new實(shí)驗(yàn)七GST酶親和層析及學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1new實(shí)驗(yàn)七實(shí)驗(yàn)七GST酶親和層析及酶親和層析及第一頁，編輯于星期六：二十一點(diǎn) 三十六分。1. 蛋白質(zhì)分離純化2. 蛋白質(zhì)的鑒定分析第1頁/共43頁第二頁，編輯于星期六：二十一點(diǎn) 三十六分。蛋白質(zhì)分離純化的方法第2頁/共43頁第三頁，編輯于星期六：二十一點(diǎn) 三十六分。等電點(diǎn)沉淀法聚乙二醇沉淀法鹽析法有機(jī)溶劑沉淀法熱變性沉淀法1電泳法2層析法3沉淀法4透析、超濾5、離心6、結(jié)晶第3頁/共43頁第四頁，編輯于星期六：二十一點(diǎn) 三十六分。n主要是利用鹽析法、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀等方法，使目的蛋白與其它較大量的雜蛋白分開，這些方法的特點(diǎn)是簡便、處理量大、既能除去大量雜質(zhì)，又能濃縮蛋白質(zhì)，但

2、分辨率低。一、粗分級(jí)分離第4頁/共43頁第五頁，編輯于星期六：二十一點(diǎn) 三十六分。l鹽析沉淀的蛋白質(zhì)仍保持天然構(gòu)象，即仍有活性。鹽析沉淀的蛋白質(zhì)仍保持天然構(gòu)象，即仍有活性。第5頁/共43頁第六頁，編輯于星期六：二十一點(diǎn) 三十六分。第6頁/共43頁第七頁，編輯于星期六：二十一點(diǎn) 三十六分。 透析是將含有小分子雜質(zhì)的蛋白質(zhì)溶液裝在半透膜（玻璃紙、火綿紙等）制的透析袋里放在蒸餾水(緩沖液)中進(jìn)行，可不斷更換蒸餾水，直至雜質(zhì)被除去。透析袋蛋白質(zhì)溶液蒸餾水第7頁/共43頁第八頁，編輯于星期六：二十一點(diǎn) 三十六分。第8頁/共43頁第九頁，編輯于星期六：二十一點(diǎn) 三十六分。第9頁/共43頁第十頁，編輯于星期

3、六：二十一點(diǎn) 三十六分。電泳電泳(IEF)。n另外，結(jié)晶也是蛋白質(zhì)分離純化的另外，結(jié)晶也是蛋白質(zhì)分離純化的方法之一，制備的結(jié)晶物常常作為方法之一，制備的結(jié)晶物常常作為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析之用。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析之用。第10頁/共43頁第十一頁，編輯于星期六：二十一點(diǎn) 三十六分。綜合實(shí)驗(yàn)第11頁/共43頁第十二頁，編輯于星期六：二十一點(diǎn) 三十六分。抑制劑、酶和輔酶、抗原與抗體、DNA和RNA、激素和其受體、DNA與結(jié)合蛋白等。第12頁/共43頁第十三頁，編輯于星期六：二十一點(diǎn) 三十六分。第13頁/共43頁第十四頁，編輯于星期六：二十一點(diǎn) 三十六分。Affinity chromatography 親和層析S

4、olid Matrixligand第14頁/共43頁第十五頁，編輯于星期六：二十一點(diǎn) 三十六分。親和層析法分離生物大分子示意圖配基 待分離的 生物分子a. 載體 手臂 配基 親和吸附劑b.第15頁/共43頁第十六頁，編輯于星期六：二十一點(diǎn) 三十六分。d.與待分離物質(zhì)專一可逆結(jié)合的物質(zhì)c.樣品雜質(zhì) 第16頁/共43頁第十七頁，編輯于星期六：二十一點(diǎn) 三十六分。親和層析的示意圖第17頁/共43頁第十八頁，編輯于星期六：二十一點(diǎn) 三十六分。Glu-Agarose beads 原理u 谷胱甘肽(Glutathione，Glu)與谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶( Glu S-Transferase )之間具有特異性的作

5、用力。將混合菌體蛋白與谷胱甘肽瓊脂糖凝膠珠（Glu-Agarose beads）孵育，凝膠手臂上的Glu可以與GST蛋白特異性結(jié)合，通過洗脫除去不能與珠結(jié)合的雜蛋白而獲得瓊脂糖珠結(jié)合的GST純蛋白。u 進(jìn)一步使用還原型谷胱甘肽(GSH)洗脫時(shí)，將競爭GST上的結(jié)合位點(diǎn)而將GST蛋白洗脫下來，從而獲得純化的GST酶的純品。 第18頁/共43頁第十九頁，編輯于星期六：二十一點(diǎn) 三十六分。 將菌液每3-4ml/管收集在Ep管中，離心后棄上清。第19頁/共43頁第二十頁，編輯于星期六：二十一點(diǎn) 三十六分。第20頁/共43頁第二十一頁，編輯于星期六：二十一點(diǎn) 三十六分。第21頁/共43頁第二十二頁，編輯

6、于星期六：二十一點(diǎn) 三十六分。第22頁/共43頁第二十三頁，編輯于星期六：二十一點(diǎn) 三十六分。核黃素B1 還原型 游離基 聚合反應(yīng)光照O2第23頁/共43頁第二十四頁，編輯于星期六：二十一點(diǎn) 三十六分。丙稀酰胺聚丙烯酰胺凝膠催化劑聚合反應(yīng)第24頁/共43頁第二十五頁，編輯于星期六：二十一點(diǎn) 三十六分。單體丙烯酰胺Acr交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺Bis化學(xué)聚合光聚合引發(fā)劑（NH4)2S2O8 （NH4)2S2O8 核 黃 素 加速劑TEMEDDMAPNTEMED注：（NH4)2S2O8 過硫酸胺在凝膠形成中提供始自由基，通過自由基的傳遞，使丙烯酰胺 成為自由基，發(fā)動(dòng)聚合反應(yīng) TEMEDN，N，

7、N，N-四甲基乙二胺 DMAPN二甲基胺基丙晴 聚合為含酰胺基側(cè)鏈的脂肪族長鏈，在相鄰長鏈之間通過甲撐橋連接而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)第25頁/共43頁第二十六頁，編輯于星期六：二十一點(diǎn) 三十六分。單體和雙體在凝膠中的總濃度a+bV 100%T雙體占總濃度的百分含量，即交聯(lián)度bab 100%Ca，Acr的質(zhì)量（g）b，Bis的質(zhì)量（g）V，溶液的體積（ml） CT：520孔徑大小第26頁/共43頁第二十七頁，編輯于星期六：二十一點(diǎn) 三十六分。蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量與凝膠濃度的關(guān)系蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量范圍(kD)適用的凝膠濃度（T%）102030104015204010010151005005105002

8、5 凝膠濃度的選擇凝膠濃度的選擇第27頁/共43頁第二十八頁，編輯于星期六：二十一點(diǎn) 三十六分。聚丙烯酰胺凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)稀溶液濃溶液 交聯(lián)劑 凝膠 結(jié)點(diǎn)第28頁/共43頁第二十九頁，編輯于星期六：二十一點(diǎn) 三十六分?？煞蛛x：1.電荷性質(zhì)與密度相近的但分子量有差別 2.分子量相近、性質(zhì)一樣、電荷性質(zhì)與密度有差別 的分子 3.電荷性質(zhì)、分子量大小相近，但構(gòu)型不同不連續(xù)凝膠電泳洗脫 堿性不連續(xù)分離酸性樣品 酸性不連續(xù)分離堿性樣品 第29頁/共43頁第三十頁，編輯于星期六：二十一點(diǎn) 三十六分。第30頁/共43頁第三十一頁，編輯于星期六：二十一點(diǎn) 三十六分。第31頁/共43頁第三十二頁，編輯于星期六

9、：二十一點(diǎn) 三十六分。第32頁/共43頁第三十三頁，編輯于星期六：二十一點(diǎn) 三十六分。SDS-PAGE第33頁/共43頁第三十四頁，編輯于星期六：二十一點(diǎn) 三十六分。DTT硫鍵，使很多不溶性蛋白質(zhì)溶解而與SDS定量結(jié)合。有些蛋白質(zhì)不能用SDS-PAGE測定分子量。如電荷異?；驑?gòu)象異常的蛋白質(zhì)，帶有較大輔基的蛋白質(zhì)（某些糖蛋白）以及一些結(jié)構(gòu)蛋白，如膠原蛋白等。第34頁/共43頁第三十五頁，編輯于星期六：二十一點(diǎn) 三十六分。SDS-PAGE鑒定酶蛋白純度鑒定酶蛋白純度第35頁/共43頁第三十六頁，編輯于星期六：二十一點(diǎn) 三十六分。 1.將玻璃板用蒸餾水洗凈晾干, 準(zhǔn)備2個(gè)干凈的燒杯.2. 把玻璃板

10、在灌膠支架上固定好. 固定玻璃板時(shí)，兩邊用力一定要均勻，防止夾壞玻璃板固定玻璃板時(shí)，兩邊用力一定要均勻，防止夾壞玻璃板.3.按比例配好分離膠,用滴管快速加入, 之后加少許蒸餾水封膠,靜置3040分鐘.配制凝膠要迅速配制凝膠要迅速, 催化劑催化劑TEMED要在注膠前再加入要在注膠前再加入,否則凝膠無法注膠否則凝膠無法注膠.注膠過注膠過程最好一次性完成程最好一次性完成,避免凝膠不均勻避免凝膠不均勻.封水的目的是為了使分離膠上沿平直，并隔絕空氣，促使凝膠聚合過程；封水的目的是為了使分離膠上沿平直，并隔絕空氣，促使凝膠聚合過程；凝膠聚合好的標(biāo)志是膠與水層之間形成清晰的界面凝膠聚合好的標(biāo)志是膠與水層之間

11、形成清晰的界面.4.倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干, 按比例配好濃縮膠,連續(xù)平穩(wěn)加入分離膠面上,迅速插入樣梳,靜置40分鐘. 樣梳需一次平穩(wěn)插入樣梳需一次平穩(wěn)插入,梳口處不得有氣泡梳口處不得有氣泡,梳底需水平梳底需水平.第36頁/共43頁第三十七頁，編輯于星期六：二十一點(diǎn) 三十六分。 10%TEMED 100 l 配膠，先配分離膠，再陪濃縮膠。（在孵箱里或水浴鍋中聚合）10%分離膠配方：（10ml,一塊膠）第37頁/共43頁第三十八頁，編輯于星期六：二十一點(diǎn) 三十六分。ddH2O 3.345 ml30%凝膠貯液 0.8 ml濃縮膠buffer 0.625 ml10%SDS 50 l10% AP 50 l10%TEMED 50 l第38頁/共43頁第三十九頁，編輯于星期六：二十一點(diǎn) 三十六分