第四章 目的基因的制備、連接、導(dǎo)入與基因文庫的構(gòu)建

1、第四章第四章 目的基因的制備、連接、導(dǎo)入、篩選與基因文庫的構(gòu)建 目的基因與克隆載體的體外重組 重組載體引入受體細胞目的基因制備重組子的篩選基因文庫的構(gòu)建 基因工程或DNA重組技術(shù)三大用途的前提條件是從生物體基因組中分離克隆目的基因，目的基因獲得之后，或確定其表達調(diào)控機制和生物學功能，或建立高效表達系統(tǒng)，構(gòu)建具有經(jīng)濟價值的基因工程菌（細胞），或?qū)⒛康幕蛟隗w外進行必要的結(jié)構(gòu)功能修飾，然后輸回細胞內(nèi)改良生物體的遺傳性狀，包括人體基因治療。 一般來說，目的基因的克隆戰(zhàn)略分為兩大類：一類是構(gòu)建感興趣的生物個體的基因文庫，即將某生物體的全基因組分段克隆，然后建立合適的篩選模型從基因組文庫中挑出含有目的基

2、因的重組克??；另一類是利用PCR擴增技術(shù)甚至化學合成法體外直接合成目的基因，然后將之克隆表達。第一節(jié)第一節(jié) 目的基因的制備目的基因的制備目的基因設(shè)計需要考慮的問題目的基因設(shè)計需要考慮的問題基因的長度及引物的設(shè)計限制性酶切位點的去處與添加去除基因內(nèi)部正反向重復(fù)序列使用宿主偏愛的密碼子添加起始與終止密碼子添加表達所需特殊序列，如信號肽、調(diào)整閱讀框、核糖體結(jié)合位點等 PCR法 cDNA法 鳥槍法 化學合成法目的基因制備方法目的基因制備方法1 化學合成法化學合成法的基本戰(zhàn)略化學合成的單元操作DNA化學合成的用途1.1.1 全基因合成化學合成目的基因的前提條件是基因的DNA序列已知，有三種戰(zhàn)略：小片段粘

3、接法： 混合退火根據(jù)目的基因全序列，分別合成12-15堿基長的單鏈DNA小片段T4-DNA連接酶連接克隆入合適的載體 1.1 化學合成法的基本戰(zhàn)略補釘延長法： 混合退火根據(jù)目的基因兩條互補鏈全序列，分別合成12-15堿基長的單鏈DNA小片段以及20-30堿基長的單鏈DNA中片段T4-DNA連接酶連接克隆入合適的載體 Klenow酶聚合大片段酶促法： 混合退火根據(jù)目的基因的全序列，分別合成40-50堿基長的單鏈DNA片段T4-DNA連接酶連接克隆入合適的載體 Klenow酶聚合 上述三種方法各有利弊：化學合成DNA的單片段愈短，收率就愈高，但由于化學合成的份額較大，成本較高；在大片段酶促法合成目

4、的基因時，雖然化學合成的份額相對較小，成本較低，但大片段化學合成的收率極低，例如，每聚合一個單體的產(chǎn)物收率為95%則合成50個堿基長的DNA單鏈大片段的總收率只有7.7%1.1.2 探針等寡聚核苷酸合成 在某些情況下，往往只知道目的基因編碼產(chǎn)物的部分氨基酸序列，而基因序列未知，此時需要從已知的氨基酸序列推測為其編碼的DNA序列，然后合成探針，篩選由鳥槍法或cDNA法得到的重組子，最終獲得含有目的基因的目的重組子 由于大多數(shù)氨基酸擁有簡并密碼子，故在探針序列的設(shè)計時必須考慮下列問題：生物體對簡并密碼子的偏愛性，合成系列探針探針應(yīng)具有足夠的長度，通常在17-20個核苷酸之間探針內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)可能的互

5、補區(qū)域探針等寡聚核苷酸合成某段連續(xù)的氨基酸序列CysMetAsp Glu Met Lys Arg Asn Ile所有可能的DNA序列TGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATA C T GATG G G T T C CGA CGG CGT CGC設(shè)計的簡并探針序列TGTATGGACGAIATGATGTATGGATGAIATGATGCATGGACGAIATGATGCATGGATGAIATGA A G此外還可以參考各種生物體的EST數(shù)據(jù)庫進行傾向性簡并序列設(shè)計expressed sequence tag1.2 化學合成的單元操作 化學合成DNA的實質(zhì)是按照序列要求將脫氧核苷酸單體一個個接

6、上去，每接一個單體就是一個循環(huán)反應(yīng)，包括：基團保護、分離、縮合、分離、去保護五大操作單元。 從反應(yīng)機理上來講，DNA化學合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酸液三酯法；具體操作過程又有液相合成和固相合成兩種形式。前者操作繁瑣，基本上已淘汰；后者反應(yīng)中間物的分離程序簡便，DNA合成儀就是根據(jù)固相亞磷酸液三酯法原理設(shè)計的三氯乙酸三氯乙酸化學合成的單元操作OHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMeMeOHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMeMeHDMT： 二甲氧基三苯甲基激活縮合氧化脫取代基玻璃珠連接臂碘液碘液四唑四唑亞磷酰胺亞磷酰胺四唑活性中間體 脫保護基(一般

7、對A、C堿基采用苯甲?；Ｗo；G堿基用異丁?；Ｗo；T堿基不必保護；亞磷酸用腈乙基保護) 1.3 DNA化學合成的用途合成天然基因修飾改造基因 設(shè)計新型基因 制備探針、引物、接頭 如生長激素釋放抑制素基因、腦啡肽基因、胰島素基因、干擾素如組織型纖溶酶原激活劑基因、尿激酶原基因等 基因等2 PCR法 PCR（Polymerase Chain Reaction）法，又稱為聚合酶鏈反應(yīng)或PCR擴增技術(shù)，是一種高效快速的體外DNA聚合程序 使用PCR法克隆目的基因的前提條件是：已知待擴增目的基因或DNA片段兩側(cè)的序列，根據(jù)該序列化學合成聚合反應(yīng)必 需的雙引物 PCR法定向擴增目的基因的基本原理55目的

8、基因5變性加熱55引物退火55底物聚合5555加熱變性5555555555555555555555555退火 引物底物聚合加熱變性引物退火底物聚合123 由Taq DNA聚合酶擴增的PCR產(chǎn)物中，其3末端總是會帶有一個非模板依賴型的突出堿基，而且這個堿基幾乎總是A，因為Taq DNA聚合酶對dATP具有優(yōu)先聚合活性。由于該突出堿基的存在，克隆時即可以采取TdT末端加同聚尾的方法與載體拼接，也可以使用專門的T載體克隆 PCR克隆目的基因的基本程序55AATT55PCR擴增產(chǎn)物T 載體T7lacZ MCSoriApr3 cDNA法cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略cDNA法分離目的基因的基本程序cD

9、NA法法克隆目的基因的局限性cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略mDNAcDNA第一鏈的合成 5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 35ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 55ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 5cDNA第一鏈引物退火逆轉(zhuǎn)錄酶dNTPscDNA第二鏈的合成 煮沸NaOH自身引導(dǎo)法：獲得的雙鏈cDNA 5端會有幾對堿基缺失AAAAAAAAAAAAAA5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 5TTTTTTTTTTTTTTp 5TT

10、TTTTTTTTTTTTp 5AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTOH 3KlenowdNTPsS1cDNA第二鏈的合成 DNApol dNTPsRNaesH置換合成法：獲得的雙鏈cDNA 5端也會有幾對堿基缺失5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 5AAAAAAAAAAAAAAp 55S1 AAAATTTOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 55TTTTTTTTTTTTTTOH 3AAAAAAAAAAAAAA 55TTTTTTTTTTTTTT 33T4-DNA ligasecDNA第二鏈的合成 dCTPTdT引導(dǎo)合

11、成法：獲得的雙鏈cDNA 能保留完整的5端序列5ppp5G G AAAAAOH 3TTTTTp 53 HO5ppp5G G AAAAACCCCCCCOH 33 HOCCCCCCCTTTTTp 53 HOCCCCCCCTTTTTp 53 HOCCCCCCCTTTTTp 55 pGGGGGGG3 HOCCCCCCCTTTTTp 55 pGGGGGGGAAAAAOH 3NaOH退火KlenowdNTPscDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略雙鏈cDNA的克隆 雙鏈平頭的cDNA通?？梢允褂孟铝腥N方法克隆入載體中： 平頭末端直接與載體連接，但插入的片段無法回收 平頭兩端分別接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，

12、這樣重組分子可通過加熱局部變性和S1核酸酶處理回收插入片段加裝人工接頭引入酶切口，以便插入片段回收 cDNA法分離目的基因的基本程序完備分離程序 提取細胞總mRNA，合成總cDNA，將之全部克隆，然后借助于合適的篩選手段找到目的重組子 篩選時，若使用的是多拷貝載體，則采用菌落原位雜交法篩選；若使用的是表達型載體，則采用菌落免疫雜交法篩選 完備分離程序適用于mRNA分子數(shù)少的目的基因的克隆，如人胰島素基因、干擾素基因、凝血因子VIII基因等 cDNA法分離目的基因的基本程序特異分離程序 提取細胞總mRNA，瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目標mRNA，由此合成雙鏈cDNA，然后進行克隆 特異分離程序較適

13、用于mRNA豐度極高的目的基因克隆如血紅蛋白基因等 cDNA法分離目的基因的基本程序差異分離程序 利用兩組細胞mRNA種類的差異，分離克隆差異mRNA所對應(yīng)的cDNA，因而這種程序較適用于分離克隆新基因 例如：正常的大鼠FR3T3成纖維細胞中，有些新基因是不能自發(fā)表達的，需在多瘤病毒感染之后方可轉(zhuǎn)錄。任務(wù)是要分離克隆這些新基因，進而研究其生物學功能 差異分離程序 多瘤病毒感染的FR3T3細胞正常的FR3T3細胞總mRNA總mRNAcDNA雙鏈cDNA單鏈cDNA提取mRNA合成cDNA合成第二鏈克隆提取mRNA共價交聯(lián)上柱原位雜交病毒誘導(dǎo)表達的基因cDNA克隆cDNA法克隆目的基因的局限性并非

14、所有的mRNA分子都具有polyA結(jié)構(gòu) 細菌或原核生物的mRNA半衰期很短mRNA在細胞中含量少，對酶和堿極為敏感，分離純化困難僅限于克隆蛋白質(zhì)編碼基因 4 鳥槍法鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略鳥槍法操作的改進鳥槍法克隆目的基因的局限性鳥槍法克隆的基本戰(zhàn)略 隨機克隆供體細胞的全基因組DNA片段，然后通過快速有效的篩選程序從眾多克隆中分離出含有目的基因的目的重組子，進而獲得目的基因。鳥槍法適用于原核細菌目的基因的克隆分離 鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略染色體DNA的切斷 超聲波處理：片段長度均一，大小可控，平頭末端 全酶切： 片段長度不均一，粘性末端便于連接，但有可能使目的基因斷開， 大小不可控 部

15、分酶切： 片段長度可控，含有粘性末端，目的基因完整 與載體連接 如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇多拷貝克隆載體；如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測法篩選，則選擇表達型載體如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇大腸桿菌作為受體細胞；如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測法篩選，則選擇能使目的基因表達的受體細胞轉(zhuǎn)化受體細胞 篩選含有目的基因的目的重組子 菌落原位雜交法、基因產(chǎn)物功能檢測法（篩選模型的建立） 鳥槍法操作的改進使用這一改進方法的前提條件是：目的基因的酶切圖譜已知。如果已知目的基因兩端的酶切口，可用該酶處理染色體DNA，然后與載體拼接，這樣可以保證目的基

16、因的完整性，從而提高重組子中目的重組子的出現(xiàn)頻率 使用特征性限制性內(nèi)切酶切開染色體DNA 鳥槍法操作的改進例如，已知某目的基因位于1.8 kb的SalI片段中，將染色體DNA用SalI切開，瓊脂糖凝膠電泳分離，用刀片切下相當于1.6 - 2.0 kb大小區(qū)域內(nèi)的凝膠塊，從此凝膠塊中回收DNA片段，然后與載體進行拼接在連接前將DNA片段進行分級分離 2.0 kb1.6 kb1.8 kb鳥槍法操作的改進凍融法吸附法：膠回收試劑盒低融點膠回收法電洗脫法法凝膠DNA片段回收技術(shù) 鳥槍法克隆目的基因的局限性工作量較大，需要了解目的基因的背景知識不能獲得的最小長度的目的基因不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子

17、結(jié)構(gòu)第二節(jié)目的基因與克隆載體第二節(jié)目的基因與克隆載體的體外重組的體外重組粘性末端的連接（定向克隆法）平末端的連接同聚物加尾法加人工接頭連接法加DNA銜接物連接法PCR產(chǎn)物的連接一、粘性末端的連接一、粘性末端的連接DNA連接酶把相互連接酶把相互靠近的靠近的5端磷酸端磷酸與與3-OH連到一起連到一起單酶切、雙酶切單酶切、雙酶切粘性末端連接法粘性末端連接法定向克隆法定向克隆法優(yōu)點: (1)載體及目的基因末端不互補，不會自身環(huán)化；(2)定向插入目的基因。注意事項： (1)載體及目的基因需要電泳純化； (2)避免酶切不完全。（一）（一） 直接連接直接連接T4 DNA連接酶雖然能連接平末端，但效率很低，連

18、接酶雖然能連接平末端，但效率很低，只有粘性末端的只有粘性末端的110%。5 5 5 5 3 3 3 3 -OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5 3 -OH-PP-HO-5 3 二、平末端（二、平末端（blunt end）的連接）的連接（1）同聚加尾法）同聚加尾法 （二）（二） 人工加尾形成人工加尾形成 “粘性末端粘性末端” DNA末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶能在沒有模板的情況下給能在沒有模板的情況下給DNA的的3-OH端端加上脫氧核苷酸。加上脫氧核苷酸。 原理：原理：分別給載體和插入片斷加上分別給載體和插入片斷加上互補的互補的核苷酸。核苷酸。 加尾堿基互補加尾堿基互補同聚物加尾法同聚物加尾法末端脫

19、氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶缺點：缺點：優(yōu)點：優(yōu)點：能把任何片能把任何片段連接起來段連接起來操作繁瑣；操作繁瑣；外源片段難以回收外源片段難以回收；同聚物尾巴影響外源同聚物尾巴影響外源基因表達。基因表達。非酶切位點（2）銜接物（）銜接物（linker）連接）連接Linker：用化學合成法合成的一段用化學合成法合成的一段10-12bp的，具有一個或數(shù)的，具有一個或數(shù)個限制性內(nèi)切酶識別位點的個限制性內(nèi)切酶識別位點的平末端雙鏈寡核苷酸平末端雙鏈寡核苷酸GGAATTCC CCTTAAGGEcoR I linker：（二）（二） 人工加尾形成人工加尾形成 “粘性末端粘性末端” （1）多核苷酸激酶處理）多核苷酸激酶處理（

20、2）T4連接酶連接連接酶連接（3）限制性內(nèi)切酶消化）限制性內(nèi)切酶消化（4）目的片段與載體連接）目的片段與載體連接加人工接頭連接法加人工接頭連接法優(yōu)點：兼具同聚物加尾法和粘性末端連接法的優(yōu)點；缺點：待克隆外源基因不能含有人工接頭相同的酶切位點。人工接頭DNA片段（二）（二） 人工加尾形成人工加尾形成 “粘性末端粘性末端” DNA接頭接頭 （adapter）連接法）連接法 adapter一頭平末端、另一頭粘性末端（某種酶切位點序列）一頭平末端、另一頭粘性末端（某種酶切位點序列）Blunt-ended DNA5p-GATCCCGG-OH3 3HO-GGCC-p5 BamHI adapterP-P5p

21、-GATCCCGG- GGCC-CCGG -GGCCCTAG-P5 人工合成的寡鏈核苷酸加加DNA銜接物連接法銜接物連接法人工合成的寡鏈核苷酸含有粘性末端，因此需要防止其自身環(huán)化，通過在其粘性的5末端進行脫磷酸修飾，使之彼此間無法連接。多核苷酸激酶接頭與接頭以粘末端連接，影響與接頭與接頭以粘末端連接，影響與DNA片段的連接片段的連接 優(yōu)點：優(yōu)點：連上后就能用。連上后就能用。 缺點：缺點：先用小牛腸先用小牛腸堿性磷酸酶堿性磷酸酶（CIP）處理接頭，水解掉其）處理接頭，水解掉其5端的磷酸，防止自我連接。端的磷酸，防止自我連接。 防止自我連接防止自我連接5p-GATCCCGG- GGCC-CCGG

22、GGCCCTAG-p5 Blunt-ended DNA5p-GATCCCGG-3 GGCC-p5 BamHI adapterP-P 5HO-GATCCCGG- GGCC CCGG -GGCCCTAG-OH5 5HO-GATCCCGG3 GGCC-OH5 nick缺口缺口nick缺口缺口HO-OHCIP處理處理T4 ligase雖然有缺口，但仍然能與雖然有缺口，但仍然能與DNA片斷連接片斷連接T4多核苷酸激酶處理使多核苷酸激酶處理使5磷酸化磷酸化三、三、PCR產(chǎn)物的連接產(chǎn)物的連接1.1.在引物的在引物的55端設(shè)計酶切位點端設(shè)計酶切位點符合載體的多克隆位點；符合載體的多克隆位點；（1 1）設(shè)計原則

23、）設(shè)計原則（2 2）帶酶切位點的引物的結(jié)構(gòu)）帶酶切位點的引物的結(jié)構(gòu)33端端151520bp20bp與模板互補；與模板互補； 55端內(nèi)切酶識別序列端內(nèi)切酶識別序列保護堿基保護堿基避免與所擴增的避免與所擴增的DNADNA片斷內(nèi)部酶切位點重復(fù)。片斷內(nèi)部酶切位點重復(fù)。三、三、PCR產(chǎn)物的連接產(chǎn)物的連接1.1.在引物的在引物的55端設(shè)計酶切位點端設(shè)計酶切位點請設(shè)計一對請設(shè)計一對PCR引物，在引物，在N端和端和C端分別加一個端分別加一個EcoRI（GAATTC，保，保護堿基護堿基GCA）和）和BamHI酶切位點（酶切位點（GGATCC，保護堿基，保護堿基CGC），另外），另外，各含有，各含有18個同該基因

24、同源的核苷酸，能夠用于擴增該基因的編碼序個同該基因同源的核苷酸，能夠用于擴增該基因的編碼序列。寫出列。寫出P1和和P2的引物序列。的引物序列。 帶酶切位點的帶酶切位點的PCR產(chǎn)物產(chǎn)物GCAGAATTC PCR產(chǎn)物產(chǎn)物5-3 CCTAGGCGC PCR產(chǎn)物產(chǎn)物-5 3- CGTCTTAAGGGATCCGCGEcoR I位點位點BamH I位點位點AATTC PCR產(chǎn)物產(chǎn)物5-3 CCTAG PCR產(chǎn)物產(chǎn)物-5 3- GGEcoR I BamH I兩頭各有一個粘性末端！兩頭各有一個粘性末端！AAdNTPTTdTTPTaq DNA聚合酶聚合酶載體載體PCR產(chǎn)物產(chǎn)物TATA三、三、PCR產(chǎn)物的連接產(chǎn)物

25、的連接2. 2. 與與T T載體直接連接載體直接連接3、Gateway 載體構(gòu)建系統(tǒng)載體構(gòu)建系統(tǒng) 噬菌體位點特異性重組系統(tǒng)；噬菌體位點特異性重組系統(tǒng)；高效的實現(xiàn)高效的實現(xiàn)DNA序列在多種載體系統(tǒng)的轉(zhuǎn)移。序列在多種載體系統(tǒng)的轉(zhuǎn)移。入門克隆入門克隆改造過的各種表達載體改造過的各種表達載體第三節(jié) 重組載體引入受體細胞物理法：基因槍法、電擊法、超聲法、顯微注射法、激光微束法化學法： PEG法，脂質(zhì)包埋法、磷酸鈣、DEAE-葡萄糖等介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)染法載體介導(dǎo)法載體介導(dǎo)法：質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化介導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)、病毒介導(dǎo)法一、重組一、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌導(dǎo)入大腸桿菌（一）轉(zhuǎn)化（一）轉(zhuǎn)化（transformatio

26、n）大腸桿菌捕獲大腸桿菌捕獲質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的過程。的過程。（三）轉(zhuǎn)染（三）轉(zhuǎn)染（transfection）受體菌直接捕獲受體菌直接捕獲噬菌體噬菌體DNA的過程。的過程。（二）轉(zhuǎn)導(dǎo)（二）轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）借助借助噬菌體噬菌體把外源把外源DNA導(dǎo)入細菌的過程。導(dǎo)入細菌的過程。（一）轉(zhuǎn)化（一）轉(zhuǎn)化（transformation）（1）熱激法（）熱激法（heat shock）（2）電轉(zhuǎn)化法（）電轉(zhuǎn)化法（electronporation）（3）PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化（4）接合轉(zhuǎn)化）接合轉(zhuǎn)化制備感受態(tài)細胞制備感受態(tài)細胞增加受體菌細胞膜的通透性增加受體菌細胞膜的通透性（1）

27、熱激法）熱激法感受態(tài)細胞：感受態(tài)細胞：處于能吸處于能吸收外源收外源DNA分子的生理分子的生理狀態(tài)的細胞狀態(tài)的細胞制備感受態(tài)細胞制備感受態(tài)細胞1、將處于對數(shù)生長期的細菌置于、將處于對數(shù)生長期的細菌置于0的的CaCl2低滲溶液中，細低滲溶液中，細胞膨脹成球形，處于感受態(tài)；胞膨脹成球形，處于感受態(tài)；2、將感受態(tài)細胞與、將感受態(tài)細胞與DNA混合，混合，Ca2+與與DNA結(jié)合形成抗結(jié)合形成抗DNase的羥基的羥基-磷酸鈣復(fù)合物，粘附于細胞表面；磷酸鈣復(fù)合物，粘附于細胞表面；3、經(jīng)、經(jīng)42短時間熱激處理，細胞吸收短時間熱激處理，細胞吸收DNA復(fù)合物；復(fù)合物；4、在培養(yǎng)基中生長數(shù)小時之后，球形細胞復(fù)原并增殖

28、。、在培養(yǎng)基中生長數(shù)小時之后，球形細胞復(fù)原并增殖。 10ng載體載體DNA100 L感受態(tài)細胞感受態(tài)細胞冰浴冰浴30min42 12min加入加入1mL LB培養(yǎng)基培養(yǎng)基（Amp-）37振蕩培養(yǎng)振蕩培養(yǎng)1h10-100 L轉(zhuǎn)化液轉(zhuǎn)化液涂涂Amp平板平板吸附吸附DNA攝入攝入DNA操作步驟：操作步驟：（p140）轉(zhuǎn)化率：轉(zhuǎn)化率：106-108/ g DNA（2）電轉(zhuǎn)化法）電轉(zhuǎn)化法原理：原理：在高壓脈沖下，細菌細胞表面形成暫時在高壓脈沖下，細菌細胞表面形成暫時性微孔，重組性微孔，重組DNA通過微孔進入細胞后，脈沖結(jié)通過微孔進入細胞后，脈沖結(jié)束，細胞恢復(fù)原狀。束，細胞恢復(fù)原狀。實驗簡單，實驗簡單，不

29、需要制備特殊的感受態(tài)細胞不需要制備特殊的感受態(tài)細胞 “感受態(tài)感受態(tài)”：清洗處理，在低溫下使細胞處于：清洗處理，在低溫下使細胞處于無離子區(qū)且有甘油或蔗糖等保護劑的懸液中，保證無離子區(qū)且有甘油或蔗糖等保護劑的懸液中，保證電擊過程中細胞不被擊穿而死亡。電擊過程中細胞不被擊穿而死亡。轉(zhuǎn)化率：轉(zhuǎn)化率：1091010/ g DNA（二）（二） 轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)由噬菌體和細胞病毒介導(dǎo)的遺傳信息的轉(zhuǎn)移過程由噬菌體和細胞病毒介導(dǎo)的遺傳信息的轉(zhuǎn)移過程（三）（三） 轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染噬菌體噬菌體DNA不經(jīng)過蛋白包裝成病毒顆粒，直接不經(jīng)過蛋白包裝成病毒顆粒，直接被感受態(tài)細胞捕獲的過程。被感受態(tài)細胞捕獲的過程。與轉(zhuǎn)化無本質(zhì)區(qū)別與轉(zhuǎn)化無本

30、質(zhì)區(qū)別體外包裝好的重組噬菌體感染受體菌，形成噬菌斑。體外包裝好的重組噬菌體感染受體菌，形成噬菌斑。每每 g DNA能形成能形成106個噬菌斑個噬菌斑 現(xiàn)在把現(xiàn)在把DNA轉(zhuǎn)移至動物細胞的過程也稱轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)移至動物細胞的過程也稱轉(zhuǎn)染 體外包裝過程 病毒載體介導(dǎo)法病毒載體介導(dǎo)法: : Fosmid載體的連接、重組與導(dǎo)入（一）導(dǎo)入酵母細胞（一）導(dǎo)入酵母細胞1.1. 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化2.2. 堿金屬離子介導(dǎo)的完整細胞轉(zhuǎn)化堿金屬離子介導(dǎo)的完整細胞轉(zhuǎn)化3.3. PEG1000PEG1000轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化法4.4. 電擊法電擊法（二）導(dǎo)入植物細胞（二）導(dǎo)入植物細胞（三）導(dǎo)入動物細胞（三）導(dǎo)入動物細胞1. 利用

31、原生質(zhì)體進行轉(zhuǎn)化利用原生質(zhì)體進行轉(zhuǎn)化 酵母酵母原生質(zhì)體原生質(zhì)體感受態(tài)感受態(tài)酶去壁酶去壁CaCl2 PEG插入外源基因的載體插入外源基因的載體共轉(zhuǎn)化：共轉(zhuǎn)化：將兩個以上的基因同時導(dǎo)入感受態(tài)細胞的方法將兩個以上的基因同時導(dǎo)入感受態(tài)細胞的方法轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化細胞達原生質(zhì)體總數(shù)的轉(zhuǎn)化細胞達原生質(zhì)體總數(shù)的1%2%，轉(zhuǎn)化率受再生率影響，轉(zhuǎn)化率受再生率影響共轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體占轉(zhuǎn)化子總數(shù)的共轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體占轉(zhuǎn)化子總數(shù)的25%33% 酵母酵母0.1mol/L LiCl處理處理感受態(tài)感受態(tài)2. 堿金屬離子介導(dǎo)的完整細胞轉(zhuǎn)化插入外源基因的載體插入外源基因的載體40% PEG 4000熱激熱激涂布選擇性平板，篩選轉(zhuǎn)化子涂布

32、選擇性平板，篩選轉(zhuǎn)化子 吸收線性吸收線性DNA能力明顯大于環(huán)狀能力明顯大于環(huán)狀DNA，兩者相差，兩者相差80倍倍轉(zhuǎn)化率：轉(zhuǎn)化率：103個個 / g DNA；共轉(zhuǎn)化現(xiàn)象極少共轉(zhuǎn)化現(xiàn)象極少4. 電擊轉(zhuǎn)化（1）適于原生質(zhì)體和完整細胞）適于原生質(zhì)體和完整細胞（2）轉(zhuǎn)化率高，）轉(zhuǎn)化率高，105個個 / g DNA（3）單鏈轉(zhuǎn)化率高于雙鏈）單鏈轉(zhuǎn)化率高于雙鏈3. PEG1000轉(zhuǎn)化PEG處理酵母細胞，可獲得類感受態(tài)，用于轉(zhuǎn)化處理酵母細胞，可獲得類感受態(tài)，用于轉(zhuǎn)化PEG法將外源基因融合進入宿主電擊法將外源基因?qū)胨拗鳎ㄒ唬?dǎo)入酵母細胞（一）導(dǎo)入酵母細胞1.1. 載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化（農(nóng)桿菌介導(dǎo)）載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化（農(nóng)

33、桿菌介導(dǎo)）2.2. DNADNA直接導(dǎo)入（基因搶法、電擊法等）直接導(dǎo)入（基因搶法、電擊法等）3.3. 種質(zhì)系統(tǒng)法（花粉管通道法等）種質(zhì)系統(tǒng)法（花粉管通道法等）（二）導(dǎo)入植物細胞（二）導(dǎo)入植物細胞（三）導(dǎo)入動物細胞（三）導(dǎo)入動物細胞（二）導(dǎo)入植物細胞1. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒遺傳轉(zhuǎn)化方法質(zhì)粒遺傳轉(zhuǎn)化方法將目的基因插入到載體將目的基因插入到載體的的T-DNA區(qū)，形成重組區(qū)，形成重組DNA（二）導(dǎo)入植物細胞1. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒遺傳轉(zhuǎn)化方法質(zhì)粒遺傳轉(zhuǎn)化方法將重組將重組DNA轉(zhuǎn)入含有轉(zhuǎn)入含有Vir致病基因的農(nóng)桿菌致病基因的農(nóng)桿菌（二）導(dǎo)入植物細胞1. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)

34、的Ti質(zhì)粒遺傳轉(zhuǎn)化方法質(zhì)粒遺傳轉(zhuǎn)化方法通過農(nóng)桿菌侵染通過農(nóng)桿菌侵染植物外植體植物外植體（二）導(dǎo)入植物細胞1. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒遺傳轉(zhuǎn)化方法質(zhì)粒遺傳轉(zhuǎn)化方法將含有外源目的基因的將含有外源目的基因的T-DNA整合到植物細胞基因整合到植物細胞基因組中，獲得轉(zhuǎn)基因植株組中，獲得轉(zhuǎn)基因植株在飼養(yǎng)平皿的濾在飼養(yǎng)平皿的濾紙上培養(yǎng)紙上培養(yǎng)2天天葉盤法的具體操作 T-DNA的染色體整合機制的染色體整合機制農(nóng)桿菌介導(dǎo)法農(nóng)桿菌介導(dǎo)法大腸桿菌質(zhì)粒大腸桿菌篩選標記農(nóng)桿菌篩選標記多克隆位點重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌農(nóng)桿菌細菌接合T-DNA區(qū)同源整合農(nóng)桿菌感染植物根部細胞T-DNA區(qū)整合在植物細胞基因組上共整合轉(zhuǎn)

35、化程序共整合轉(zhuǎn)化程序LBRBT-DNA外源基因植物細胞篩選標記 Kmr大腸桿菌-農(nóng)桿菌穿梭質(zhì)粒大腸桿菌篩選標記農(nóng)桿菌篩選標記農(nóng)桿菌ori大腸桿菌ori二元整合轉(zhuǎn)化程序二元整合轉(zhuǎn)化程序又稱生物彈擊法、微彈轟擊法，借助高速金屬微又稱生物彈擊法、微彈轟擊法，借助高速金屬微粒將粒將DNA分子引入活細胞的轉(zhuǎn)化技術(shù)。分子引入活細胞的轉(zhuǎn)化技術(shù)。DNA1.2 m鎢彈頭鎢彈頭 吸附吸附金屬微粒加速，進入受體細胞金屬微粒加速，進入受體細胞基因槍基因槍裝入裝入2. 基因槍法（gene gun） 外植體制備外植體制備轟擊轟擊外植體培養(yǎng)及選擇外植體培養(yǎng)及選擇具體操作 1. DNA微彈的制備2. 外植體的制備3. DNA

36、微彈轟擊植物細胞植物細胞原生質(zhì)體原生質(zhì)體纖維素酶纖維素酶和果膠酶和果膠酶DNA混合入混合入電擊緩沖液電擊緩沖液電擊處理電擊處理愈傷組織愈傷組織幼苗幼苗分化分化3. 電擊法（電穿孔法）選擇培養(yǎng)選擇培養(yǎng)（一）導(dǎo)入酵母細胞（一）導(dǎo)入酵母細胞1. 1. 磷酸鈣沉淀法磷酸鈣沉淀法2. 2. 脂質(zhì)體介導(dǎo)法脂質(zhì)體介導(dǎo)法3. 3. 顯微注射法顯微注射法4. DEAE-4. DEAE-葡萄糖轉(zhuǎn)染法葡萄糖轉(zhuǎn)染法（二）導(dǎo)入植物細胞（二）導(dǎo)入植物細胞（三）導(dǎo)入動物細胞（三）導(dǎo)入動物細胞原理：原理：（三）導(dǎo)入動物細胞1. 磷酸鈣沉淀法磷酸鈣沉淀法通過磷酸鈣通過磷酸鈣-DNA共沉淀，將外源基因?qū)牍渤恋?，將外源基因?qū)氩?/p>

37、乳動物細胞哺乳動物細胞依據(jù)不同的細胞類型，平皿上最多能有依據(jù)不同的細胞類型，平皿上最多能有10%的細胞能吸收的細胞能吸收DNA沉淀。沉淀。操作簡便，成本低廉、可大批量轉(zhuǎn)染、對細胞毒性小、操作簡便，成本低廉、可大批量轉(zhuǎn)染、對細胞毒性小、效果穩(wěn)定，但效果穩(wěn)定，但轉(zhuǎn)染效率低轉(zhuǎn)染效率低。2. 脂質(zhì)體介導(dǎo)法脂質(zhì)體包埋脂質(zhì)體包埋DNA，通過細胞膜進入細胞。，通過細胞膜進入細胞。應(yīng)用玻璃顯微注射器，直接把外源應(yīng)用玻璃顯微注射器，直接把外源DNA注射到宿主注射到宿主細胞核里，使其整合到染色體上。細胞核里，使其整合到染色體上。3. 顯微注射法1）外源基因制備：線性化的質(zhì)?；蚰康钠危┩庠椿蛑苽洌壕€性化的質(zhì)粒或

38、目的片段2）收集受精卵：受孕后幾小時內(nèi)）收集受精卵：受孕后幾小時內(nèi)3）顯微注射：將外源基因注入受精卵的）顯微注射：將外源基因注入受精卵的雄原核雄原核4）受精卵移植）受精卵移植二乙氨乙基（二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖為多聚陽離子試劑，能）葡聚糖為多聚陽離子試劑，能促進哺乳動物細胞攝入外源促進哺乳動物細胞攝入外源DNA。4. DEAE-葡萄糖轉(zhuǎn)染法葡聚糖葡聚糖葡聚糖葡聚糖DEAE-dextran外源外源DNA細胞細胞混合混合DEAE-dextran對細胞有毒對細胞有毒，常采用低濃度長時間處理，常采用低濃度長時間處理吸附到細胞表面后被細胞吞入，部分吸附到細胞表面后被細胞吞入，部分DNA可以進入可以進

39、入到細胞核里。到細胞核里。4. DEAE-葡萄糖轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)化率（轉(zhuǎn)化率（cfu / gDNA）：每微克重組每微克重組DNA轉(zhuǎn)化后，接轉(zhuǎn)化后，接納納DNA分子的受體細胞的個數(shù)，即陽性克隆數(shù)。分子的受體細胞的個數(shù)，即陽性克隆數(shù)。（一）轉(zhuǎn)化率的計算：（一）轉(zhuǎn)化率的計算：轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率 產(chǎn)生菌落的總數(shù)產(chǎn)生菌落的總數(shù) / DNA的加入量的加入量 例：取例：取1l（0.1 ng/l）完整的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化）完整的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化100l的感受態(tài)的感受態(tài)細胞。向轉(zhuǎn)化反應(yīng)液中加入細胞。向轉(zhuǎn)化反應(yīng)液中加入900l培養(yǎng)液，讓細菌恢復(fù)培養(yǎng)液，讓細菌恢復(fù)一小段時間，取一小段時間，取100l鋪板。培養(yǎng)過夜，產(chǎn)生鋪板。培養(yǎng)過夜，產(chǎn)生1000

40、個菌個菌落，轉(zhuǎn)化率為多少？落，轉(zhuǎn)化率為多少？轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率1000 / 0.01 ng DNA = 108 cfu /g 例：某一例：某一DNA重組實驗的重組率為重組實驗的重組率為20%，轉(zhuǎn)化率為，轉(zhuǎn)化率為107 cfu / mg 天然載體，經(jīng)酶切和連接處理后的重組載天然載體，經(jīng)酶切和連接處理后的重組載體轉(zhuǎn)化率比天然載體約低體轉(zhuǎn)化率比天然載體約低100倍，欲獲得倍，欲獲得104個重組克個重組克隆，需要投入多少重組載體隆，需要投入多少重組載體DNA進行重組實驗？進行重組實驗？104 107 cfu / mg 10-2 a 20% 重組載體重組載體 a = 0.5 mg普通的亞克隆實驗普通的亞克隆實

41、驗：110 6 cfu/g DNA；更復(fù)雜的亞克隆更復(fù)雜的亞克?。?107 cfu/g DNA，如有限量的，如有限量的DNA的轉(zhuǎn)化，的轉(zhuǎn)化，T-A克?。豢寺。粯?gòu)建文庫構(gòu)建文庫： 1108 cfu/g DNA。1）載體）載體DNA類型、大小；重組類型、大??；重組DNA濃度、純度濃度、純度2）受體細胞）受體細胞3）轉(zhuǎn)化方法：同一轉(zhuǎn)化方法）轉(zhuǎn)化方法：同一轉(zhuǎn)化方法技術(shù)參數(shù)技術(shù)參數(shù)影響轉(zhuǎn)化率影響轉(zhuǎn)化率（二）轉(zhuǎn)化率的影響因素（二）轉(zhuǎn)化率的影響因素一、載體表型選擇法二、根據(jù)插入基因的表型選擇三、DNA電泳檢測法四、PCR檢測法五、核酸雜交檢測法六、免疫化學檢測法七、DNA序列分析第四節(jié) 重組子的篩選與鑒定重

42、組子的篩選直接篩選間接篩選DNA鑒定載體篩選翻譯產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物其他方法（報告基因等）Northern blottingWestern blotting標記補救篩選質(zhì)粒載體的互補篩選（藍白色斑篩選法）噬菌體包裝容量的正性篩選質(zhì)粒載體的抗性標記篩選同源性分析鑒定（原位雜交）DNA序列分析重組子酶切圖譜鑒定重組子大小鑒定1. 抗藥性標記及其插入失活選擇法抗藥性標記及其插入失活選擇法pBR322質(zhì)粒上有兩個抗性基因質(zhì)粒上有兩個抗性基因: Tetr和和Ampr。 Tetr上有插入位點上有插入位點BamH I和和Sal I; Ampr上有插入位點上有插入位點Pst I。一、載體表型選擇法2. -半乳糖苷酶顯

43、色反應(yīng)選擇法 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 X-gal半乳糖半乳糖5-溴溴-4-氯靛藍氯靛藍+深藍色深藍色 -半乳糖苷酶使半乳糖苷酶使X-gal分解成藍色產(chǎn)物。分解成藍色產(chǎn)物。利用插入的外源基因的利用插入的外源基因的表達產(chǎn)物表達產(chǎn)物特性進行直接選擇。特性進行直接選擇。轉(zhuǎn)化進來的外源基因產(chǎn)物能夠彌補受體菌株的轉(zhuǎn)化進來的外源基因產(chǎn)物能夠彌補受體菌株的突變型缺陷。突變型缺陷。二、根據(jù)插入基因的表型選擇1. 彌補缺陷彌補缺陷his-his+受體菌：受體菌：外源基因：外源基因：在不含組氨酸的在不含組氨酸的培養(yǎng)基中生長培養(yǎng)基中生長例：抗生素抗性例：抗生素抗性抗性基因抗性基因載體載體外源外源DNA連接連接轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化

44、受體菌受體菌抗生素培養(yǎng)基平板抗生素培養(yǎng)基平板含抗生素抗性基因的含抗生素抗性基因的克隆才能生長克隆才能生長使被轉(zhuǎn)化的受體菌表現(xiàn)出外源基因的表型。使被轉(zhuǎn)化的受體菌表現(xiàn)出外源基因的表型。2. 增加新性狀有插入片段的重組載體的分子量比野生型載體有插入片段的重組載體的分子量比野生型載體分子量大。分子量大。1. 直接電泳檢測法直接電泳檢測法從轉(zhuǎn)化后的菌體克隆中從轉(zhuǎn)化后的菌體克隆中分離質(zhì)粒，電泳、比較分離質(zhì)粒，電泳、比較其分子量。其分子量。三、 DNA電泳檢測法 Marker載體載體重組重組克隆克隆2. 酶切電泳篩選法根據(jù)外源根據(jù)外源DNA序列的限制性酶切圖譜，選一兩種內(nèi)切序列的限制性酶切圖譜，選一兩種內(nèi)切

45、酶切割，電泳后比較電泳結(jié)果：酶切割，電泳后比較電泳結(jié)果：DNA帶數(shù)和長度。帶數(shù)和長度。一般用重組時的內(nèi)切酶將外源一般用重組時的內(nèi)切酶將外源DNA切出切出單單雙雙四、PCR擴增檢測法應(yīng)用應(yīng)用PCR反應(yīng)擴增出預(yù)期反應(yīng)擴增出預(yù)期DNA片斷片斷（1）從重組克隆中提取質(zhì)粒（或）從重組克隆中提取質(zhì)粒（或DNA）；）；（2）用外源）用外源DNA插入片斷引物作插入片斷引物作PCR；（3）凝膠電泳；）凝膠電泳；（4）是否有條帶產(chǎn)生，條帶大小是否正確。）是否有條帶產(chǎn)生，條帶大小是否正確。五、核酸雜交檢測法 1. Southern blotting從宿主細胞中提取從宿主細胞中提取DNA，用探針雜交。，用探針雜交。2

46、. Northern blotting主要檢測插入片斷主要檢測插入片斷是否被轉(zhuǎn)錄。是否被轉(zhuǎn)錄。從宿主細胞中提取從宿主細胞中提取RNA，用探針雜交。，用探針雜交。3. Western blotting在蛋白質(zhì)凝膠電泳以在蛋白質(zhì)凝膠電泳以后，用后，用轉(zhuǎn)膜和免疫轉(zhuǎn)膜和免疫的的方法檢測膠上的蛋白方法檢測膠上的蛋白質(zhì)泳帶。質(zhì)泳帶。（SDS-PAGE）點樣電泳方向膜膜膠膠蛋白蛋白 轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜 雜交雜交待測蛋白待測蛋白硝酸纖硝酸纖維素膜維素膜一抗一抗 二抗二抗 檢測檢測3. Western blotting4. 原位雜交篩選利 用 抗 體 作 為利 用 抗 體 作 為“探針探針”，檢測檢測產(chǎn)生外源產(chǎn)生外源DN

47、A編碼的抗原的菌編碼的抗原的菌落或噬菌斑。落或噬菌斑。六、免疫化學檢測法 對表達產(chǎn)物的檢測。對表達產(chǎn)物的檢測。蛋白蛋白蛋白蛋白“雜交雜交” 放射性抗體檢測與菌落雜交相似與菌落雜交相似DNA測序是最測序是最為準確的重組為準確的重組子鑒定方法，子鑒定方法，可以鑒定重組可以鑒定重組克隆序列是否克隆序列是否準確無誤。準確無誤。七、DNA序列分析 植物轉(zhuǎn)化體報告基因（reporter gene)篩選報告基因：報告基因：基因載體上引入的一些可證明載體已經(jīng)進入基因載體上引入的一些可證明載體已經(jīng)進入宿主細胞，并可將含有目的基因的宿主細胞從其他細胞宿主細胞，并可將含有目的基因的宿主細胞從其他細胞中識別區(qū)分甚至挑

48、選出來的具有特殊標志意義的基因。中識別區(qū)分甚至挑選出來的具有特殊標志意義的基因。 第五節(jié) 基因文庫的構(gòu)建基因文庫的基本概念基因文庫的構(gòu)建程序基因組文庫重組克隆的排序基因文庫的基本概念基因庫與基因文庫基因庫（gene pool） 特定生物體全基因組的集合（天然存在） 基因文庫（gene library or gene bank） 從特定生物個體中分離的全部基因，這些基因以克隆的形式基因組文庫（含有全部基因） 存在（人工構(gòu)建）。根據(jù)構(gòu)建方法的不同，基因文庫分為： cDNA文庫（含有全部蛋白質(zhì)編碼的結(jié)構(gòu)基因） 基因文庫的基本概念基因文庫構(gòu)建的基本戰(zhàn)略用鳥槍法構(gòu)建基因組文庫，材料來自染色體DNA用cD

49、NA法構(gòu)建cDNA文庫，材料來自mRNA在高度分化的生物體中，不同組織和細胞在不同時段的mRNA種類不同（即基因的表達譜不同），因此同種生物體的cDNA文庫一般還有組織細胞的界定，如肝組織cDNA文庫或胚胎組織cDNA文庫等。很顯然， cDNA文庫的信息量遠小于基因組文庫基因文庫的基本概念基因文庫的完備性基因文庫的完備性是指：在構(gòu)建的基因文庫中任一基因存在的概率，它與基因文庫最低所含克隆數(shù)N之間的關(guān)系可用下式表示：N = ln ( 1 P ) / ln ( 1 f )其中： P = 任一基因被克?。ɑ虼嬖谟诨蛭膸熘校┑母怕?f = 克隆片段的平均大小 / 生物基因組的大小 例如，人的單倍體D

50、NA總長為2.9 x 109 bp，基因文庫中克隆片段的平均大小為15 kb，則構(gòu)建一個完備性為0.9的基因文庫至少需要45萬個克隆；而當完備性提高到0.9999時，基因文庫至少需要180萬個克隆基因文庫的基本概念基因文庫的質(zhì)量標準除了盡可能高的完備性外，一個理想的基因文庫應(yīng)具備下列條件：重組克隆的總數(shù)不宜過大 以減輕篩選工作的壓力載體的裝載量最好大于基因的長度 避免基因被分隔克隆克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域 以利克隆排序克隆片段易于從載體分子上完整卸下重組克隆能穩(wěn)定保存、擴增、篩選基因文庫的構(gòu)建程序基因組DNA的制備 為了最大限度地保證基因在克隆過程中的完整性， 用于基因組文庫構(gòu)

51、建的DNA在分離純化操作中應(yīng)盡量避免過度的斷裂。制備的DNA分子量越大，經(jīng)切割處理后樣品中含有不規(guī)則末端的DNA片段的比率就越低，重組率和完備性也就越高AAAA用常規(guī)方法制備的染色體DNA的長度一般在100 kb左右如果先將細胞固定在低融點凝膠中，然后置入含有SDS、蛋白酶K、RNase的緩沖液中浸泡，可獲得1000 kb大小的DNA片段基因文庫的構(gòu)建程序基因組DNA的切割 用于基因組文庫構(gòu)建的DNA片段的切割一般采用超聲波處理和限制性內(nèi)切酶部分酶切兩種方法，其目的是： 第一，保證DNA片段之間存在部分重疊區(qū) 第二，保證DNA片段大小均一超聲波處理后的DNA片段呈平頭末端，需加裝人工接頭 部分酶切法一般選用四對堿基識別序列的限制性內(nèi)切酶，如：Sau3AI或MboI等，這樣DNA酶解片段的大小可控 連接前，上述處理的DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進行分級分離，以杜絕不相干的DNA片段隨機連為一體！基因文庫的構(gòu)建程序載體和受體的選擇 出于壓縮重組克隆的數(shù)量，用于基因組文庫構(gòu)建的載體通常選