發(fā)酵過程多尺度優(yōu)化案例(郭美錦)

1、發(fā)酵過程多尺度優(yōu)化案例發(fā)酵過程多尺度優(yōu)化案例郭美錦郭美錦華東理工大學(xué)華東理工大學(xué)中國(guó)中國(guó) 上海上海青霉素發(fā)酵曲線基因工程菌基因工程菌紅霉素發(fā)酵曲線紅霉素發(fā)酵曲線303-09-433303-09-433批基因工程菌代謝過程曲線批基因工程菌代謝過程曲線( (接種量接種量10.7%)10.7%) 發(fā)酵中期（發(fā)酵中期（70-90h70-90h）隨著補(bǔ)糖速率的快速上升，）隨著補(bǔ)糖速率的快速上升，RQRQ上升上升，OUROUR、CERCER出現(xiàn)第二高峰，即出現(xiàn)第二高峰，即“二次生長(zhǎng)二次生長(zhǎng)”。阿維菌素發(fā)酵過程曲線阿維菌素發(fā)酵過程曲線發(fā)酵過程優(yōu)化與放大是發(fā)酵過程優(yōu)化與放大是一個(gè)令人困惑的問題一個(gè)令人困惑的問

2、題？ 背景背景 直接參數(shù)直接參數(shù) 物理參數(shù)物理參數(shù) 化學(xué)參數(shù)化學(xué)參數(shù)溫度 壓力 功率輸入 通氣流量 泡沫水平 加料速率 基質(zhì) 前體 誘導(dǎo)物 培養(yǎng)液重量 培養(yǎng)液體積 生物熱 培 養(yǎng) 液 表 觀 粘度 積累消耗量 基質(zhì) 酸 堿 消泡劑 細(xì)胞量 氣泡含量 氣泡表面積 表面張力 pH 氧化還原電位 溶解氧濃度 溶解 CO2濃度 排氣 O2分壓 排氣 CO2分壓 其他排氣成分 成分濃度 糖 氮 前體 誘導(dǎo)物 產(chǎn)物 中間代謝物 金屬離子 脫氫酶活力 各種酶活力 細(xì)胞內(nèi)成分 蛋白質(zhì) DNA RNA 成熟不成熟攪拌攪拌 間接參數(shù)間接參數(shù)攝氧率（攝氧率（OUROUR） 二氧化碳生成率（二氧化碳生成率（CERCE

3、R） 呼吸商（呼吸商（RQRQ） 總氧利用總氧利用 體積氧傳遞系數(shù)（體積氧傳遞系數(shù)（KLaKLa） 細(xì)胞濃度（細(xì)胞濃度（X X） 細(xì)胞生長(zhǎng)速率（細(xì)胞生長(zhǎng)速率（RxRx） 比生長(zhǎng)速率（）比生長(zhǎng)速率（） 細(xì)胞得率（細(xì)胞得率（Y YX/SX/S） 糖利用率糖利用率 氧利用率氧利用率 比基質(zhì)消耗率（比基質(zhì)消耗率（u u） 前體利用率前體利用率 產(chǎn)物量（產(chǎn)物量（P P） 比生產(chǎn)率（）比生產(chǎn)率（） 其他需要計(jì)算的值參數(shù)其他需要計(jì)算的值參數(shù) 功率、功率準(zhǔn)數(shù)功率、功率準(zhǔn)數(shù) 雷諾數(shù)雷諾數(shù) 細(xì)胞量細(xì)胞量 生物熱生物熱 碳平衡碳平衡 能量平衡能量平衡 生生理理參參數(shù)數(shù)案例分析案例分析:多拷貝畢赤酵母發(fā)酵多拷貝畢赤酵

4、母發(fā)酵 畢赤酵母（畢赤酵母（Pichia pastoris） 豬胰島素前體豬胰島素前體(Porcine insulin precursor,PIP)畢赤酵母研究背景畢赤酵母研究背景畢赤酵母簡(jiǎn)介畢赤酵母簡(jiǎn)介： 經(jīng)過二十多年的發(fā)展，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)已發(fā)經(jīng)過二十多年的發(fā)展，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)已發(fā)展成為外源蛋白表達(dá)最常用的表達(dá)系統(tǒng)之一，已展成為外源蛋白表達(dá)最常用的表達(dá)系統(tǒng)之一，已有超過五百種蛋白在該系統(tǒng)中成功表達(dá)。有超過五百種蛋白在該系統(tǒng)中成功表達(dá)。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)特點(diǎn)：畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)特點(diǎn)：真核系統(tǒng)真核系統(tǒng)受甲醇嚴(yán)格調(diào)控的強(qiáng)啟動(dòng)子（受甲醇嚴(yán)格調(diào)控的強(qiáng)啟動(dòng)子（P PAOX1AOX1，P PGAPGAP，

5、P PFLDFLD等）等）成熟的高密度培養(yǎng)技術(shù)成熟的高密度培養(yǎng)技術(shù) 高外源蛋白表達(dá)量（無論是胞內(nèi)還是胞外表達(dá)）高外源蛋白表達(dá)量（無論是胞內(nèi)還是胞外表達(dá)） 外源蛋白基因遺傳高穩(wěn)定性外源蛋白基因遺傳高穩(wěn)定性 重組蛋白表達(dá)策略重組蛋白表達(dá)策略高密度高密度防蛋白降解防蛋白降解分泌效率分泌效率翻譯效率翻譯效率轉(zhuǎn)錄水平轉(zhuǎn)錄水平高拷貝數(shù)高拷貝數(shù)高表達(dá)高表達(dá)Typical profiles of Pichia pastoris with MutS type工程植酸酶發(fā)酵過程特征跨尺度關(guān)聯(lián)分析工程植酸酶發(fā)酵過程特征跨尺度關(guān)聯(lián)分析 （1）：不同碳源不同碳源圖圖 3 葡萄糖為碳源時(shí)生長(zhǎng)階段發(fā)酵過程曲線圖葡萄糖為碳源

6、時(shí)生長(zhǎng)階段發(fā)酵過程曲線圖 圖圖4 甘油為碳源時(shí)生長(zhǎng)階段發(fā)酵過程曲線圖甘油為碳源時(shí)生長(zhǎng)階段發(fā)酵過程曲線圖 圖圖 葡萄糖為碳源時(shí)生長(zhǎng)階段發(fā)酵過程曲線圖葡萄糖為碳源時(shí)生長(zhǎng)階段發(fā)酵過程曲線圖 圖圖 甘油為碳源時(shí)生長(zhǎng)階段發(fā)酵過程曲線圖甘油為碳源時(shí)生長(zhǎng)階段發(fā)酵過程曲線圖 PART 1:r-Phytase工程植酸酶發(fā)酵過程特征跨尺度關(guān)聯(lián)分析工程植酸酶發(fā)酵過程特征跨尺度關(guān)聯(lián)分析 （2）：不同階段不同階段 圖圖 發(fā)酵不同時(shí)期發(fā)酵不同時(shí)期RQ值值 PART 1:r-Phytase圖圖7甘油為碳源時(shí)過渡階段發(fā)酵過程甘油為碳源時(shí)過渡階段發(fā)酵過程OUR和和DO曲線曲線 圖圖8 葡萄糖為碳源生長(zhǎng)時(shí)過渡階段發(fā)酵過程葡萄糖為

7、碳源生長(zhǎng)時(shí)過渡階段發(fā)酵過程OUR和和DO曲線曲線 圖圖 甘油為碳源時(shí)過渡階段發(fā)酵過程甘油為碳源時(shí)過渡階段發(fā)酵過程OUR和和DO 圖圖 葡萄糖為碳源生長(zhǎng)時(shí)過渡階段葡萄糖為碳源生長(zhǎng)時(shí)過渡階段OUR和和DO曲線曲線 工程植酸酶發(fā)酵過程特征跨尺度關(guān)聯(lián)分析工程植酸酶發(fā)酵過程特征跨尺度關(guān)聯(lián)分析 （3）：不同碳源啟動(dòng)時(shí)間不同碳源啟動(dòng)時(shí)間PART 1:r-Phytase工程植酸酶發(fā)酵過程特征跨尺度關(guān)聯(lián)分析工程植酸酶發(fā)酵過程特征跨尺度關(guān)聯(lián)分析 （4）：?jiǎn)?dòng)時(shí)間與強(qiáng)度啟動(dòng)時(shí)間與強(qiáng)度PART 1:r-PhytasePAOX ActivationStart inductionOUR/CER increase here

8、誘導(dǎo)階段主要代謝途徑關(guān)鍵酶酶學(xué)過程在線參數(shù)綜合分析誘導(dǎo)階段主要代謝途徑關(guān)鍵酶酶學(xué)過程在線參數(shù)綜合分析 糖酵解途徑中關(guān)鍵酶丙酮酸脫氫酶復(fù)合體（糖酵解途徑中關(guān)鍵酶丙酮酸脫氫酶復(fù)合體（PDCPDC）的活性）的活性 三羧酸循環(huán)中的關(guān)鍵酶異檸檬酸脫氫酶（三羧酸循環(huán)中的關(guān)鍵酶異檸檬酸脫氫酶（IDEIDE）活性）活性 HMPHMP途徑中的關(guān)鍵酶途徑中的關(guān)鍵酶6-P-6-P-葡萄糖脫氫酶葡萄糖脫氫酶( (G-6-PG-6-P) )活性活性 甲醇完全氧化代謝的甲醛脫氫酶甲醇完全氧化代謝的甲醛脫氫酶( (FADFAD) )、AOXAOX的活性的活性呈呈下降下降趨勢(shì)（趨勢(shì)（RQRQ：0.750.75）呈呈上升上升趨

9、勢(shì)（趨勢(shì)（RQRQ：0.75+0.50.75+0.5）6.1倍、倍、2.5倍倍 2.42.4倍、倍、5.15.1倍倍 甲醇濃度與、蛋白表達(dá)的關(guān)系甲醇濃度與、蛋白表達(dá)的關(guān)系00.20.40.60.811.20246810t/h乙醇氧化酶甲醛脫氫酶植酸酶活性植酸酶表達(dá)速率甲醇濃度甲醇消耗速率PAOX1強(qiáng)度與甲醇濃度關(guān)系：0.75g/LPAOX1啟動(dòng)與表達(dá)關(guān)系： 啟動(dòng)應(yīng)有一定強(qiáng)度（過渡階段）表達(dá)速率才能提高過高甲醇濃度的影響： 過高引起表達(dá)速率下降，同時(shí)加強(qiáng)甲醇完全氧化途徑，浪費(fèi)能量多拷貝基因菌株發(fā)酵過程特點(diǎn)多拷貝基因菌株發(fā)酵過程特點(diǎn) 圖圖 生長(zhǎng)階段與表達(dá)階段的耗氧比較生長(zhǎng)階段與表達(dá)階段的耗氧比較

10、低拷貝基因菌株與高拷貝基因菌株發(fā)酵比較低拷貝基因菌株與高拷貝基因菌株發(fā)酵比較 高拷貝菌株高拷貝菌株P(guān)IP2.0-1發(fā)酵過程圖發(fā)酵過程圖 低拷貝菌株低拷貝菌株YP99的發(fā)酵過程圖的發(fā)酵過程圖 重組蛋白表達(dá)策略重組蛋白表達(dá)策略高密度高密度防蛋白降解防蛋白降解分泌效率分泌效率翻譯效率翻譯效率轉(zhuǎn)錄水平轉(zhuǎn)錄水平高拷貝數(shù)高拷貝數(shù)高表達(dá)高表達(dá)拷貝數(shù)對(duì)外源蛋白表達(dá)的影響拷貝數(shù)對(duì)外源蛋白表達(dá)的影響正正效應(yīng)效應(yīng)CLARE, J. J. et al（1991）aMansur, M. et al（2005）Vassileva. et al（2001）Clare, J J. et al（1991）b胞內(nèi)表達(dá)胞內(nèi)表達(dá)分泌

11、表達(dá)分泌表達(dá)Hohenblum, H. et al（2004）Cos, O. et al（2005）Inan, M. et al（2006）30+30+拷貝數(shù)拷貝數(shù)拷貝數(shù)對(duì)外源蛋白表達(dá)的影響拷貝數(shù)對(duì)外源蛋白表達(dá)的影響負(fù)負(fù)效應(yīng)效應(yīng)如何優(yōu)化高拷貝數(shù)畢赤酵母菌外源蛋白表達(dá)如何優(yōu)化高拷貝數(shù)畢赤酵母菌外源蛋白表達(dá)策略？策略？Cos et al 2005Hohenblum et al 2004l外源蛋白折疊分泌能力下降外源蛋白折疊分泌能力下降 Hohenblum et al 2004; Inan et al 2006 高拷貝菌株構(gòu)建高拷貝菌株構(gòu)建6copy29copy重組畢赤酵母生長(zhǎng)與表達(dá)重組畢赤酵母生長(zhǎng)

12、與表達(dá)0102030405060708090 100 110050100150200250300350400OD600fermentation time (h) 1-copy 6-copy 12-copy 18-copy 0102030405060700100200300400500600700800PIP(mg/L)induction time (h) 1-copy 6-copy 12-copy 18-copy 多拷貝重組菌多拷貝重組菌OUR比較比較010203040506070809010011002040608010012014016018020001020304050607080901

13、0011002040608010012014016018020001020304050607080901001100204060801001201401601802000102030405060708090100110020406080100120140160180200OUR, CER(mmol.L-1.h-1)fermentation time (h) CER OUR RQ補(bǔ)料誘導(dǎo)1-copy-1.0-0.8-0.6-0.4-0.20.00.20.40.60.81.01.2RQ誘導(dǎo)補(bǔ)料RQOUR, CER(mmol.L-1.h-1)fermentation time (h) CER OUR

14、 RQ-1.0-0.8-0.6-0.4-0.20.00.20.40.60.81.01.26-copy補(bǔ)料誘導(dǎo)RQOUR, CER(mmol.L-1.h-1)fermentation time (h) CER OUR RQ-1.0-0.8-0.6-0.4-0.20.00.20.40.60.81.01.212-copy補(bǔ)料誘導(dǎo)RQOUR, CER(mmol.L-1.h-1)fermentation time (h) CER OUR RQ-1.0-0.8-0.6-0.4-0.20.00.20.40.60.81.01.218-copy0102030405060708090100110020406080

15、100120140160180200OUR(mmol.L-1.h-1)fermentation time（h） 1-copy 6-copy 12-copy 18-copy補(bǔ)料補(bǔ)料誘導(dǎo)誘導(dǎo)畢赤酵母在甲醇誘導(dǎo)時(shí)的代謝途徑示意圖畢赤酵母在甲醇誘導(dǎo)時(shí)的代謝途徑示意圖H2O2，ROOH， OH外源基因外源基因PIP的轉(zhuǎn)錄差異分析的轉(zhuǎn)錄差異分析PIP的轉(zhuǎn)錄水平增加與拷貝數(shù)成正比的轉(zhuǎn)錄水平增加與拷貝數(shù)成正比0 6 18蛋白伴侶基因的轉(zhuǎn)錄差異分析蛋白伴侶基因的轉(zhuǎn)錄差異分析PIP蛋白的合成通量也隨拷貝數(shù)的增加而增加了蛋白的合成通量也隨拷貝數(shù)的增加而增加了0 6 180 6 18抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄差異分析抗氧化基因

16、的轉(zhuǎn)錄差異分析高拷貝菌株可能受到氧化脅迫高拷貝菌株可能受到氧化脅迫0 6 180 6 18H2O2，ROOH， OH活性氧（活性氧（ROS）水平水平胞內(nèi)胞內(nèi)ROS和和GSH水平水平甲醇代謝途徑關(guān)鍵酶基因的轉(zhuǎn)錄差異分析甲醇代謝途徑關(guān)鍵酶基因的轉(zhuǎn)錄差異分析高拷貝菌株甲醇代謝途徑發(fā)生顯著變化高拷貝菌株甲醇代謝途徑發(fā)生顯著變化018601860186中心代謝途徑關(guān)鍵酶基因的轉(zhuǎn)錄差異分析中心代謝途徑關(guān)鍵酶基因的轉(zhuǎn)錄差異分析低拷貝菌株關(guān)鍵酶轉(zhuǎn)錄水平變化（與空白菌比）低拷貝菌株關(guān)鍵酶轉(zhuǎn)錄水平變化（與空白菌比）1.433.140.350.730.790.341.802.743.146.781.751.68高拷貝菌株關(guān)鍵酶轉(zhuǎn)錄水平變化（與空白菌比）高拷貝菌株關(guān)鍵酶轉(zhuǎn)錄水平變化（與空白菌比）氧化脅迫氧化脅迫甲醇代謝顯著變化甲醇代謝顯著變化 拷貝數(shù)對(duì)畢赤酵母生理代拷貝數(shù)對(duì)畢赤酵母生理代謝影響的轉(zhuǎn)錄差異分析謝影響的轉(zhuǎn)錄差異分析拷貝數(shù)增加拷貝數(shù)增加蛋白合成量增加蛋白合成量增加蛋白氧化折蛋白氧化折疊通量增加疊通量增加胞內(nèi)胞內(nèi)GSH大量消耗大量消耗酵母代謝甲醛酵母代謝甲醛能力降低能力降低細(xì)胞調(diào)控通過降細(xì)胞調(diào)控通過降低甲醇通量來減低甲醇通量來減少胞內(nèi)甲醛積累少胞內(nèi)甲醛積累細(xì)胞碳源能源細(xì)胞碳源能源供給不足供給不足（PDI1，KAR上升）（GSH水平下降）（ROS上升）（AOX1下降，F(xiàn)LD上升