅素。13啟動子的替換將可誘導(dǎo)的啟動子替換原有轉(zhuǎn)錄因子的天然啟動子，將可誘導(dǎo)的啟動子替換原有轉(zhuǎn)錄因子的天然啟動子，轉(zhuǎn)錄不再受原有的微生物控制，同時新的啟動子能夠轉(zhuǎn)錄不再受原有的微生物控制，同時新的啟動子能夠使轉(zhuǎn)錄因子高水平表達，反過來又激活整個使轉(zhuǎn)錄因子高水平表達，反

10、過來又激活整個沉默沉默基因基因簇的表達簇的表達。1414Chiang YM,Szewczyk E,Davidson AD,et al.A gene cluster containing two Chiang YM,Szewczyk E,Davidson AD,et al.A gene cluster containing two fungal polyketide synthases encodes the biosynthetic pathway for a fungal polyketide synthases encodes the biosynthetic pathway for a

11、polyketide,polyketide,asperfuranoneasperfuranone in in Aspergillus nidulansAspergillus nidulansJ. J Am Chem Soc.,2009,131(8):2965-J. J Am Chem Soc.,2009,131(8):2965-2970. 2970. 在適合于分子遺傳操作的微生物中，許多次級代謝生物在適合于分子遺傳操作的微生物中，許多次級代謝生物合成基因簇含有一個或者多個能夠控制整個基因簇轉(zhuǎn)錄合成基因簇含有一個或者多個能夠控制整個基因簇轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄因子。這種方法的優(yōu)點是產(chǎn)物是立即歸于目

12、標(biāo)基因簇和產(chǎn)量增加的潛這種方法的優(yōu)點是產(chǎn)物是立即歸于目標(biāo)基因簇和產(chǎn)量增加的潛能，但不適用于受翻譯后調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子和不包含轉(zhuǎn)錄因子的能，但不適用于受翻譯后調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子和不包含轉(zhuǎn)錄因子的基因?；?。14 通過染色體中染色體中DNA 序序列列不改變不改變DNA 甲基化甲基化組蛋白組蛋白修飾修飾染色體染色體重塑重塑非編碼非編碼 RNA通過表觀遺傳調(diào)控策略表觀遺傳調(diào)控策略 3將相關(guān)的染色質(zhì)構(gòu)型改變，激活將相關(guān)的染色質(zhì)構(gòu)型改變，激活沉默沉默基因的表達基因的表達1517 Henrikson JC,Hoover AR,Joyner PM,Cichewicz RH. A chemical 17 Henriks

13、on JC,Hoover AR,Joyner PM,Cichewicz RH. A chemical epigenetics approach for engineering the in situ biosynthesis of a epigenetics approach for engineering the in situ biosynthesis of a cryptic natural product from AspergillusnigerJ.cryptic natural product from AspergillusnigerJ.Organic Organic Biomo

14、lecular Chemistry,2009,7(3):435-438.組蛋白去乙?；附M蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶nygeroneA16核糖體工程是核糖體工程是指程通過對微生物次級代謝產(chǎn)物合成相關(guān)基因表達指程通過對微生物次級代謝產(chǎn)物合成相關(guān)基因表達的兩個重要元件的兩個重要元件核糖體或核糖體或RNA RNA 聚合酶聚合酶進行修飾和改進行修飾和改造，以抗造，以抗生素抗性突變?yōu)橥庠谔卣鳎蚱浜铣上嚓P(guān)基因中引入特定的點突生素抗性突變?yōu)橥庠谔卣?，向其合成相關(guān)基因中引入特定的點突變或缺失突變，核糖體結(jié)構(gòu)的改變引起蛋白合成能力的改變，進變或缺失突變，核糖體結(jié)構(gòu)的改變引起蛋白合成能力的改變，進而而激活沉默基因，激活沉

15、默基因，影響微生物次級代謝產(chǎn)物的合成影響微生物次級代謝產(chǎn)物的合成。其操作簡單，無需了解遺傳背景，易于與其他改良方法聯(lián)合使用而被廣泛引用。其操作簡單，無需了解遺傳背景，易于與其他改良方法聯(lián)合使用而被廣泛引用。核糖體是蛋白質(zhì)的合成機器核糖體是蛋白質(zhì)的合成機器, 也是細胞感知營養(yǎng)水平和對生長速率進行調(diào)控的重要位點。也是細胞感知營養(yǎng)水平和對生長速率進行調(diào)控的重要位點。在穩(wěn)定生長期在穩(wěn)定生長期, 與次級代謝產(chǎn)物生物合成相關(guān)基因的大量表達取決于此時核糖體的功能。與次級代謝產(chǎn)物生物合成相關(guān)基因的大量表達取決于此時核糖體的功能。因此核糖體突變因此核糖體突變( 包括核糖體蛋白和包括核糖體蛋白和 rRNA) 帶來

16、的蛋白合成能力的改變帶來的蛋白合成能力的改變, 對次級代謝產(chǎn)對次級代謝產(chǎn)物生物合成的影響必然是十分深刻的。物生物合成的影響必然是十分深刻的。4核糖體工程策略核糖體工程策略 175.5.核糖體工程策略核糖體工程策略24 Xu J, Wang Y, Xie SJ, et al. Streptomyces xiamenensis sp.nov., a novel actinomycete isolated from a mangrove sediment sampleJ.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology

17、, 2009, 59: 472- 476.夫西地酸抗性突變鏈霉素抗性突變利福平抗性突變new micreobial metabolites18激活沉默基因激活沉默基因簇有時還需要簇有時還需要宿主細胞提供宿主細胞提供合適的環(huán)境因合適的環(huán)境因素素, 因此對宿主因此對宿主細胞進行遺傳細胞進行遺傳修飾改造也是修飾改造也是必要的必要的對一些模式微生物對一些模式微生物的基因組的基因組 DNA 進進行規(guī)模化刪減行規(guī)?；瘎h減, 獲得獲得適用于合成生物學(xué)適用于合成生物學(xué)等研究的、含最小等研究的、含最小基因組或縮減基因基因組或縮減基因組的宿主細胞。組的宿主細胞。例如例如5 宿主細胞的遺傳修飾改造宿主細胞的遺傳修飾

18、改造27 Chou WK, Fanizza I, Uchiyama T, et al. Genome mining in Streptomyces avermitilis: cloning and characterization of SAV_76, the synthase for a new sesquiterpene, avermitilol J.J Am Chem Soc, 2010, 132: 88508851.19 單菌多次級代謝產(chǎn)物（單菌多次級代謝產(chǎn)物（one strain-many compounds，OSMAC）策略，是）策略，是通過通過改變培養(yǎng)培養(yǎng)基成分、通氣量及添加重金屬和酶抑制劑等發(fā)酵條件來獲取更多新型改變培養(yǎng)培養(yǎng)基成分、通氣量