第五節(jié)食品中維生素類的分析

1、第五節(jié) 食品中維生素類的分析測定 維生素（vitamin）的種類很多，按其溶解性質(zhì)可分為水溶性維生素和脂溶性維生素兩大類。 水溶性維生素有維生素B族和維生素C（抗壞血酸ascorbic acid ）。維生素B族包括：VB 1（硫胺素 thiamin）、VB 2（核黃素 riboflavin）、VB3（泛酸 pantothenic acid）、VB5（煙酸 niacin、尼克酰胺）、VB6（吡哆醇 pyridoxin）、VB7（生物素 biotin）、VB11（葉酸 folic acid）、VB12（鈷胺素）。脂溶性維生素有：VA（包括胡蘿卜素 carotene）、VD、VE、VK。一、水溶性維

2、生素類的測定（一）理化性質(zhì) 水溶性維生素都易溶于水，不溶于苯、乙醚、氯仿等大多數(shù)有機溶劑。在酸性介質(zhì)中很穩(wěn)定，加熱也不破壞；但在堿性介質(zhì)中不穩(wěn)定，易于分解，特別在加熱情況下，可大部或全部破壞。它們易受空氣、光、熱、酶、金屬離子等的影響，如維生素C對氧、銅離子敏感，易被氧化。 所以測定水溶性維生素一般都在酸性溶液中進行前處理。 （二）維生素B族的測定 維生素B1、B2通常采用稀鹽酸水解，或再經(jīng)淀粉酶、木瓜蛋白酶酶解，使結(jié)合態(tài)維生素游離出來，再進行提取。為了去除雜質(zhì)，可用活性人造浮石、硅鎂吸附劑等進行純化處理。1、維生素B1的測定 （1）硫色素熒光法：國標法。 原理：硫胺素在堿性鐵氰化鉀溶液中能被

3、氧化成一種強藍色熒光物質(zhì)噻嘧色素（硫色素）。硫色素在紫外線照射下，發(fā)出熒光，其強度與硫色素濃度成正比，也即與溶液中硫胺素含量成正比。 激發(fā)波長365nm；發(fā)射波長435nm。 樣品提?。簩τ谝话銟悠?、高蛋白樣品、淀粉質(zhì)樣品處理方法不同，如樣品中所含雜質(zhì)較多，可用柱層析法處理，使硫胺素與雜質(zhì)分離，然后以所得溶液作測定。操作過程：試樣勻漿或粉碎，稱樣于三角瓶中加稀鹽酸，放入高壓鍋中加熱水解加淀粉酶、蛋白酶酶解，過濾得提取液將提取液加入已準備好的鹽基交換柱中，過柱熱蒸餾水沖洗交換柱，去雜質(zhì)熱酸性氯化鉀過柱，收集濾液，即為試樣凈化液凈化液分別加入A、B兩個反應(yīng)瓶避光，A瓶中加入氫氧化鈉溶液，B瓶中加入

4、堿性鐵氰化鉀溶液，振搖15s加10mL正丁醇，同時振搖1.5min，靜置分層吸去下層堿性溶液，加無水硫酸鈉使溶液脫水上機測定。 （2）高效液相色譜法待測樣品 色譜方式 檢 測 器肉及肉制品 正相液相色譜 熒光檢測器米粉 反相鍵合相色譜 柱后衍生化后 熒光檢測器食品 離子交換色譜 紫外檢測器米及米制品 反相離子對色譜 紫外檢測器GBGBT5009.84-2003 食品中硫胺素(維生素B1)的測定.pdf 2、維生素B2的測定 國標第一法為熒光法，第二法為微生物法。 （1）熒光分光光度法 原理：樣品經(jīng)酸解、酶解處理使核黃素游離出來，用高錳酸鉀和過氧化氫氧化雜質(zhì)，再經(jīng)硅鎂吸附劑進行柱層析，吸附提取核

5、黃素，最后用洗脫液丙酮冰乙酸水洗脫并收集核黃素。VB2水溶液呈黃綠色熒光，在440nm的激發(fā)波長，525nm發(fā)射波長處可產(chǎn)生最大熒光強度。 測定谷物中VB2時最好在樣品酸解后，加入一定量的淀粉酶，在3540酶解15小時左右，這樣有利于結(jié)合型的VB2轉(zhuǎn)化成游離型的VB2 。 （2）高效液相色譜法待測樣品 色譜方式 檢 測 器食品 反相鍵合相色譜 熒光檢測器肉及肉制品 正相液相色譜 熒光檢測器蛋及奶制品 反相鍵合相色譜 紫外檢測器米及米制品 反相離子對色譜 紫外檢測器 3、維生素B5的測定 國標方法為微生物法。 （1）溴化氰比色法 VB5與溴化氰結(jié)合后可與對氨基苯乙酮（或其它芳香族胺）作用生成黃色

6、化合物，因而可在420nm波長處測定光密度，求出VB5的含量。 （2）氣相色譜法 煙酸分子具有羥基，不溶于有機溶劑，不能直接用氣相色譜法進行測定，但煙酸經(jīng)酯化轉(zhuǎn)變成煙酸乙酯或N2基煙酰胺之后，可以用氣相色譜法進行分離測定。 （3）高效液相色譜法 利用酸水解法提取VB5，經(jīng)高效液相色譜分離，測定。 4、維生素B6的測定 國標法為微生物法。 （1）熒光分析法 樣品經(jīng)硫酸加壓水解，采用CGS樹脂的柱層析分離，以氯化鉀的磷酸緩沖液洗脫。洗脫液在二氧化錳和乙醛酸鈉溶液存在下，可使VB6的混合物即吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺一次轉(zhuǎn)化為吡哆醛。吡哆醛在氰化鉀作用下生成強熒光物質(zhì)吡哆醛氰醇衍生物。在激發(fā)波長355n

7、m，發(fā)射波長434nm處，測定其熒光強度，就可計算出樣品中VB6的含量。 （2）氣相色譜法 VB6與七氟丁基咪唑反應(yīng)可生成揮發(fā)性的衍生物，該衍生物在氣相色譜中可以很好地分離。最低檢出限10ng。氣相色譜條件：電子捕獲檢測器；3%SE52，固定相Chromosorb WHPO （3）液相色譜法 樣品水解后上機測定。 C18柱熒光檢測器：激發(fā)波長290nm，發(fā)射波長395nm。 5、維生素B12的測定 （1）比色法 樣品用濃硫酸和高氯酸鉀消化后，樣品中的鈷與M吡啶聯(lián)腙生成鈷的紅色化合物，可以進行比色測定，再從鈷的含量換算成VB12的含量。注意：樣品中存在游離鈷離子將使測定結(jié)果偏高，可以預(yù)先用8羥基

8、奎寧氯仿溶液提取，分離除去。 （2）原子吸收分光光度法 維生素B12的分子中含有鈷離子，占VB12的4.35%，采用原子吸收分光光度法可以測定其鈷含量，再換算成VB12的含量。 樣品預(yù)處理： 樣品用VB12提取液（無水磷酸氫二鈉1.3g檸檬酸1.2g無水焦亞硫酸鈉1.0g加水至100ml）提取，濾液中加入EDTA，用氨水調(diào)pH至7，再加入活性炭，振搖，用無灰濾紙過濾，VB12被吸附在活性炭上，將活性炭連同濾紙一起在600下灰化完全，用硝酸將殘渣溶解，以原子吸收分光光度法測定鈷的含量。 從鈷換算為VB12的換算系數(shù)=22.99。GBGBT 5009.217-2008 保健食品中維生素B12的測定

9、.pdfGBGBT 5009.210-2008 食品中泛酸的測定.pdfGBGBT 5009.211-2008 食品中葉酸的測定.pdf文章高效液相色譜法測定蔬菜中B族維生素.pdf（三）維生素C的測定 在食品中VC有三種存在形式：還原型抗壞血酸（2H，氧化）脫氫型抗壞血酸 二酮古洛糖酸。 1、提取方法 食品中的維生素C通常采用草酸、草酸醋酸、偏磷酸醋酸溶液直接提取。在一定濃度的酸性介質(zhì)中，可以消除某些還原性雜質(zhì)對維生素C的破壞作用。草酸對維生素C有很好的穩(wěn)定性能；偏磷酸能沉淀蛋白質(zhì)，澄清提取液，適合于蛋白質(zhì)含量較高的樣品。2、還原型抗壞血酸的測定 （1）分光光度法 在乙酸溶液中，抗壞血酸與固

10、藍鹽B反應(yīng)生成黃色的草酰肼-2-羥基丁酰內(nèi)酯衍生物。在最大吸收波長420nm處測定吸光度，與標準系列比較定量。 非蛋白性樣品在乙酸溶液中提取，過濾后上清液供測定；蛋白性樣品需再加入乙酸鋅溶液和亞鐵氰化鉀溶液，沉淀蛋白質(zhì)。 （2）2,6二氯靛酚滴定法 還原型抗壞血酸可以還原染料2,6二氯靛酚。該染料在酸性溶液中呈粉紅色，被還原后成無色溶液。在終點時，過量的未被還原的染料在酸性溶液中呈粉紅色，因此，在滴定過程中當溶液從無色轉(zhuǎn)變成微紅色時，表示還原型抗壞血酸全部被氧化為脫氫抗壞血酸，此時即為滴定終點。3、總抗壞血酸的測定 （1）熒光法： 國標第一法。 樣品中還原型抗壞血酸經(jīng)活性炭氧化為脫氫抗壞血酸后

11、，與鄰苯二胺（OPDA）反應(yīng)生成有熒光的喹喔啉衍生物，其熒光強度與脫氫抗壞血酸的濃度在一定條件下成正比，以此測定食品中抗壞血酸和脫氫抗壞血酸的總量。 激發(fā)光波長338nm，發(fā)射波長420nm。 當食物中含有丙酮酸時，也與鄰苯二胺反應(yīng)生成一種熒光物質(zhì)，干擾測定。這時加入硼酸。硼酸與脫氫抗壞血酸結(jié)合生成硼酸脫氫抗壞血酸螯合物，此螯合物不能與鄰苯二胺反應(yīng)生成熒光物質(zhì)；而硼酸不與丙酮酸反應(yīng)，丙酮酸仍可發(fā)生上述反應(yīng)。因此，加入硼酸后測出的熒光值即為空白的熒光值。 注意事項： 試樣用偏磷酸-乙酸溶液提?。?活性炭加入量要適量，量過多，對抗壞血酸有吸附作用，使結(jié)果偏低； 空白氧化液中加入硼酸溶液后需在4 冰

12、箱中放置2-3h，使反應(yīng)完全，否則本底偏高。 （2）2,4二硝基苯肼比色法： 國標第二法。 樣品中VC用草酸提取，活性炭使提取液中還原型抗壞血酸氧化成為脫氫抗壞血酸，然后與2,4二硝基苯肼作用生成紅色的脎。在85硫酸溶液的脫水作用下，可轉(zhuǎn)變?yōu)榻奂t色的無水化合物雙-2,4二硝基苯。最大吸收波長500nm，吸光度與總抗壞血酸的總量成正比，進行定量分析。文章獼猴桃中維生素C的高效液相色譜分析.pdf二、脂溶性維生素類的分析測定（一）理化性質(zhì) 1、溶解性：不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯等有機溶劑。 2、耐酸堿性：維生素A、D對酸不穩(wěn)定，VE對酸穩(wěn)定。VA、D對堿穩(wěn)定，VE對堿不穩(wěn)定，

13、但在抗氧化劑存在下也能經(jīng)受堿的煮沸。 3、耐熱性、耐氧化性：VA、D、E耐熱性好；VA、E易氧化，光、熱能促進氧化；VD不易被氧化。 根據(jù)上述性質(zhì)，測定脂溶性維生素時，通常先用皂化法處理樣品，水洗去除類脂物。然后用有機溶劑提取脂溶性維生素（不皂化物），濃縮后溶于適當?shù)娜軇┲袦y定。為了防止氧化，常加入抗氧化劑。對于A、D、E共存的樣品，或雜質(zhì)含量高的樣品，在皂化提取后，還需進行層析分離。 操作在避光條件下進行。 （二）維生素A的測定 1、比色法 國標第二法。 維生素A在三氯甲烷中與三氯化銻作用，生成藍色化合物，在波長620nm處有特異吸收。 適用于維生素A含量較高的樣品。 該法的主要缺點是生成的

14、藍色絡(luò)合物的穩(wěn)定性差，比色測定必須在6s內(nèi)完成，否則藍色會迅速消退，造成極大誤差。 2、高效液相色譜法 國標第一法。 （1）原理： 試樣中的維生素A及維生素E經(jīng)皂化提取處理后，將其從不可皂化部分提取至有機溶劑中。用高效液相色譜C18反相柱將維生素A及維生素E分離，經(jīng)紫外檢測器檢測，并用內(nèi)標法定量測定。 內(nèi)標物：苯并e芘標準液 流動相：甲醇水（982） 紫外檢測器：波長300nm （2）樣品處理： 皂化：準確稱樣于皂化瓶中加無水乙醇，攪勻加抗壞血酸（抗氧化劑），加苯并e芘標準液（內(nèi)標物）加氫氧化鉀（11）于沸水浴回流30min，使皂化完全立即放入冰水中冷卻。 提?。涸砘镆迫敕忠郝┒芳右颐烟崛?/p>

15、去水層。 洗滌：用水洗乙醚層，至水層不顯堿性。 濃縮：將乙醚提取液脫水（經(jīng)無水硫酸鈉過濾）后移入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器的球形蒸發(fā)瓶中55 水浴中減壓蒸餾蒸發(fā)瓶中剩余2mL乙醚時，取下蒸發(fā)瓶，用氮氣吹干加乙醇溶解提取物離心，上清液供色譜分析。 （三）維生素E的測定 1、比色法 維生素E與FeCl3反應(yīng)，F(xiàn)e3+被還原成Fe2+，F(xiàn)e2+可與 聯(lián)氮苯發(fā)生顏色反應(yīng)，呈紅色，因此在520nm處測定吸光度，可定量測定樣品中VE的含量。 2、GC法 3、HPLC法維生素E測定的GC分析條件化合物 檢測器 固定相 檢測波長 內(nèi)標物生育酚 FID SE30 275nm 十六烷基 棕櫚酸酯生育酚 FID DB5 300nm

16、 膽甾烷膽固醇 （程序升溫，260 300）（四）胡蘿卜素的測定 1、高效液相色譜法 國標第一法。 試樣中的胡蘿卜素，用石油醚-丙酮（8020）混合液提取，提取液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上蒸發(fā)至干，殘渣用少量石油醚溶解，然后經(jīng)三氧化二鋁柱純化，收集洗脫液，用0.45m微孔濾膜過濾，濾液用C18反相柱進行HPLC分析。 流動相：甲醇乙腈（9010） 紫外檢測器：波長448nm 2、紙層析法 國標第二法。 試樣經(jīng)過皂化后，用石油醚提取食品中的胡蘿卜素及其他植物色素，以石油醚為展開劑進行紙層析，胡蘿卜素極性最小，移動速度最快，從而與其他色素分離，剪下含胡蘿卜素的區(qū)帶，洗脫后于450nm波長下定量測定。（五）維生

17、素D的測定1、比色法維生素D與三氯化銻在氯仿中產(chǎn)生橙黃色物質(zhì)，于500nm處定量測定。 2、HPLC法樣品經(jīng)過抽出脂肪、堿性皂化、乙醚抽提不皂化物以及經(jīng)過毛地黃皂苷硅藻土和皂土二次柱層析，將脂肪、VA和VE等干擾物除去，然后注入液相色譜儀中，用含0.7%乙醇的異辛烷為流動相，以紫外檢測器，波長254nm處進行測定，即可求出樣品中VD的含量。（六）維生素K的測定維生素K易分解，因此提取樣品中的VK不采用皂化方法，而采用有機溶劑直接提取。一般植物樣品經(jīng)干燥后，將其置于有機溶劑如乙醚、丙酮、石油醚中劇烈振搖，把VK抽提出來。動物組織樣品也要預(yù)先干燥，再用有機溶劑抽提。GC法主要用于VK3的測定。 目前測定VK1的常用方法為HPLC法。 高效液相色譜法測定維生素K1 維生素K1廣泛存在于綠色蔬菜中。 蔬菜中的維生素K1經(jīng)石油醚提取后，注入經(jīng)磷酸鹽