黑皮質素4型受體在神經病理性疼痛中的作用ppt課件

1、黑皮質素4型受體在神經病理性疼痛中的作用青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院麻醉科褚海辰 引言引言神經病理性疼痛的構成機制神經元神經元神經膠質細胞神經膠質細胞 引言n不斷以來，“神經元論在神經病理性疼痛機制的研討中占據了統治位置。n近年來，對星形膠質細胞的深化研討闡明，其細胞膜上存在著大量離子通道、神經遞質的受體，且其激活后可以產生和釋放多種神經活性物質，在慢性疼痛的開展過程中起著重要的作用。 引言引言 外周外周神經神經損傷損傷星形星形膠質膠質細胞細胞激活激活能夠是疼痛神經遞質、能夠是疼痛神經遞質、神經調質、趨化因子神經調質、趨化因子如如 EAAs、ATP、P物物質、質、CGRP、NO、PGs、fracta

2、lking ？nHS014是一種選擇性4-型黑皮質素受體(MC4R)拮抗劑。n近年來研討闡明，黑皮質素肽類MC參與神經病理性疼痛的調理，且其主要是經過MC4R實現的。n 引言引言引言研討闡明，在多種神經病理性疼痛實驗中，外周或中樞包括鞘內和腦室內給予MC4R激動劑-MSH 和ACTH可致痛覺過敏。而其拮抗劑HS014和SHU9119那么可產生抗痛覺過敏作用。引言引言 MC4R神經神經病理病理性疼性疼痛痛詳細機制？詳細機制？ 引言n隨著星形膠質細胞在神經病理性疼痛中的重要作用的認識，且神經元和星形膠質細胞既表達MC4R也分泌其內源性激動劑-MSH。引言引言神經病理性疼痛神經病理性疼痛MC4R調理

3、星形膠質調理星形膠質細胞的活性以細胞的活性以及促炎性因子及促炎性因子的表達的表達推測：推測：n為了證明以上推測：我們分別從細胞程度和動物程度在脊髓和腦主要是中腦導水管周圍灰質,PAG兩個部位對MC4R在膠質細胞的激活及其損傷性物質的釋放中的作用進展了研討。實驗設計分兩部進展：實驗一：從細胞方面研討了黑皮質素4型受體在大鼠脊髓星形膠質細胞釋放興奮性氨基酸中的作用實驗二：從動物程度研討了中腦導水管周圍灰質PAG4型黑皮質素受體在慢性坐骨神經壓迫損傷引起膠質細胞激活及炎性因子分泌中的作用 察看察看MC4RMC4R拮抗劑拮抗劑HS014HS014對對腫瘤壞死因子對對腫瘤壞死因子( TNF-)( TNF

4、-)激活的脊髓激活的脊髓ASTAST和嗎啡慢性處置和嗎啡慢性處置的脊髓的脊髓ASTAST釋放釋放EAAEAA的影響，以期闡明的影響，以期闡明HS014HS014在在抑制疼痛和嗎啡耐受與戒斷反響過程中能夠抑制疼痛和嗎啡耐受與戒斷反響過程中能夠的作用機制。的作用機制。實驗一實驗一第一部分：脊髓星形膠質細胞的體外原代培育及鑒定第一部分：脊髓星形膠質細胞的體外原代培育及鑒定第三部分：第三部分：HS014對被激活的星形膠質細胞釋放興奮性對被激活的星形膠質細胞釋放興奮性氨基酸的影響氨基酸的影響第二部分：高效液相第二部分：高效液相-串聯四級桿質譜串聯四級桿質譜(HPLC-MS/MS)方方法檢測興奮性氨基酸釋

5、放法檢測興奮性氨基酸釋放第四部分：第四部分：HS014對嗎啡慢性處置的星形膠質細胞釋放對嗎啡慢性處置的星形膠質細胞釋放谷氨酸的影響谷氨酸的影響 實驗動物n 1-2天新生Wistar大鼠，每批3-5只，清潔級。 主要試劑nDMEM/F12 Hyclone公司，美國n胰蛋白酶 SIGMA公司，美國nNeurobasal無血清培育液 Gibco公司，美國 nB27神運營養(yǎng)生長因子 Gibco公司，美國n10%特優(yōu)胎牛血清 民海生物工程n單克隆兔抗鼠GFAP抗體 武漢博士德生物工程n封鎖用正常山羊血清 北京中杉nFITC標志山羊抗兔IgG 北京中杉n多聚賴氨酸 Sigma公司，美國n谷氨酸規(guī)范品 Dr

6、.Ehrenstorfer公司，德國n天門冬氨酸規(guī)范品 Dr.Ehrenstorfer公司，德國n乙腈 Merk公司，色譜純試劑n醋酸銨 ACROS公司，分析純試劑n納洛酮 Sigma公司，美國n嗎啡 沈陽第一制藥廠n腫瘤壞死因子TNF- Peptotech公司，美國nHS014 Phoenix Pharmaceutical公司，美國脊髓星形膠質細胞原代培育及鑒定脊髓星形膠質細胞原代培育及鑒定 原代培育的原代培育的WistarWistar大鼠脊髓大鼠脊髓ASTAST接種后，細胞貼壁很固，突擊光滑粗大，胞接種后，細胞貼壁很固，突擊光滑粗大，胞體較大，胞質較豐富，外形不規(guī)那么，折光性差，細胞邊境清

7、楚，隨著細體較大，胞質較豐富，外形不規(guī)那么，折光性差，細胞邊境清楚，隨著細胞數目增多細胞間相互交叉呈網狀，但細胞立體性不強，所以鏡下層次感胞數目增多細胞間相互交叉呈網狀，但細胞立體性不強，所以鏡下層次感不強。不強。星形膠質細胞免疫熒光鑒定細胞高表達星形膠質細胞的標志性蛋白(GFAP)，發(fā)綠色熒光，藍光是DAPI復染的細胞核。HPLC-MS/MS方法檢測EAA n 建立了一種快速測定星形膠質細胞建立了一種快速測定星形膠質細胞上清中興奮性氨基酸釋放的高效液相上清中興奮性氨基酸釋放的高效液相-串串聯四級桿質譜聯四級桿質譜HPLC-MS/MS方法。方法。運用高效液相運用高效液相-串聯四極桿質譜的多反響

8、串聯四極桿質譜的多反響監(jiān)測監(jiān)測MRM方式快速測定星形膠質細方式快速測定星形膠質細胞胞AST興奮性氨基酸興奮性氨基酸EAAs的釋的釋放量。按照擬定的檢測方法，檢測結果放量。按照擬定的檢測方法，檢測結果如下：如下： 圖1混合對照品TIC(1-天門冬氨酸，2-谷氨酸)HS014對被激活的星形膠質細胞釋放興奮性氨基酸的影響組別 谷氨酸天門冬氨酸C 組 3.1050.531 0.3360.047 T 組 10.1330.823* 1.1840.091* TH0.1組 6.9210.777# 0.7200.093# TH1 組 2.9120.4333# 0.4270.053# TH10組 2.2850.3

9、75# 0.2370.029# 與C組比，* P0.01，與T組比，# P0.01表2 各組細胞興奮性氨基酸的釋放量 mol/L，n=6，s HS014對被激活的星形膠質細胞釋放興奮性氨基酸的影響n采用液相質譜聯用法HPLC-MS/MS檢測上清液中興奮性氨基酸的含量結果見表2, 與C組比較，T組Glu和Asp釋放量有顯著性差別P0.01與T組比較，TH0.1,TH1和TH10組Glu和Asp釋放量顯著減少P0.01，并隨著HS014預處置量的添加而逐漸減少。 組別0min30min60min120min對照組3.1340.432 3.2190.724 3.2570.437 3.3470.482

10、 A組3.0570.675 3.2530.489 3.3520.576 3.5350.319 B組3.1780.578 4.5750.549*# 6.5280.527* 8.5150.735*# C組3.0790.512 3.2350.648 3.5350.762 3.8650.378 與A組比較，*P0.05，*P0.01；與B組比較，#P0.01，#P0.01表3 HS014和納洛酮對星形膠質細胞釋放谷氨酸的影響mol/L，n=6，sHS014對嗎啡慢性處置的星形膠質對嗎啡慢性處置的星形膠質細胞釋放谷氨酸的影響細胞釋放谷氨酸的影響1 HS014可以減少TNF-激活的脊髓星形膠質細胞時Glu

11、和Asp的釋放量。2嗎啡慢性處置的星形膠質細胞細胞后，Glu釋放明顯增多，納洛酮可以添加Glu釋放，HS014能抑制該反響。HS014對對CCI大鼠中腦導水管周圍灰大鼠中腦導水管周圍灰質星形膠質細胞激活及細胞因子表質星形膠質細胞激活及細胞因子表達的影響達的影響實驗二研討目的研討目的檢測GFAPCCI檢測檢測 IL-1 TNF-熱痛閾值測定HS014討論討論HS014對神經病理性疼痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用及對神經病理性疼痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用及PAG中星形膠質細中星形膠質細胞的激活和炎性因子表達的影響。胞的激活和炎性因子表達的影響。 實驗分組實驗分組PAG置管后置管后7天天假手術組假手術組A組，組，n=25只

12、只CCI對照組對照組B組，組，n=25只只CCI治療組治療組C組，組，n=25只只 實驗分組假手術組CCI對照組 CCI治療組 -1h0d1d14d-1h 0d1d14d-1h 0d 1d14dHS0145ug/0.5ul/只，每24h一次，延續(xù)注射至術后14d)CCI術后3d7d7d3d3d7dNS0.5ul/次，每24h一次，延續(xù)注射至術后14d) 實驗步驟CCI模型制備模型制備熱痛閾值測定熱痛閾值測定GFAP檢測檢測IL-1和和TNF-檢測檢測PPAG置管大鼠大鼠PAG置管置管固定于腦立固定于腦立體定位儀體定位儀 牙托粉固定牙托粉固定大鼠麻醉大鼠麻醉暴露顱骨暴露顱骨PAG置管置管單籠喂養(yǎng)

13、單籠喂養(yǎng)注：注：PAG單側：單側：(AP 7.68，L0.6，H6.0 mm) 埋植不銹鋼埋植不銹鋼套管套管(長長11mm，外徑，外徑0.6mm)。套管尖端高于注射部位。套管尖端高于注射部位1.5mm，套管內插入等長不銹鋼管芯。，套管內插入等長不銹鋼管芯。 PAG微量注射微量注射 用1ul微量注射器經過注射內管PAG注射 HS014或NS，每次注射容量均0.5ul，1min內勻速注完，留針1min，防止藥液外漏. 大鼠CCI模型的制備剪去體毛剪去體毛消毒右下肢消毒右下肢逐層縫合逐層縫合切口切口大鼠麻醉大鼠麻醉暴露坐骨暴露坐骨神經主干神經主干結扎坐骨結扎坐骨神經神經單籠喂養(yǎng)單籠喂養(yǎng)注：坐骨神經結

14、扎：用注：坐骨神經結扎：用4-0的鉻制羊腸線松扎的鉻制羊腸線松扎4道道, 間距為間距為1mm, 結扎強度以引起小腿肌肉輕度顫抖反響為宜。結扎強度以引起小腿肌肉輕度顫抖反響為宜。熱痛閾值測定熱痛閾值測定 大鼠于術前及術后1，3，7，11，14天, 給藥后60min內，采用熱板測痛儀測試大鼠的熱痛閾值。 結果 熱痛閾值變化熱痛閾值變化注：與術前比較，注：與術前比較，*P0.05 , *P0.01; 與與B組比較組比較, #P0.05, #P0.01C組C組C組分組 術前0d 術后1d 術后3d 術后7d 術后14d A 0.160.03 0.160.03 0.140.02 0.150.02 0.1

15、50.03 B 0.140.02 0.150.02 0.250.03* 0.330.05* 0.430.06* C 0.150.04 0.150.03 0.200.03*# 0.260.02*# 0.220.04*# 各組術后不同時間點各組術后不同時間點GFAP的表達的表達 (x s ) 注：與術前比較，注：與術前比較，*P0.05 ，*P0.01 ; 與與B組比較組比較, #P 0.05， #P 0.01 各組術后不同時間點各組術后不同時間點GFAP的表達的表達 各組各組PAG中中GFAP的表達的表達 SABC 染色染色 400B3B7A3A7A14B14C3C7C14 各組術后不同時間點各

16、組術后不同時間點IL-1的表達的表達 ( s) 分組 術前0d 術后1d 術后3d 術后7d 術后14dA 10.803.77 11.002.12 11.803.35 10.802.78 11.803.27B 11.603.05 25.604.16* 28.005.52* 31.403.85* 40.406.66*C 12.004.06 20.402.61*# 21.803.77*# 24.602.30*# 23.42.61*# 注：與術前比較，*P0.05 ，*P0.01 ; 與B組比較, #P0.05， #P0.01 各組術后不同時間點各組術后不同時間點IL-1的表達的表達 各組各組PAG

17、中中GFAP的表達的表達 SABC 染色染色 400 A1 A3A7B1B3B7C1C3C7A14B14C14 各組術后不同時間點各組術后不同時間點TNF-的表達的表達 ( s) 分組 術前0d 術后1d 術后3d 術后7d 術后14d A 10.003.16 11.403.78 10.401.52 10.802.17 11.802.59 B 12.603.36 21.003.54* 22.403.51* 31.204.21* 36.005.61* C 11.202.17 16.202.77*# 17.402.61*# 20.803.11*# 19.603.85*# 注：與術前比較，*P0.0

18、5 ，*P0.01 ; 與B組比較, #P 0.05，#P0.01 各組術后不同時間點各組術后不同時間點TNF-的表達的表達 各組各組PAG中中TNF-的表達的表達 SABC 染色染色 400A1A3A7A14B1B3B7B14C1C3C7C14 n最主要的是本研討發(fā)現： PAG給予HS014可明顯抑制CCI后星形膠質細胞的激活及促炎性細胞因子的表達。n提示在外周神經損傷后，PAG中MC4R能夠經過引起膠質細胞激活和促炎性細胞因子的分泌來參與神經病理性疼痛的調理。討論討論 討論討論 PAG中中MC4R參與神經病理性疼痛的能夠機制：參與神經病理性疼痛的能夠機制：MC4R激活激活星形膠質細胞激星形

19、膠質細胞激活及炎性因子的活及炎性因子的的表達添加的表達添加PAG下行易化體系下行易化體系激活激活外外周周神神經經損損傷傷外周神經損傷外周神經損傷神經病理性疼痛神經病理性疼痛膠質細胞膠質細胞- -神經元網絡神經元網絡 1、CCI可致PAG中星形膠質細胞激活和炎性因子 的表達添加，且其添加程度與慢性神經病理性疼痛維持過程中熱刺激縮足閾值的降低程度相平行。 2、HS04能明顯降低PAG中星形膠質細胞的激活和炎性因子的添加，從而更為有效減輕CCI大鼠的痛覺過敏。 結論Melanocortin 4 Receptor Induces Hyperalgesia and Allodynia After Chr

20、onic Constriction Injury by Activation of p38 MAPK in DRGHaichen Chu,1 Jiangling Xia,1 Zhao Yang,2 and Jie Gao11Department of Anesthesiology, Affiliate Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao,Shandong Province, China International Journal of Neuroscience, 00, 18, 2019Copyright2019 In

21、forma Healthcare USA, IncEffect of periaqueductal gray melanocortin 4 receptor in pain acilitation and glial activation in rat model of chronic constriction injuryHaichen Chu1, Junzhi Sun2, Hongmei Xu1, Zejun Niu1, 1Department of Anesthesiology, Affiliated Hospital of Medical College, Qingdao University, ChinaNeurological Research ner2905.3d 29/7/12 Melanocortin 4 Receptor Mediates Neuropathic Pain Through p38MAPK in Spinal CordHaichen Chu, Jiangling Xia, Hongmei Xu, Zha