熒光光譜分析法

1、1第五章第五章 熒光熒光分析法分析法第一節(jié)第一節(jié) 第二節(jié)第二節(jié) 熒光定量分析方法熒光定量分析方法第三節(jié)第三節(jié) 熒光分光光度計(jì)熒光分光光度計(jì)2 某些物質(zhì)受到光照射，除吸收某種波長的光之外，發(fā)射出某些物質(zhì)受到光照射，除吸收某種波長的光之外，發(fā)射出比原來所吸收光的波長更長的光比原來所吸收光的波長更長的光光致發(fā)光光致發(fā)光（二級光）。（二級光）。光致發(fā)光光致發(fā)光熒光熒光 fluorescence 磷光磷光 phosphorescence 熒光分析法是根據(jù)物質(zhì)的熒光分析法是根據(jù)物質(zhì)的熒光譜線的位置熒光譜線的位置及其及其強(qiáng)度強(qiáng)度進(jìn)進(jìn)行物質(zhì)鑒定和含量測定的儀器方法。行物質(zhì)鑒定和含量測定的儀器方法。 3分子熒光

2、分析的特點(diǎn)：分子熒光分析的特點(diǎn)：1. 靈敏度靈敏度高：高：一般紫外一可見分光光度法的檢出一般紫外一可見分光光度法的檢出限約為限約為10-7g/ml，而熒光分析法的檢出限可達(dá)到，而熒光分析法的檢出限可達(dá)到10-10甚至甚至10-12 g/ml。2. 選擇性選擇性好好3. 線性范圍線性范圍寬寬4. 應(yīng)用范圍應(yīng)用范圍窄窄41. 分子熒光的產(chǎn)生分子熒光的產(chǎn)生一、分子熒光一、分子熒光 molecular fluorescence分子能級比原子能級復(fù)雜分子能級比原子能級復(fù)雜在在分子體系中，分子體系中，每個(gè)電子能級上都存在振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)能每個(gè)電子能級上都存在振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)能層層室溫下大多數(shù)分子處于基態(tài)的最低振動(dòng)能層

3、室溫下大多數(shù)分子處于基態(tài)的最低振動(dòng)能層在基態(tài)時(shí)，含有偶數(shù)個(gè)電子的分子，電子的在基態(tài)時(shí)，含有偶數(shù)個(gè)電子的分子，電子的ms為為+1/2和和-1/2, s=0，M=1。則該分子所處的電子能態(tài)稱為。則該分子所處的電子能態(tài)稱為基態(tài)單重態(tài)基態(tài)單重態(tài),用符號用符號S0表示表示5分子吸收輻射后分子吸收輻射后電子被激發(fā)且不發(fā)生自旋方向的改變電子被激發(fā)且不發(fā)生自旋方向的改變ms為為+1/2和和-1/2, s=0，M=1。則該分子所處的電子能態(tài)稱為。則該分子所處的電子能態(tài)稱為激發(fā)單重態(tài)激發(fā)單重態(tài),用符號用符號S表示。表示。 （S1 S2 S3）電子被激發(fā)且伴隨著自旋方向的改變電子被激發(fā)且伴隨著自旋方向的改變ms為為

4、+1/2和和+1/2, s=1，M=3。則該分子所處的電子能態(tài)稱為。則該分子所處的電子能態(tài)稱為激發(fā)三重態(tài)激發(fā)三重態(tài),用符號用符號T表示。（表示。（T1 T2 T3）S06 小結(jié)：分子能級與躍遷小結(jié)：分子能級與躍遷 基態(tài)基態(tài)(S0)激發(fā)態(tài)：吸收特定頻率的輻射；量子化；躍遷激發(fā)態(tài)：吸收特定頻率的輻射；量子化；躍遷 一次到位；一次到位； 激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài)基態(tài)：多種途徑和方式基態(tài)：多種途徑和方式(見能級圖見能級圖)；速度最快、激；速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢，發(fā)生的幾率大；發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢，發(fā)生的幾率大； 第一、第二、第一、第二、電子激發(fā)單重態(tài)電子激發(fā)單重態(tài) S1 、S2 ； 第一、第二、

5、第一、第二、電子激發(fā)三重態(tài)電子激發(fā)三重態(tài) T1 、 T2 ；電子能級的多重性電子能級的多重性 M=2S+1 平行自旋比成對自旋穩(wěn)定平行自旋比成對自旋穩(wěn)定( (洪特規(guī)則洪特規(guī)則) )，三重態(tài)能級比相應(yīng)，三重態(tài)能級比相應(yīng)單重態(tài)能級低；單重態(tài)能級低； 大多數(shù)有機(jī)分子的基態(tài)處于單重態(tài)；大多數(shù)有機(jī)分子的基態(tài)處于單重態(tài)； 7S0S1、S2 允許躍遷；允許躍遷；S0T1、T2 禁阻躍遷；通過其他途徑進(jìn)入禁阻躍遷；通過其他途徑進(jìn)入(見能級圖見能級圖)；進(jìn)入的幾率??；進(jìn)入的幾率??； 小結(jié)：激發(fā)單重態(tài)與激發(fā)三重態(tài)的不同小結(jié)：激發(fā)單重態(tài)與激發(fā)三重態(tài)的不同 激發(fā)單重態(tài)分子中沒有凈電子自旋，因而具有反磁性；激發(fā)單重態(tài)分

6、子中沒有凈電子自旋，因而具有反磁性；激發(fā)三重態(tài)有激發(fā)三重態(tài)有2個(gè)自旋平行電子，是順磁性的個(gè)自旋平行電子，是順磁性的 激發(fā)單重態(tài)分子平均壽命短（激發(fā)單重態(tài)分子平均壽命短（10-810-6s），而激發(fā)三重態(tài)），而激發(fā)三重態(tài)的長（的長（10-410s） 基態(tài)單重態(tài)到激發(fā)單重態(tài)的激發(fā)，不涉及電子自旋方向的基態(tài)單重態(tài)到激發(fā)單重態(tài)的激發(fā)，不涉及電子自旋方向的改變而容易發(fā)生，屬于允許躍遷；而到激發(fā)三重態(tài)屬于禁阻改變而容易發(fā)生，屬于允許躍遷；而到激發(fā)三重態(tài)屬于禁阻躍遷躍遷S2S1S0T1吸吸收收發(fā)發(fā)射射熒熒光光發(fā)發(fā)射射磷磷光光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能量l l 2l l 1l l 4 外轉(zhuǎn)換l l 3 3T2內(nèi)

7、轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫9激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài)基態(tài)的能量傳遞途徑基態(tài)的能量傳遞途徑 電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時(shí)，通過輻射電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時(shí)，通過輻射躍遷躍遷( (發(fā)光發(fā)光) )和無輻射躍遷等方式失去能量；和無輻射躍遷等方式失去能量；熒光延遲熒光磷光輻射躍遷輻射躍遷無輻射躍遷無輻射躍遷傳遞途徑傳遞途徑內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移系間跨越振動(dòng)弛豫熒光熒光：10-710-9s，第一激發(fā)第一激發(fā)單重態(tài)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級的最低振動(dòng)能級基態(tài)基態(tài)磷光磷光：10-410s； 第一激發(fā)第一激發(fā)三重態(tài)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級的最低振動(dòng)能級基態(tài)基態(tài)10輻射和輻射和非輻射能量傳遞過程非輻射能量傳遞過程振動(dòng)弛豫振動(dòng)弛豫：同一

8、同一電子能級中，以電子能級中，以熱能量交換形式由高振動(dòng)能熱能量交換形式由高振動(dòng)能層至低相鄰振動(dòng)能層間的躍遷層至低相鄰振動(dòng)能層間的躍遷。發(fā)生振動(dòng)弛豫的時(shí)間。發(fā)生振動(dòng)弛豫的時(shí)間1010-12-12s s內(nèi)轉(zhuǎn)換：內(nèi)轉(zhuǎn)換：相同多重態(tài)的電子能級間的相同多重態(tài)的電子能級間的等能級的無輻射躍遷等能級的無輻射躍遷。 通過內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動(dòng)弛豫，高激發(fā)單重態(tài)的電子躍回第一激通過內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動(dòng)弛豫，高激發(fā)單重態(tài)的電子躍回第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級。發(fā)生內(nèi)轉(zhuǎn)換的時(shí)間發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級。發(fā)生內(nèi)轉(zhuǎn)換的時(shí)間10-13s。熒光發(fā)射：熒光發(fā)射：電子由電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能層第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能層基態(tài)基態(tài)( 熒光

9、多為熒光多為 S1 S0躍遷躍遷)，發(fā)射波長為，發(fā)射波長為 l l3的熒光，的熒光，10-710-9s 。 發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，波長長：發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，波長長： l l3 l l 2 l l 1 ；系間跨越：系間跨越：激發(fā)態(tài)的電子發(fā)生自旋反轉(zhuǎn)而使分子的多重性發(fā)激發(fā)態(tài)的電子發(fā)生自旋反轉(zhuǎn)而使分子的多重性發(fā)生變化的生變化的非輻射躍遷非輻射躍遷。 禁阻躍遷，但當(dāng)能層有較大重疊時(shí)禁阻躍遷，但當(dāng)能層有較大重疊時(shí)S1T1 就可發(fā)生系間就可發(fā)生系間跨越，通過自旋跨越，通過自旋軌道耦合進(jìn)行。軌道耦合進(jìn)行。 10-6s 外轉(zhuǎn)換：外轉(zhuǎn)換：激發(fā)態(tài)分子與溶劑或其他溶質(zhì)分子之間碰撞引起的激

10、發(fā)態(tài)分子與溶劑或其他溶質(zhì)分子之間碰撞引起的轉(zhuǎn)移能量的轉(zhuǎn)移能量的非輻射躍遷非輻射躍遷。常發(fā)生在。常發(fā)生在S1或或 T1 S0 外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或“猝滅猝滅”。 磷光發(fā)射：磷光發(fā)射：電子電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級基態(tài)基態(tài)(T1 S0躍遷躍遷)；發(fā)光速度很；發(fā)光速度很慢慢： 10-4100s、磷光的、磷光的能量比熒光小能量比熒光小 電子由電子由S0進(jìn)入進(jìn)入T1的過程：（的過程：（ S0 T1禁阻躍遷）禁阻躍遷） S0激發(fā)激發(fā)振動(dòng)弛豫振動(dòng)弛豫內(nèi)轉(zhuǎn)移內(nèi)轉(zhuǎn)移系間跨越系間跨越振動(dòng)弛豫振動(dòng)弛豫 T1 光照停止后，可持續(xù)一段時(shí)間光照停止后，可持

11、續(xù)一段時(shí)間122. 熒光的激發(fā)光譜與熒光光譜熒光的激發(fā)光譜與熒光光譜excitation spectrum and fluorescence spectrum（1 1）熒光的激發(fā)光譜熒光的激發(fā)光譜 激發(fā)光譜：激發(fā)光譜：表示表示不同激發(fā)波長不同激發(fā)波長下所引起物質(zhì)下所引起物質(zhì)發(fā)射某一波長熒光發(fā)射某一波長熒光的的相對效率。相對效率。 繪制激發(fā)光譜：繪制激發(fā)光譜：固定固定發(fā)射發(fā)射波長波長( (選最大發(fā)射波長選最大發(fā)射波長),),然后以不同波長的然后以不同波長的入射光激發(fā)熒光物質(zhì)，以入射光激發(fā)熒光物質(zhì)，以熒光強(qiáng)度熒光強(qiáng)度F對對激發(fā)波長激發(fā)波長l l作圖作圖，即為激發(fā)光譜。，即為激發(fā)光譜。熒光分子都具有

12、兩個(gè)特征光譜：熒光分子都具有兩個(gè)特征光譜：激發(fā)光譜激發(fā)光譜和和發(fā)射光譜（熒光光發(fā)射光譜（熒光光譜）譜）。 激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強(qiáng)激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強(qiáng)度最大，稱為度最大，稱為最大激發(fā)波長最大激發(fā)波長 l lex（2）熒光的發(fā)射光譜（熒光光譜）熒光的發(fā)射光譜（熒光光譜） 熒光光譜表示在所發(fā)射的熒光中各種波長組分的相對強(qiáng)熒光光譜表示在所發(fā)射的熒光中各種波長組分的相對強(qiáng)度。繪制發(fā)射光譜時(shí)，度。繪制發(fā)射光譜時(shí)， 使激發(fā)光波長使激發(fā)光波長固定在固定在l lex處處，然后對發(fā)，然后對發(fā)射光譜掃描，測定各種波長下相應(yīng)的熒光強(qiáng)度，射光譜掃描，測定各種波長

13、下相應(yīng)的熒光強(qiáng)度，以以熒光強(qiáng)度熒光強(qiáng)度F 對發(fā)射波長對發(fā)射波長l l作圖作圖，得發(fā)射光譜圖（即熒光光譜）。，得發(fā)射光譜圖（即熒光光譜）。發(fā)射光譜（熒光光譜）的位置？發(fā)射光譜（熒光光譜）的位置？磷光光譜的位置？磷光光譜的位置？200260320380440500560620熒光激發(fā)光譜熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜熒光發(fā)射光譜磷光光譜磷光光譜室溫下菲的乙醇溶液熒（磷）光光譜室溫下菲的乙醇溶液熒（磷）光光譜15激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系 a. Stokes位移位移 熒光光譜總是位于物質(zhì)激發(fā)光譜的長波一側(cè)，即熒光波熒光光譜總是位于物質(zhì)激發(fā)光譜的長波一側(cè)，即熒光波長大于激發(fā)光波長的現(xiàn)象

14、。長大于激發(fā)光波長的現(xiàn)象。 激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長差值：激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長差值： 振動(dòng)弛豫、內(nèi)轉(zhuǎn)換等物輻射躍遷損失了部分能量。振動(dòng)弛豫、內(nèi)轉(zhuǎn)換等物輻射躍遷損失了部分能量。 b. 熒光光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)熒光光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān) 電子可以躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級，吸收不同波長的能量電子可以躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級，吸收不同波長的能量(如能級圖如能級圖l l 2 、l l 1)，產(chǎn)生不同吸收帶，但熒光光譜卻只有一，產(chǎn)生不同吸收帶，但熒光光譜卻只有一個(gè)發(fā)射態(tài)，如個(gè)發(fā)射態(tài)，如l l 3 。 為什么？為什么？16c. c. 鏡像規(guī)則鏡像規(guī)則 由于電子基態(tài)的振動(dòng)能級分布與激發(fā)態(tài)相似，由于電

15、子基態(tài)的振動(dòng)能級分布與激發(fā)態(tài)相似，故通常故通常熒光光譜與它的激發(fā)光譜成鏡像對稱關(guān)系。熒光光譜與它的激發(fā)光譜成鏡像對稱關(guān)系。各小峰波長各小峰波長遞減值與遞減值與振振動(dòng)能級差動(dòng)能級差有有關(guān)，各小峰關(guān)，各小峰的高度與的高度與躍躍遷幾率遷幾率有關(guān)。有關(guān)。 基態(tài)上的各振動(dòng)能級分布與第一激發(fā)態(tài)上的各基態(tài)上的各振動(dòng)能級分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動(dòng)振動(dòng)能級分布類似能級分布類似； 基態(tài)上的某振動(dòng)能級若躍遷到第一激發(fā)態(tài)的某振動(dòng)能基態(tài)上的某振動(dòng)能級若躍遷到第一激發(fā)態(tài)的某振動(dòng)能級的幾率較大的話，級的幾率較大的話，相反躍遷也如此相反躍遷也如此。 18二、熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系二、熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系 relat

16、ion between fluorescence and molecular structure 1.分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件（1）具有合適的結(jié)構(gòu)；）具有合適的結(jié)構(gòu)；（2）具有一定的熒光量子產(chǎn)率。）具有一定的熒光量子產(chǎn)率。 熒光量子產(chǎn)率（熒光量子產(chǎn)率（ ）：）：吸收的光量子數(shù)發(fā)射的光量子數(shù)物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率范圍一般是多少?如果一個(gè)分子將吸收的光子全部釋放，則其量子產(chǎn)率為如果一個(gè)分子將吸收的光子全部釋放，則其量子產(chǎn)率為100%100%。192.有機(jī)化合物的分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系有機(jī)化合物的分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系（1）躍遷類型：* 的熒光效率高，系間跨越過程的速率常數(shù)小，有

17、利于熒光的產(chǎn)生；（2）共軛效應(yīng)：提高共軛度有利于增加熒光效率并產(chǎn)生紅移（4）取代基效應(yīng)：芳環(huán)上有供電子基，使熒光增強(qiáng)。（3）剛性平面結(jié)構(gòu)：可降低分子振動(dòng)，減少與溶劑的相互作用，故具有很強(qiáng)的熒光。如熒光素和酚酞有相似結(jié)構(gòu)，熒光素有很強(qiáng)的熒光，酚酞卻沒有。2021三、影響熒光強(qiáng)度的因素三、影響熒光強(qiáng)度的因素 relation between fluorescence and molecular structure 影響熒光強(qiáng)度的影響熒光強(qiáng)度的外部因素外部因素1.溶劑的影響溶劑的影響 同一物質(zhì)在不同溶劑中，其熒光光譜的形狀和強(qiáng)度都有差別。同一物質(zhì)在不同溶劑中，其熒光光譜的形狀和強(qiáng)度都有差別。一般情況

18、下，熒光波長隨著溶劑極性的增大而長移，熒光強(qiáng)度也有一般情況下，熒光波長隨著溶劑極性的增大而長移，熒光強(qiáng)度也有所增強(qiáng)。這是因?yàn)樵跇O性溶劑中，所增強(qiáng)。這是因?yàn)樵跇O性溶劑中，*躍遷所需的能量差躍遷所需的能量差E小，小，而且躍遷幾率增加，從而使紫外吸收波長和熒光波長均長移，強(qiáng)度而且躍遷幾率增加，從而使紫外吸收波長和熒光波長均長移，強(qiáng)度也增強(qiáng)。也增強(qiáng)。 溶劑溶劑粘度粘度減小時(shí)，可以增加分子間碰撞機(jī)會(huì)，使無輻射躍遷增減小時(shí)，可以增加分子間碰撞機(jī)會(huì)，使無輻射躍遷增加而熒光減弱。故熒光強(qiáng)度隨溶劑粘度的減小而減弱。由于溫度對加而熒光減弱。故熒光強(qiáng)度隨溶劑粘度的減小而減弱。由于溫度對溶劑的粘度有影響，一般是溫度上

19、升，溶劑粘度變小，因此溫度上溶劑的粘度有影響，一般是溫度上升，溶劑粘度變小，因此溫度上升，熒光強(qiáng)度下降。升，熒光強(qiáng)度下降。222.溫度的影響溫度的影響 熒光強(qiáng)度對溫度變化敏感，溫度增加，分子運(yùn)動(dòng)速度加熒光強(qiáng)度對溫度變化敏感，溫度增加，分子運(yùn)動(dòng)速度加快，分子間碰撞的幾率增加，外轉(zhuǎn)換去活的幾率增加，熒光快，分子間碰撞的幾率增加，外轉(zhuǎn)換去活的幾率增加，熒光效率降低。例如熒光素鈉的乙醇溶液，在效率降低。例如熒光素鈉的乙醇溶液，在0以下，溫度每降以下，溫度每降低低10， f增加增加3，在，在 80時(shí)，時(shí)， f為為1。23 當(dāng)熒光物質(zhì)本身是當(dāng)熒光物質(zhì)本身是弱酸或弱堿弱酸或弱堿時(shí)，溶液的時(shí)，溶液的pH值對該

20、熒光物質(zhì)的值對該熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度有較大影響，這主要是因?yàn)樵诓煌岫戎蟹肿雍碗x子間的熒光強(qiáng)度有較大影響，這主要是因?yàn)樵诓煌岫戎蟹肿雍碗x子間的平衡改變，離子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，因此熒光強(qiáng)度也有差異。每一種熒平衡改變，離子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，因此熒光強(qiáng)度也有差異。每一種熒光物質(zhì)都有它最適宜的發(fā)射熒光的存在形式，也就是有它最適宜的光物質(zhì)都有它最適宜的發(fā)射熒光的存在形式，也就是有它最適宜的pH值范圍。例如苯胺在不同值范圍。例如苯胺在不同pH值下有下列平衡關(guān)系：值下有下列平衡關(guān)系：苯胺在苯胺在pH712的溶液中主要以分子形式存在，由于的溶液中主要以分子形式存在，由于 NH2為為提高熒提高熒光效率光效率的取代基，故

21、苯胺分子會(huì)發(fā)生藍(lán)色熒光。但在的取代基，故苯胺分子會(huì)發(fā)生藍(lán)色熒光。但在pH2和和pH13的溶液中均以苯胺離子形式存在，故不能發(fā)射熒光。的溶液中均以苯胺離子形式存在，故不能發(fā)射熒光。 3. 溶液溶液pH 對酸堿化合物，溶液對酸堿化合物，溶液pH的影響較大，需要嚴(yán)格控制；的影響較大，需要嚴(yán)格控制；244.內(nèi)濾光作用和自吸現(xiàn)象內(nèi)濾光作用和自吸現(xiàn)象 自吸現(xiàn)象自吸現(xiàn)象：化合物的熒光發(fā)射光譜的短波長端與其吸收：化合物的熒光發(fā)射光譜的短波長端與其吸收 光譜的長波長端重疊，產(chǎn)生自吸收；如蒽化合物。光譜的長波長端重疊，產(chǎn)生自吸收；如蒽化合物。 內(nèi)濾光作用內(nèi)濾光作用：溶液中含有能吸收激發(fā)光或熒光物質(zhì)發(fā)：溶液中含有能

22、吸收激發(fā)光或熒光物質(zhì)發(fā) 射的熒光，如色胺酸中的重鉻酸鉀；射的熒光，如色胺酸中的重鉻酸鉀；255.熒光熄滅劑熒光熄滅劑 熒光熄滅是指熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或溶質(zhì)分子相互熒光熄滅是指熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或溶質(zhì)分子相互作用引起熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象。引起熒光熄滅的物質(zhì)稱為作用引起熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象。引起熒光熄滅的物質(zhì)稱為熒光熄滅劑熒光熄滅劑(quenching medium)。如。如鹵素離子鹵素離子、重金屬離子重金屬離子、氧分子氧分子以及以及硝基化合物硝基化合物、重氮化合物重氮化合物、羰基羰基和和羧基化合羧基化合物物均為常見的熒光熄滅劑。均為常見的熒光熄滅劑。266、散射光、散射光 小部分光子和物質(zhì)分

23、子相碰撞，使光子的運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生小部分光子和物質(zhì)分子相碰撞，使光子的運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生改變而向不同角度散射。改變而向不同角度散射。瑞利光：瑞利光：光子和物質(zhì)發(fā)生彈性碰撞，不發(fā)生能量交換，只光子和物質(zhì)發(fā)生彈性碰撞，不發(fā)生能量交換，只是光子運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生改變。其波長與入射光波長相同。是光子運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生改變。其波長與入射光波長相同。拉曼光：拉曼光：光子和物質(zhì)發(fā)生彈性碰撞，發(fā)生能量交換，光子把光子和物質(zhì)發(fā)生彈性碰撞，發(fā)生能量交換，光子把部分能量轉(zhuǎn)移給物質(zhì)分子或從物質(zhì)分子獲得部分能量。從而部分能量轉(zhuǎn)移給物質(zhì)分子或從物質(zhì)分子獲得部分能量。從而發(fā)射出比入射光稍長或稍短的光。發(fā)射出比入射光稍長或稍短的光。散射光對熒光測

24、定有干擾，散射光對熒光測定有干擾，尤其是波長比入射光波長更長尤其是波長比入射光波長更長的拉曼光的拉曼光，與熒光波長接近，對測定的干擾大，必須采取，與熒光波長接近，對測定的干擾大，必須采取措施消除。措施消除。拉曼光的干擾主要來自溶劑，當(dāng)溶劑的拉曼光拉曼光的干擾主要來自溶劑，當(dāng)溶劑的拉曼光與被測物質(zhì)的熒光光譜相重疊時(shí)，應(yīng)更換溶劑或改變激發(fā)與被測物質(zhì)的熒光光譜相重疊時(shí)，應(yīng)更換溶劑或改變激發(fā)光波長光波長27選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)波長可消除拉曼光的干擾選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)波長可消除拉曼光的干擾a:320nm或350nm為激發(fā)光，熒光峰總是在448nm。 b:將空白溶劑分別在320nm及350nm激發(fā)光照射下測定熒光，

25、激發(fā)光波長為320nm時(shí)，拉曼光波長是360nm，360nm的拉曼光對熒光無影響；當(dāng)激發(fā)光波長為350nm時(shí)，拉曼光波長是400nm，400nm的拉曼光對熒光有干擾，因而影響測定結(jié)果。 硫酸奎寧在不同波長激發(fā)下的熒光與散射光譜硫酸奎寧在不同波長激發(fā)下的熒光與散射光譜 28四、四、熒光熒光試劑試劑 熒光試劑熒光試劑是一種可以使非熒光物質(zhì)或弱熒光物質(zhì)與其反是一種可以使非熒光物質(zhì)或弱熒光物質(zhì)與其反應(yīng)之后，得到強(qiáng)熒光性產(chǎn)物的標(biāo)記物，從而可擴(kuò)大熒光分析應(yīng)之后，得到強(qiáng)熒光性產(chǎn)物的標(biāo)記物，從而可擴(kuò)大熒光分析法的使用范圍法的使用范圍1.1.有機(jī)化合物的熒光分析有機(jī)化合物的熒光分析 脂肪族化合物能產(chǎn)生熒光的為數(shù)

26、不多。芳香族及具有芳香脂肪族化合物能產(chǎn)生熒光的為數(shù)不多。芳香族及具有芳香結(jié)構(gòu)的化合物，因存在共軛體系而容易吸收光能，在紫外光照結(jié)構(gòu)的化合物，因存在共軛體系而容易吸收光能，在紫外光照射下很多能發(fā)射熒光。有時(shí)為了提高測定的靈敏度和選擇性，射下很多能發(fā)射熒光。有時(shí)為了提高測定的靈敏度和選擇性，常使弱熒光性物質(zhì)與某些熒光試劑作用，以得到強(qiáng)熒光性產(chǎn)物常使弱熒光性物質(zhì)與某些熒光試劑作用，以得到強(qiáng)熒光性產(chǎn)物( (衍生化衍生化) )。因此，熒光分析法在有機(jī)物測定方面的應(yīng)用很廣。因此，熒光分析法在有機(jī)物測定方面的應(yīng)用很廣。29 能用熒光分析法測定的有機(jī)物包括多環(huán)胺類、萘酚類、嘌啉類、能用熒光分析法測定的有機(jī)物包

27、括多環(huán)胺類、萘酚類、嘌啉類、吲哚類、多環(huán)芳烴類、具有芳環(huán)或芳雜環(huán)結(jié)構(gòu)的吲哚類、多環(huán)芳烴類、具有芳環(huán)或芳雜環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸類及蛋白質(zhì)氨基酸類及蛋白質(zhì)等；藥物中的生物堿類如麥角堿、蛇根堿、麻黃堿、嗎啡、喹啉類等；藥物中的生物堿類如麥角堿、蛇根堿、麻黃堿、嗎啡、喹啉類及異喹啉類生物堿等；及異喹啉類生物堿等；甾體類如皮質(zhì)激素及雌醇等甾體類如皮質(zhì)激素及雌醇等；抗生素類如青抗生素類如青霉素、四環(huán)素等霉素、四環(huán)素等；維生素類如維生素維生素類如維生素A、B1、B2、B6、B12、E、抗、抗壞血酸、葉酸及煙酰胺等壞血酸、葉酸及煙酰胺等。此外，。此外，中草藥中的許多有效成分中草藥中的許多有效成分，不少，不少是屬于芳

28、香性結(jié)構(gòu)的大分子雜環(huán)類，都能產(chǎn)生熒光，可用熒光分析是屬于芳香性結(jié)構(gòu)的大分子雜環(huán)類，都能產(chǎn)生熒光，可用熒光分析法作初步鑒別及含量測定。熒光分析法的靈敏度高，選擇性較好，法作初步鑒別及含量測定。熒光分析法的靈敏度高，選擇性較好，取樣量少，方法快速，已成為醫(yī)藥學(xué)、生物學(xué)、農(nóng)業(yè)和工業(yè)等領(lǐng)域取樣量少，方法快速，已成為醫(yī)藥學(xué)、生物學(xué)、農(nóng)業(yè)和工業(yè)等領(lǐng)域進(jìn)行科學(xué)研究工作的重要手段之一。以下是幾個(gè)重要的熒光試劑：進(jìn)行科學(xué)研究工作的重要手段之一。以下是幾個(gè)重要的熒光試劑： 1熒光胺熒光胺(fluorescamine)：能與脂肪族或芳香族伯胺類形成高度熒能與脂肪族或芳香族伯胺類形成高度熒光衍生物，典型反應(yīng)如下：光衍

29、生物，典型反應(yīng)如下：熒光胺及其水解產(chǎn)物不顯熒光。熒光胺及其水解產(chǎn)物不顯熒光。100mg熒光胺溶于熒光胺溶于100ml無無水丙酮中，放置水丙酮中，放置24小時(shí)后即可使用。取相當(dāng)于小時(shí)后即可使用。取相當(dāng)于10mg藥物的甲醇或藥物的甲醇或水溶液水溶液0.lml，加適宜，加適宜pH值的磷酸緩沖溶液值的磷酸緩沖溶液5ml，加熒光胺試劑，加熒光胺試劑0.lml，混合，放置混合，放置15分鐘后測定熒光強(qiáng)度。熒光條件為：分鐘后測定熒光強(qiáng)度。熒光條件為：ex=275、390nm，em=480nm。312鄰苯二甲醛鄰苯二甲醛(OPA) 在在2 巰基乙醇存在下，巰基乙醇存在下，pH910的緩沖溶液中的緩沖溶液中OP

30、A能能與伯胺類、特別是除半胱氨酸、脯氨酸及羥脯氨酸外的與伯胺類、特別是除半胱氨酸、脯氨酸及羥脯氨酸外的a 氨基酸生成靈敏的熒光產(chǎn)物。取氨基酸生成靈敏的熒光產(chǎn)物。取OPA 500mg溶于溶于10ml乙醇乙醇中，加中，加200ml 2 巰基乙醇，將此混合液加至巰基乙醇，將此混合液加至1L 3的硼酸的硼酸溶液中，再用溶液中，再用KOH調(diào)節(jié)至調(diào)節(jié)至pH10，即為常用試劑溶液。熒，即為常用試劑溶液。熒光條件為：光條件為：ex=340nm，em=455nm。3231 二甲氨基二甲氨基 5 氯化磺酰萘氯化磺酰萘(Dansyl-Cl，丹酰氯，丹酰氯) 能與伯胺、仲胺及酚基的生物堿類反應(yīng)生成熒光性產(chǎn)物。能與伯胺

31、、仲胺及酚基的生物堿類反應(yīng)生成熒光性產(chǎn)物。取取50mg或或100mg試劑，溶解于試劑，溶解于500ml無水丙酮中即可使用。無水丙酮中即可使用。與丹酰氯類似的一個(gè)試劑是丹酰肼與丹酰氯類似的一個(gè)試劑是丹酰肼(DansylNHNH2)，它能，它能與可的松的羰基縮合，產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光。熒光條件為：與可的松的羰基縮合，產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光。熒光條件為：ex=365nm，em=500nm左右。左右。 丹酰氯試劑不穩(wěn)定，其水解產(chǎn)物丹酰氯試劑不穩(wěn)定，其水解產(chǎn)物Dansyl OH呈藍(lán)色熒光呈藍(lán)色熒光，必須，必須暗處保存暗處保存，每周重，每周重新配新配制。制。332.2.生物與有機(jī)化合物的分析生物與有機(jī)化合物的分析34 無機(jī)

32、離子一般不顯熒光，無機(jī)離子一般不顯熒光，與有機(jī)試劑形與有機(jī)試劑形成有熒光的成有熒光的配配合物后合物后，可測量約可測量約6060種元素種元素及離子及離子 鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、稀土鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、稀土采用熒光分析法采用熒光分析法 氟、硫、鐵、銀、鈷、鎳氟、硫、鐵、銀、鈷、鎳采用熒光熄滅法測定采用熒光熄滅法測定 銅、鐵、鈷、鋨及過氧化氫銅、鐵、鈷、鋨及過氧化氫采用催化熒光法測定采用催化熒光法測定 鉻、鈮、鈾、碲鉻、鈮、鈾、碲采用低溫?zé)晒夥y定采用低溫?zé)晒夥y定 鈰、銪、銻、釩、鈾鈰、銪、銻、釩、鈾采用固體熒光法測定采用固體熒光法測定2.無機(jī)化合物的分析無機(jī)化合物的分析35第第二二節(jié)節(jié) 熒光熒光定量分析方法定量分析方法一、熒光強(qiáng)度與物質(zhì)濃度的關(guān)系一、熒光強(qiáng)度與物質(zhì)濃度的關(guān)系 當(dāng)一束強(qiáng)度為當(dāng)一束強(qiáng)度為I0的紫外的紫外/可見光照射一濃度為可見光照射一濃度為c、液層厚液層厚度為度為d的液槽時(shí)，可在溶液的的液槽時(shí)，可在溶液的各個(gè)方向各個(gè)方向觀察到熒光，其觀察到熒光，其 由于能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)占被分析物的數(shù)量相當(dāng)有限，由于能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)占被分析物的數(shù)量相當(dāng)有限，且就這少量的熒光物質(zhì)幾乎在同一波長段產(chǎn)生光致發(fā)光，且就這少量的熒光物質(zhì)幾乎在同一波長段產(chǎn)生光致發(fā)光，所以熒光法所以熒光法很少用來定性分析很少用來定性分析 吸收光強(qiáng)度為吸收光強(qiáng)度為Ia透過光強(qiáng)度為透過光強(qiáng)度為It熒