2015初始污染菌實驗方法驗證

1、初始污染菌實驗方法驗證方案產(chǎn)品名稱：一次性包皮環(huán)切縫合器日期：日期：日期：#狼和醫(yī)療器械股份限#目錄初始污染菌實驗方法驗證方案1. 概述2. 驗證目的3. 職責(zé)與驗證申請4. 驗證依據(jù)5. 驗證計劃6. 驗證內(nèi)容初始污染菌實驗方法驗證方案1. 概述：初始污染菌的數(shù)量可以反映出車間環(huán)境衛(wèi)生的清潔度，與產(chǎn)品滅菌工藝、成品熱原與內(nèi)毒素有直接關(guān)系，故而要對其檢測方法進行驗證，確認(rèn)其有效性與檢測準(zhǔn)確性 從而優(yōu)化產(chǎn)品滅菌工藝與控制產(chǎn)品熱原與內(nèi)毒素，確保產(chǎn)品的安全性2. 目的：通過實驗驗證檢測方法的適用性與計數(shù)用培養(yǎng)基的適用性 .3. 職責(zé)與驗證申請：3.1質(zhì)量管理部提供檢測項目方案、接收標(biāo)準(zhǔn)、評價等級與相

2、關(guān)實驗3.2生產(chǎn)技術(shù)部負(fù)責(zé)按驗證方案生產(chǎn)相關(guān)樣品初始污染菌實驗方法驗證申請表驗證組#職務(wù)單位黃燕組長質(zhì)量管理部經(jīng)理掰狼和醫(yī)療器械股份#龍章宏組員化驗員蘇俊組員化驗員胡梓鵬組員化驗員批準(zhǔn)經(jīng)研究：同意以上成員組成驗證小組，按照此方案對本公司的產(chǎn)品的初始污染菌實驗方法 進行驗證.批準(zhǔn)人：年 月日4. 依據(jù)：中國藥典2015版5. 驗證計劃：5.1實驗操作人員確認(rèn)；5.2實驗室實驗設(shè)備與器材的確認(rèn)；5.3產(chǎn)品取樣與方法確認(rèn).6. 驗證內(nèi)容：6.1菌種和菌液制備6.1.1菌種試驗用菌株的傳代次數(shù)不得超過 5代從菌種保藏中心獲得的干燥菌種為第 0代，并 采用適宜的菌種保藏技術(shù)進行保存，以保證試驗菌株的生物

3、學(xué)特性.6.1.2菌液制備接種金色葡萄球菌、銅綠假胞菌、枯草芽抱桿菌的培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基 中或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上,30? 35E培養(yǎng)18? 24小時；接種白色念珠菌的培養(yǎng)物至 沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上,20? 25 培養(yǎng)2-3天，上述培養(yǎng)后的新鮮培養(yǎng)物用PH7.0無菌化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌化鈉溶液制成每Iml菌數(shù)小 于100cfu菌落形成的菌懸液.接種黑曲霉的培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂面培養(yǎng)基上，20? 25r培養(yǎng)5? 7天，加人3? 5 ml 0.05%ml/ml聚山梨酯80的pH7.0無菌化鈉-蛋白 胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液，將抱子洗脫.然

4、后，采用適宜的方法吸出抱子懸液至無 菌試管內(nèi)，用0.05% ml/ml聚山梨醋80的pH7.0無菌化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌 氯化鈉溶液制成每lml抱子數(shù)量小于100cfu的抱子懸液.菌懸液若在室溫下放置，應(yīng)在2小時內(nèi)使用；若保存在2? 8 C在24h內(nèi)使用.黑曲 霉抱子懸液存在2? 8°C,在驗證過的貯存期內(nèi)用.6.2計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查6.2.1 需氧菌的計數(shù)分別取 1ml 的金色葡萄球菌、銅綠假胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各 菌懸液, 接種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基管或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板 . 金色葡萄球菌、 銅綠假胞菌、枯草芽抱桿菌在30-35 C ,培養(yǎng)不超

5、過3天；白色念珠菌、黑曲霉在20-25 C , 培養(yǎng)不超過 5 天. 每一試驗菌株平行制備 2 管或 2 個平皿 .同時, 用相應(yīng)的對照培養(yǎng)基替 代被檢培養(yǎng)基進行上述試驗 .6.2.2 霉菌和酵母菌的計數(shù)分別取 1ml 的白色念珠菌、黑曲霉各菌懸液 ,接種至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 .在 20-25 C ,培養(yǎng)不超過5天.每一試驗菌株平行制備2管或2個平皿.同時,用相應(yīng)的對照 培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進行上述試驗 .6.2.2 結(jié)果判定被檢固體培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)與對照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的比值應(yīng)在0.5-2范圍內(nèi) , 且菌落形態(tài)大小應(yīng)與對照培養(yǎng)基上的菌落一致；被檢液體培養(yǎng)基管與對照培養(yǎng) 基管比較 ,

6、 試驗菌應(yīng)生長良好 .6.2.3 試驗結(jié)果見表 16.3 計數(shù)方法驗證6.3.1 供試液的制備：洗脫液用 0.9%的滅菌生理鹽水 , 檢品液制備在 10000級環(huán)境中進行 .6.3.2 接種和稀釋按下列要求進行供試液的接種和稀釋 , 制備微生物回收試驗用供試液 . 所加菌液的 體積應(yīng)不超過供試液體積的 1%.為確認(rèn)供試品中的微生物能被充分檢出 , 首先應(yīng)選擇最 低稀釋級的供試液進行計數(shù)方法適用性試驗 .1試驗組 取上述制備好的供試液 , 加入試驗菌液 , 混勻, 使每 1ml 供試液或每張 濾膜所濾過的供試液中含菌量不大于 100cfu.2供試品對照組 取制備好的供試液 , 以稀釋液代替菌液同

7、試驗組操作 .3菌液對照組 取不含中和劑與滅活劑的相應(yīng)稀釋液替代供試液 , 按試驗組操作 加入試驗菌液并進行微生物回收試驗 .若因供試品抗菌活性或溶解性較差的原因?qū)е聼o法選擇最低稀釋級的供試液進行 方法適用性試驗時 , 應(yīng)采用適宜的方法對供試液進行進一步的處理 . 如果供試品對微生 物生長的抑制作用無法以其他方法消除 , 供試液可經(jīng)過中和、稀釋或薄膜過濾處理后再 加入試驗菌懸液進行方法適應(yīng)性試驗 .6.3.3 抗菌活性的去除或滅活供試液接種后 , 按下列 "微生物回收 " 規(guī)定的方法進行微生物計數(shù) . 若試驗組菌落數(shù) 減去供試品對照組菌落數(shù)的值小于菌液對照組菌數(shù)值的50%,

8、可采用下述方法消除供試品的抑菌活性 . 增加稀釋液或培養(yǎng)基體積 . 加入適宜的中和劑或滅活劑 .6.3.4 微生物的回收按照 6.2 的計數(shù)培養(yǎng)基所用的試驗菌逐一進行微生物回收試驗 , 回收試驗采用平皿 法和薄膜過濾法 .6.3.4.1 平皿法- 傾注法取6個直徑90mm的無菌平皿.2個分別注入照上述"試驗組"制備的供試液1ml;2個分別注入照上述"供試品對照組"制備的供試液1ml； 2個分別注入照上述"菌液 對照組"制備的供試液1ml.每個平皿注入1520ml溫度不超過45C熔化的胰酪大豆胨 瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 ,混勻,凝固

9、,倒置培養(yǎng).計算各試驗組的平均菌落數(shù) .6.3.4.2 平皿法試驗結(jié)果見表 26.3.4.3 薄膜過濾法薄膜過濾法所采用的濾膜孔徑應(yīng)不大于 0.45卩m,直徑一般為50mm若采用其他直 徑的濾膜 , 沖洗量應(yīng)進行相應(yīng)的調(diào)整 . 選擇濾膜材質(zhì)時應(yīng)保證供試品與其溶劑不影響微 生物的充分被截留 .濾器與濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法滅菌 .使用時,應(yīng)保證濾膜在過 濾前后的完整性 . 供試液經(jīng)薄膜過濾后 , 若需要用沖洗液沖洗濾膜 , 每張濾膜每次沖洗量 一般為100ml.總沖洗量不得超過1000ml,以避免濾膜上的微生物受損傷.取照上述 " 試驗組"、"供試品對照組 &qu

10、ot;和"菌液對照組"制備的供試液適量一般取 相當(dāng)于1g、1ml或10cm2的供試品，若供試品中所含的菌數(shù)較多時，供試液可酌情減量 加至適量的稀釋液中 ,混勻,過濾.用適量的沖洗液沖洗濾膜 .每株試驗菌每種培養(yǎng)基至 少制備一張濾膜 .若測定需氧菌總數(shù) , 轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上；若測定 霉菌和酵母總數(shù) , 轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上 .6.3.4.4 薄膜過濾法計數(shù)方法驗證實驗結(jié)果見表 3初始污染菌實驗方法驗證報告 報告編號： 報告時間：目錄初始污染菌實驗方法驗證報告1、目的2、概述3、測試方法與試驗結(jié)果4、結(jié)論5、重新驗證條件1

11、. 目的：參照中國藥典2015版,通過實驗驗證檢測方法的適用性與計數(shù)用培養(yǎng)基的適用 性,從而驗證現(xiàn)在使用初始污染菌實驗方法是否準(zhǔn)確合格2. 概述：產(chǎn)品型號為26型：批號為：201501013. 測試方法與檢驗結(jié)果：3.1實驗設(shè)備與器材：該實驗使用儀器與器具主要有：滅菌移液管與移液槍吸嘴、無菌小泵管、培養(yǎng)皿、小型蠕動泵、薄膜過濾器、滅菌鍋、百級工作臺、生物安全柜、電子天平、電熱恒溫培養(yǎng)箱、霉菌培養(yǎng)箱設(shè)備名稱是否校量是否在有效期內(nèi)結(jié)論火菌鍋已校量在有效期內(nèi)符合要求百級工作臺已校量在有效期內(nèi)符合要求生物安全柜已校量在有效期內(nèi)符合要求電子天平已校量在有效期內(nèi)符合要求電熱恒溫培養(yǎng)箱已校量在有效期內(nèi)符合要

12、求霉菌培養(yǎng)箱已校量在有效期內(nèi)符合要求確認(rèn)人/日期：審核/日期：3.2使用材料與菌種：胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、胰酪大豆胨瓊脂培對照養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂 對照培養(yǎng)基、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌 種購買單位均為微生物種質(zhì)資源庫3.3菌液制備：接種金色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽抱桿菌的培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上,30? 35E培養(yǎng)18? 24小時；接種白色念珠菌的培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上,20? 25 培養(yǎng)2-3天，上述培養(yǎng)后的新鮮培養(yǎng)物用

13、PH7.0無菌化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌化鈉溶液制成每Iml菌數(shù) 小于100cfu<菌落形成的菌懸液.接種黑曲霉的培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂面培養(yǎng)基 上,20? 25E培養(yǎng)5? 7天，加人3? 5 ml 0.05%<ml/ml> 聚山梨酯80的pH7.0無菌化鈉- 蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液,將抱子洗脫.然后,采用適宜的方法吸出抱子懸液 至無菌試管內(nèi),用0.05% <ml/ml>聚山梨醋80的pH7.0無菌化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9% 無菌氯化鈉溶液制成每lml抱子數(shù)量小于100cfu的抱子懸液.菌懸液若在室溫下放置,應(yīng)在2小時內(nèi)使用；若保存在2? 8

14、 C在24h內(nèi)使用.黑曲 霉抱子懸液存在2? 8°C,在驗證過的貯存期內(nèi)用.3.4培養(yǎng)基適用性檢查3.4.1需氧菌的計數(shù)分別取1ml的金色葡萄球菌、銅綠假胞菌、枯草芽抱桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各 菌懸液,接種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基管或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板.金色葡萄球菌、銅綠假胞菌、枯草芽抱桿菌在30-35 C ,培養(yǎng)不超過3天；白色念珠菌、黑曲霉在20-25 C , 培養(yǎng)不超過5天.每一試驗菌株平行制備2管或2個平皿.同時,用相應(yīng)的對照培養(yǎng)基替 代被檢培養(yǎng)基進行上述試驗.3.4.2霉菌和酵母菌的計數(shù)分別取1ml的白色念珠菌、黑曲霉各菌懸液 ，接種至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基.在 20-

15、25 C ,培養(yǎng)不超過5天.每一試驗菌株平行制備2管或2個平皿.同時,用相應(yīng)的對照 培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進行上述試驗.結(jié)果判定被檢固體培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)與對照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的比值應(yīng)在0.5-2范圍內(nèi),且菌落形態(tài)大小應(yīng)與對照培養(yǎng)基上的菌落一致；被檢液體培養(yǎng)基管與對照培養(yǎng) 基管比較,試驗菌應(yīng)生長良好.試驗結(jié)果見表1表1加入菌種培養(yǎng)條件培養(yǎng)基菌落數(shù)cfu結(jié)論胰酪大豆胨瓊脂培 養(yǎng)基胰酪大豆胨瓊脂對照鋰傘甘培養(yǎng)基胰酪大豆胨瓊脂 培養(yǎng)基/胰酪大豆 胨瓊脂對照培養(yǎng)基銅綠假單胞菌平均值金黃色葡萄球菌33 C ,48平均值小時菌落形枯草芽抱桿菌態(tài)大小于對平均值照培養(yǎng)基上白色念珠菌的菌洛一致平均值23 C

16、 ,72黑曲霉小時平均值加入菌種培養(yǎng)條件培養(yǎng)基菌落數(shù)cfu沙氏葡萄糖瓊脂 培養(yǎng)基/沙氏葡萄 糖瓊脂對照培養(yǎng) 基結(jié)論沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基沙氏葡萄糖瓊脂對照培養(yǎng)基白色念珠菌23 C ,72小時菌落形 態(tài)大小于對 照培養(yǎng)基上 的菌洛一致平均值黑曲霉平均值結(jié)論：從以上檢測結(jié)果可知，上述批號的培養(yǎng)基適用性檢查符合要求，可用于日常產(chǎn)品檢測中的計數(shù) .驗證人/日期：審核/日期：3.5計數(shù)方法驗證3.5.1供試液的制備：洗脫液用0.9%的滅菌生理鹽水,檢品液制備在10000級環(huán)境中進行.3.5.2接種和稀釋按下列要求進行供試液的接種和稀釋，制備微生物回收試驗用供試液.所加菌液的 體積應(yīng)不超過供試液體積的 1%

17、.為確認(rèn)供試品中的微生物能被充分檢出，首先應(yīng)選擇最 低稀釋級的供試液進行計數(shù)方法適用性試驗.1試驗組 取上述制備好的供試液，加入試驗菌液，混勻,使每1ml供試液或每張 濾膜所濾過的供試液中含菌量不大于100cfu.2供試品對照組 取制備好的供試液，以稀釋液代替菌液同試驗組操作.3菌液對照組 取不含中和劑與滅活劑的相應(yīng)稀釋液替代供試液，按試驗組操作加入試驗菌液并進行微生物回收試驗.若因供試品抗菌活性或溶解性較差的原因?qū)е聼o法選擇最低稀釋級的供試液進行 方法適用性試驗時，應(yīng)采用適宜的方法對供試液進行進一步的處理.如果供試品對微生 物生長的抑制作用無法以其他方法消除，供試液可經(jīng)過中和、稀釋或薄膜過濾

18、處理后再 加入試驗菌懸液進行方法適應(yīng)性試驗.3.5.3抗菌活性的去除或滅活供試液接種后，按下列"微生物回收"規(guī)定的方法進行微生物計數(shù).若試驗組菌落數(shù) 減去供試品對照組菌落數(shù)的值小于菌液對照組菌數(shù)值的50%可采用下述方法消除供試品的抑菌活性.增加稀釋液或培養(yǎng)基體積. 加入適宜的中和劑或滅活劑.3.5.4 微生物的回收按照6.2的計數(shù)培養(yǎng)基所用的試驗菌逐一進行微生物回收試驗，回收試驗采用平皿 法和薄膜過濾法.3.541 平皿法-傾注法取6個直徑90mm的無菌平皿.2個分別注入照上述"試驗組"制備的供試液1ml;2個分別注入照上述"供試品對照組&qu

19、ot;制備的供試液1ml； 2個分別注入照上述"菌液 對照組"制備的供試液1ml.每個平皿注入1520ml溫度不超過45C熔化的胰酪大豆胨 瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻,凝固，倒置培養(yǎng).3.5.4.2平皿法試驗結(jié)果見表2表2一次性包皮環(huán)切縫合器樣品1一次性包皮環(huán)切縫合器樣品1一次性包皮環(huán)切縫合器樣品1沖洗一次263025沖洗二次042沖洗三次000沖洗四次000回收率100%88.3%92.6%平均回收率93.7%修正系數(shù)1.07結(jié)論：以上產(chǎn)品各做三套平均回收率達 80%以上 , 一次回收率達到要求.正常試驗中可米用沖洗一次后*回收系數(shù)進行估算.試驗人/日期：審核/日期3.5.4.3 薄膜過濾法薄膜過濾法所采用的濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45卩m,直徑一般為50mm若采用其他直徑的濾膜，沖洗量應(yīng)進行相應(yīng)的調(diào)整.選擇濾膜材質(zhì)時應(yīng)保證供試品與其溶劑不影響微 生物的充分被截留.濾器與濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法滅菌.使用時,應(yīng)保證濾膜在過 濾前后的完整性.供試液經(jīng)薄膜過濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量 一般為100ml.總沖洗量不得超過1000ml,以避免濾膜上的微生物受損傷.取照上述"試驗組"、"供試品對照組"和"菌液對照組"制備的供試液適量一般取 相當(dāng)于1g、1ml或10