研究生入學考試]酶學及酶工程ppt課件

1、酶學及酶工程酶學及酶工程Enzymology and Enzyme Engineering 田維熙 教授中國科學院研討生院第三章 酶的構造與功能第二節(jié) 酶的溶液構象測定續(xù)2. 熒光光譜 熒光：某些帶熒光基團的物質吸收特定波長激發(fā)光excitation能量，由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)。經(jīng)內(nèi)轉換耗損部分能量后，再回到低能級，放出波長較大的光，稱為熒光emission。產(chǎn)生熒光過程很快，約為108秒。停頓激發(fā)光后熒光隨之消逝。激發(fā)光和熒光都有特定波長，激發(fā)光相對效率和熒光強度構成激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。電子能級躍遷電子能級躍遷熒光分析法對熒光光譜及其變化進展分析，可以用于活性測定，構象變化測定，簡單構造測定，微

2、環(huán)境測定，必需基團測定等。熒光分析法的優(yōu)點：靈敏度高，選擇性強，樣品量少，方法簡單。運用范圍：有產(chǎn)生熒光的基團參與，普通是芳環(huán)，特別是稠芳環(huán)的基團。熒光強度公式熒光強度 FKI01eAK：儀器常數(shù)，：量子產(chǎn)率，I0：激發(fā)光強度，A：樣品吸光度A較小時，可以近似為FKI0A。A大到一定值時，F(xiàn)會隨A添加而減少，產(chǎn)生濃度淬滅景象。量子產(chǎn)率：表示物質發(fā)射熒光的身手，定義為發(fā)射量子數(shù)與吸收量子數(shù)之比。普通用熒光強度相對值：F1/F21A1/2A2。1為規(guī)范品，2為樣品。蛋白質的內(nèi)源熒光 來自芳香族氨基酸，主要是色氨酸和酪氨酸。280nm激發(fā)光，最大熒光在313nm酪氨酸和350nm色氨酸A類蛋白無色氨

3、酸，最大熒光發(fā)射波長304nm，來自酪氨酸，且位置不受大分子構象變化影響。B類蛋白質含酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸，最大熒光發(fā)射在320350nm范圍，位置和量子產(chǎn)率都與環(huán)境有關，受構象影響。蛋白質構象變化時外表酪氨酸和色氨酸發(fā)生變化，內(nèi)源熒光強度和峰位會變化，從而可探測蛋白質的構象變化。蛋白質的外源熒光熒光染料可與蛋白質共價結合，使蛋白分子帶上特定的熒光性質，稱為熒光探針。其對環(huán)境極性很敏感，在非極性環(huán)境中熒光很強，在極性溶劑中很弱。由其在各蛋白質分子中的熒光峰位、譜寬及量子產(chǎn)率可探測結合區(qū)的極性，獲得構象信息。苯胺萘磺酸染料是常用的熒光探針，氨基酸蛋白質結合后構成DNS氨基酸dansyl氨基酸

4、，具有相應熒光特性。常用熒光探針 熒光標志探測構象變化熒光分析續(xù)熒光胺是用于探測氨基形狀的熒光探針，可以和氨基酸迅速反響，靈敏度很高。熒光素醋酸汞用于用于探測二硫鍵：在1mol/L的NaOH中其熒光被二硫鍵淬滅。熒光標志蛋白質后，測定其熒光偏振可以了解和輔基、底物、抗原等的結合程度。結合越緊熒光偏振越大。也可以用于探測聚合和解離形狀。能量轉移帶熒光基團的給體分子吸收能量后激發(fā)，無受體存在時發(fā)射熒光前往基態(tài)。附近有受體時可將能量轉移給受體，受體激發(fā)后能夠發(fā)射本人特征熒光，稱敏化熒光；也能夠放熱不發(fā)熒光，稱熒光淬滅。轉移效率和兩基團間隔相關，可以測定分子基團間間隔。3. 園二色譜CD譜園二色譜是利

5、用不對稱分子對左、右園偏振光吸光不同進展構造分析的方法。蛋白質的二級構造：螺旋，折疊，轉角，無規(guī)卷曲具有不同的對稱性，因此可利用CD譜測定蛋白質的二級構造，從而也可測定構象變化。相互垂直的平面偏振光，振幅相等位相差/2時合成為園偏振光，右手螺旋旋轉的稱右偏振光，左手螺旋旋轉的為左偏振光。右旋園偏振光的合成左旋園偏振光的合成振幅強度不同，頻率一樣的左右偏振光合成橢圓偏振光，橢園度的正切為橢園短軸和長軸之比。園二色性的關系式橢圓度： = 0.25 AL-AR d A為偏振光振幅，d為介質長度。比橢圓度： = / c dC為介質濃度。摩爾橢圓度： = M/100 = 3300 為偏振光吸收差。園二色

6、譜與二級構造左、右園偏振光進入含不對稱分子的光學活性物質時，被吸收程度不同，因此從介質出來的光是橢園偏振光。其吸收差和波長有關。吸收差或橢園度可用園二色儀測定。橢園度與波長的關系稱園二色譜，各種二級構造有不同的園二色譜和特征峰位，因此園二色譜可用于測定二級構造。CD譜對二級構造變化很靈敏，常用于監(jiān)測構象變化。蛋白質中各種二級構造具有各自的特征園二色譜二級構造計算單值法計算螺旋殘基百分比：f=(208-4000)/(33000-4000)全值計算二級構造： f f fR 1 = f , + f , + fR ,R 假設一系列處的f，f，fR值，計算得到 對曲線，和測定結果比較，取擬合最好的數(shù)值。

7、蛋白質的構象變化呵斥二級構造改動時，園二色譜發(fā)生變化。從而可以測定去折疊變性和重折疊復性的形狀和變化4. 紅外光譜(RTIR)蛋白質在紅外區(qū)表現(xiàn)8個特征基團頻率。酰胺基團紅外光譜紅外光譜用于分析蛋白質二級構造已進入定量階段。最常用于二級構造分析的是酰胺I帶，位于16001700cm-1范圍。碳氧和氮氫間的氫鍵決議酰胺I帶振動頻率，反映特定二級構造。1986年Byler和Susi用二階導數(shù)和去卷積法分析，給出了各構象的特征酰胺I帶位置，確定了各子峰的歸屬。水溶液中酰胺I帶特征頻率指認重水中酰胺I帶特征頻率指認水在酰胺I帶有一定紅外吸收，因此也用重水中的指認提供進一步根據(jù)。去卷積譜和二階導數(shù)譜紅外

8、光譜:去卷積譜曲線擬合多種二級構造振動吸收峰重疊構成寬峰，難以區(qū)分。利用去卷積技術于傅立葉變換紅外光譜，可將其分解為多個子峰，定量分析各構象成分。紅外光譜:二級構造指認例對肌酸激酶Holo-酶和Apo-酶的FTIR酰胺I帶二級構造的指認結果。第三章 酶的構造與功能第三節(jié) 去折疊與重折疊研討1. 蛋白質折疊機制研討現(xiàn)代分子生物學基于以下的認識：一級構造決議高級構造，構造確定功能。即有了新生肽鏈就有相應的功能蛋白。新生肽鏈確定功能蛋白嗎？應該是一定的。否那么DNA就不能夠攜帶了全部遺傳信息。但是新生肽鏈如何確定的功能蛋白，卻不是想象的那么簡單。很多時候新生肽鏈并沒有正確折疊勝利能蛋白。因此正確折疊

9、也成為基因工程勝利的一個技術關鍵。這使折疊機制研討成為當前生物學熱點之一。折疊實際早期的二態(tài)實際：蛋白質存在未折疊和全折疊兩種形狀，折疊態(tài)的能量最低，熱力學規(guī)律使新生肽鏈只能迅速折疊成有活性的功能蛋白。適用于小型球蛋白。中間態(tài)，無活性穩(wěn)定態(tài)的發(fā)現(xiàn)突破了二態(tài)實際。在大量較大蛋白中發(fā)現(xiàn)了折疊中間態(tài)，如熔球態(tài)，有根本的三級構造，但較松散，無活性。產(chǎn)生了折疊的多態(tài)階段實際。進一步提出新生肽鏈功能蛋白應作為中心法那么的一個階段的假說。變性復性研討由蛋白質生物合成開場研討折疊存在技術上的困難。將功能蛋白去折疊再重折疊，又稱變性復性，是當前研討蛋白折疊的主要方法。目前以為，去折疊和重折疊遵照互逆的同一途徑。

10、變性成為研討折疊最簡便的方法。胍、脲、外表活性劑是最主要的完全變性劑。鹽、有機溶劑、pH、高溫等也作為變性方法運用。協(xié)助復性方法包括控制溫度、pH、速度，運用分子伴侶，滲壓劑osmolytes等。2.研討實例動物脂肪酸合酶是一個典型多功能復合酶熒光分析表現(xiàn)脂肪酸合酶的胍變性存在兩階段構造變化過程。紫外差光譜，園二色譜研討也表現(xiàn)了兩個構象變化階段。但在整體構象發(fā)生變化之前，該酶已不可逆失活。巰基暴露測定肽鏈折疊和展開形狀不同時，暴露在外的可作用巰基數(shù)目不同。測定可作用巰基是一個簡單易行的實驗，且可延續(xù)測定巰基的作用，因此可用于測定構象的變化，肽鏈的展開過程。測定巰基采用DTNB，與SH很快作用：

11、 TNB-S-S-TNB + R-SH TNB-SH + R-S-S-TNB產(chǎn)物TNB在412nm處有很強光吸收，而DTNB沒有。在412nm測定光吸收即可測知可作用SH數(shù)，且可在作用過程中延續(xù)監(jiān)測。需測定快速作用過程時還可運用stopped-flow等方法。通常采用2個數(shù)量級以上過量的DTNB與酶作用。巰基暴露實驗表現(xiàn)該酶三級構造翻開和其它方法測定的第一階段整體構象變化同步發(fā)生。不可逆失活測定闡明，該酶全反響的失活先于單獨功能構造域的失活。在很低胍濃度下該酶的全反響活性和兩個單獨復原中心活性同步被可逆抑制，且先于不可逆抑制的發(fā)生。討論以上結果闡明，F(xiàn)AS的胍變性為多階段構象變化。按胍濃度由低

12、到高，F(xiàn)AS的構象變化依次為：可逆抑制，全反響的不可逆失活，組成酶的不可逆失活，整體構象變化I，整體構象變化?？蓽y定的變化階段明顯多于較小分子的核糖核酸酶，肌酸激酶等。1. 可逆抑制。胍對FAS全反響及二個單獨復原反響的可逆抑制程度相仿，表現(xiàn)了其抑制發(fā)生于組成酶的活性部位。測定闡明抑制為非競爭性，能夠是對活性部位構象的微擾呵斥的。 討論續(xù)2.全反響的不可逆失活。該失活速度大大高于組成酶的失活，因此其失活不是由于活性部位不可逆構象變化呵斥的，很能夠是由于復合酶整體的不可逆的構象變化呵斥各活性部位相對位置變化呵斥的。3.組成酶的不可逆失活。全反響和單獨復原反響胍失活的終態(tài)活性類似闡明該失活的緣由為活性部位的不可逆構象變化呵斥。 討論續(xù)4.整體構象變化I。此階段巰基已根本暴露，紫外差光譜變化已根本到位，但CD譜變化還較小，表現(xiàn)此階段三級構造已翻開，二級構造還根本堅持。5.整體構象變化II。此階段各項測定的變化值均已到位，二級構造已破壞，蛋白分子完全去折疊。此時胍的濃度大約為3mol/L。討論續(xù)胍失活的FAS不能直接稀釋復活，反映了FAS折疊和去折疊一樣也是分階段進展的，不同階段進展