色譜基本原理

1、色譜基本原理色譜基本原理第一節(jié)第一節(jié) 色譜法概述色譜法概述4.1.1 色譜法的特點(diǎn)、分類和作用色譜法的特點(diǎn)、分類和作用俄國(guó)植物學(xué)家茨維特在俄國(guó)植物學(xué)家茨維特在19061906年使用的裝置：年使用的裝置：色譜原型裝置，如圖。色譜原型裝置，如圖。 1、概述、概述n色譜法色譜法(chromatography)：以試樣：以試樣組分組分在固定相和流動(dòng)相間的在固定相和流動(dòng)相間的溶解、吸附、分配、溶解、吸附、分配、離子交換或其他親和作用的差異為依據(jù)離子交換或其他親和作用的差異為依據(jù)而而建立起來的各種建立起來的各種分離分析方法分離分析方法稱色譜法。稱色譜法。有關(guān)名詞：有關(guān)名詞：色譜法的共同特點(diǎn)：色譜法的共同特

2、點(diǎn)： 任何色譜法都存在兩個(gè)相，即流動(dòng)相和固定相；流動(dòng)任何色譜法都存在兩個(gè)相，即流動(dòng)相和固定相；流動(dòng) 相可以是氣體或液體，固定相為固體或涂漬在固體表相可以是氣體或液體，固定相為固體或涂漬在固體表 面的高沸點(diǎn)液體；面的高沸點(diǎn)液體； 流動(dòng)相對(duì)固定相作相對(duì)運(yùn)動(dòng)，它攜帶樣品通過固定相；流動(dòng)相對(duì)固定相作相對(duì)運(yùn)動(dòng)，它攜帶樣品通過固定相； 被分離樣品中各組分與色譜兩相間具有不同的作用力，被分離樣品中各組分與色譜兩相間具有不同的作用力， 這種作用力一般表現(xiàn)為吸附力或溶解能力，正是這種這種作用力一般表現(xiàn)為吸附力或溶解能力，正是這種 作用力的差異導(dǎo)致通過各組分通過固定相時(shí)達(dá)到彼此作用力的差異導(dǎo)致通過各組分通過固定相

3、時(shí)達(dá)到彼此 分離。分離。2、色譜法分類、色譜法分類 （1 1）氣相色譜）氣相色譜：流動(dòng)相為氣體（稱為載氣）。流動(dòng)相為氣體（稱為載氣）。 按分離柱不同可分為：填充柱色譜和毛細(xì)管柱色譜按分離柱不同可分為：填充柱色譜和毛細(xì)管柱色譜 按固定相的不同又分為：氣固色譜和氣液色譜按固定相的不同又分為：氣固色譜和氣液色譜（2 2）液相色譜）液相色譜：流動(dòng)相為液體（也稱為淋洗液）。流動(dòng)相為液體（也稱為淋洗液）。 按固定相的不同分為：液固色譜和液液色譜。按固定相的不同分為：液固色譜和液液色譜。 (3)其他色譜方法：其他色譜方法：薄層色譜和紙色譜、凝膠色譜法、薄層色譜和紙色譜、凝膠色譜法、 高效毛細(xì)管電泳法等。高效

4、毛細(xì)管電泳法等。 第二節(jié)第二節(jié) 氣相色譜法氣相色譜法(GC)Gas Chromatography（1）分離效率高：分離效率高： 復(fù)雜混合物，有機(jī)同系物、異構(gòu)體。手性異構(gòu)體。復(fù)雜混合物，有機(jī)同系物、異構(gòu)體。手性異構(gòu)體。（2 2） 靈敏度高：靈敏度高： 可以檢測(cè)出可以檢測(cè)出g.gg.g-1-1(10(10-6-6) )級(jí)甚至級(jí)甚至ng.gng.g-1-1(10(10-9-9) )級(jí)的物質(zhì)量級(jí)的物質(zhì)量. .（3 3） 分析速度快：分析速度快： 一般在幾分鐘或幾十分鐘內(nèi)可以完成一個(gè)試樣的分析。一般在幾分鐘或幾十分鐘內(nèi)可以完成一個(gè)試樣的分析。（4 4） 應(yīng)用范圍廣：應(yīng)用范圍廣： 適用于沸點(diǎn)低于適用于沸點(diǎn)

5、低于400400的各種有機(jī)或無機(jī)試樣的分析。的各種有機(jī)或無機(jī)試樣的分析。 不足之處：不足之處： 不適用于高沸點(diǎn)、難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定物質(zhì)的分析。不適用于高沸點(diǎn)、難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定物質(zhì)的分析。 被分離組分的被分離組分的定性定性較為困難。較為困難。1、氣相色譜法的特點(diǎn)、氣相色譜法的特點(diǎn)4.2.1 概述概述2 2、氣相色譜分離過程、氣相色譜分離過程當(dāng)試樣由載氣攜帶進(jìn)入色譜當(dāng)試樣由載氣攜帶進(jìn)入色譜柱與固定相接觸時(shí)，被固定相柱與固定相接觸時(shí)，被固定相溶解或吸附。溶解或吸附。隨著載氣的不斷通入，被溶隨著載氣的不斷通入，被溶解或吸附的組分又從固定相中解或吸附的組分又從固定相中揮發(fā)或脫附，揮發(fā)或脫附，揮發(fā)或脫附下的

6、組分隨著載揮發(fā)或脫附下的組分隨著載氣向前移動(dòng)時(shí)又再次被固定相氣向前移動(dòng)時(shí)又再次被固定相溶解或吸附。溶解或吸附。隨著載氣的流動(dòng)，溶解、揮隨著載氣的流動(dòng)，溶解、揮發(fā)，或吸附、脫附的過程反復(fù)發(fā)，或吸附、脫附的過程反復(fù)地進(jìn)行。地進(jìn)行。3 3、分配系數(shù)、分配系數(shù) K K 組分在固定相和流動(dòng)相間發(fā)生的吸附、脫附，或溶解、組分在固定相和流動(dòng)相間發(fā)生的吸附、脫附，或溶解、揮發(fā)的過程叫做分配過程。在一定溫度下，組分在兩相間揮發(fā)的過程叫做分配過程。在一定溫度下，組分在兩相間分配達(dá)到平衡時(shí)的濃度（單位：分配達(dá)到平衡時(shí)的濃度（單位：g / mL）比，稱為分配系數(shù)，）比，稱為分配系數(shù)，用用K 表示，即：表示，即： 組分

7、在流動(dòng)相中的濃度組分在固定相中的濃度K分配系數(shù)分配系數(shù) K K的討論的討論 一定溫度下，組分的分配系數(shù)一定溫度下，組分的分配系數(shù)K越大，出峰越慢；越大，出峰越慢；試樣一定時(shí)，試樣一定時(shí)，K主要取決于固定相性質(zhì)；主要取決于固定相性質(zhì)；每個(gè)組份在各種固定相上的分配系數(shù)每個(gè)組份在各種固定相上的分配系數(shù)K不同；不同；選擇適宜的固定相可改善分離效果；選擇適宜的固定相可改善分離效果；試樣中的各組分具有不同的試樣中的各組分具有不同的K值是分離的基礎(chǔ)；值是分離的基礎(chǔ)；某組分的某組分的K = 0時(shí)，即不被固定相保留，最先流出。時(shí)，即不被固定相保留，最先流出。 組分在流動(dòng)相中的濃度組分在固定相中的濃度K4.2.2

8、 氣相色譜儀氣相色譜儀氣相色譜儀通常由五部分組成： 載氣系統(tǒng)：氣源、氣體凈化器、供氣控載氣系統(tǒng)：氣源、氣體凈化器、供氣控 制閥門和儀表。制閥門和儀表。 進(jìn)樣系統(tǒng)：進(jìn)樣器、汽化室。進(jìn)樣系統(tǒng)：進(jìn)樣器、汽化室。 分離系統(tǒng)：色譜柱、控溫柱箱。分離系統(tǒng)：色譜柱、控溫柱箱。 檢測(cè)系統(tǒng)：檢測(cè)器、檢測(cè)室。檢測(cè)系統(tǒng)：檢測(cè)器、檢測(cè)室。 記錄系統(tǒng)：放大器、記錄儀、記錄系統(tǒng)：放大器、記錄儀、 色譜工作站。色譜工作站。氣路系統(tǒng)氣路系統(tǒng)載氣載氣: :氣相色譜中常用的載氣有氮?dú)猓鈿庀嗌V中常用的載氣有氮?dú)?，氦氣和氬氣。和氬氣。氣路結(jié)構(gòu)氣路結(jié)構(gòu): :主要有兩種氣路形式主要有兩種氣路形式 單柱單氣路，適用于恒溫分析單柱單氣

9、路，適用于恒溫分析 雙柱雙氣路，適用于程序升溫，并能補(bǔ)償固雙柱雙氣路，適用于程序升溫，并能補(bǔ)償固定液的流失使其基線穩(wěn)定。定液的流失使其基線穩(wěn)定。凈化器凈化器: :主要用來提高載氣純度。主要用來提高載氣純度。穩(wěn)壓恒流裝置穩(wěn)壓恒流裝置: :穩(wěn)定載氣流速。穩(wěn)定載氣流速。進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)Dissolved in an organic solvent.Injected into the carrier gas flow by syringe or valve.包括進(jìn)樣裝置和氣化室包括進(jìn)樣裝置和氣化室氣相色譜的分離系統(tǒng)是氣相色譜的分離系統(tǒng)是色譜柱色譜柱，常用的色譜柱有，常用的色譜柱有填充填充柱柱和和毛細(xì)管

10、柱毛細(xì)管柱兩種：兩種：填充柱填充柱是以固體吸附劑或涂漬了是以固體吸附劑或涂漬了固定液的載體顆粒填充到柱管內(nèi)形成的柱子；固定液的載體顆粒填充到柱管內(nèi)形成的柱子；毛細(xì)管毛細(xì)管柱柱內(nèi)沒有填充顆粒，是將固定相涂漬或者以化學(xué)鍵合內(nèi)沒有填充顆粒，是將固定相涂漬或者以化學(xué)鍵合方式附著到管內(nèi)壁上。方式附著到管內(nèi)壁上。由于混合物各組分的分由于混合物各組分的分離在這里完成，所以它離在這里完成，所以它是色譜儀中最重要的部件之一。是色譜儀中最重要的部件之一。氣液色譜填充柱的固定相通常由一種惰性多孔固體（稱為氣液色譜填充柱的固定相通常由一種惰性多孔固體（稱為擔(dān)擔(dān)體體）及在其表面上涂漬一層較薄的高沸點(diǎn)有機(jī)物（稱為）及在其

11、表面上涂漬一層較薄的高沸點(diǎn)有機(jī)物（稱為固定固定液液）液膜構(gòu)成。）液膜構(gòu)成。1、擔(dān)體、擔(dān)體提供一個(gè)大的惰性表面，以便使涂漬的固定液膜有足夠的容量。提供一個(gè)大的惰性表面，以便使涂漬的固定液膜有足夠的容量。擔(dān)體應(yīng)具有化學(xué)穩(wěn)定性好、熱穩(wěn)定性好、有一定的機(jī)械強(qiáng)度、擔(dān)體應(yīng)具有化學(xué)穩(wěn)定性好、熱穩(wěn)定性好、有一定的機(jī)械強(qiáng)度、合適的顆粒及均勻的粒徑。常用的有硅藻土類。合適的顆粒及均勻的粒徑。常用的有硅藻土類。2、固定液、固定液對(duì)色譜分離起著決定性作用。應(yīng)具有化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性好、對(duì)色譜分離起著決定性作用。應(yīng)具有化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性好、蒸汽壓低、對(duì)分析樣品有適合的溶解能力，并有高的選擇性。蒸汽壓低、對(duì)分析樣品有適

12、合的溶解能力，并有高的選擇性。固定液在操作溫度下是一種液體，柱溫不能超過固定液的最高固定液在操作溫度下是一種液體，柱溫不能超過固定液的最高使用溫度，否則會(huì)使它大量隨載氣流失。使用溫度，否則會(huì)使它大量隨載氣流失。溫控系統(tǒng)是用來設(shè)定，控制，測(cè)量色譜柱爐、氣溫控系統(tǒng)是用來設(shè)定，控制，測(cè)量色譜柱爐、氣化室、檢測(cè)室三處的溫度?；?、檢測(cè)室三處的溫度。氣化室的溫度應(yīng)使試樣瞬時(shí)氣化而又不分解。在氣化室的溫度應(yīng)使試樣瞬時(shí)氣化而又不分解。在一般情況下，氣化室的溫度一般應(yīng)比試樣中最高一般情況下，氣化室的溫度一般應(yīng)比試樣中最高組分沸點(diǎn)高組分沸點(diǎn)高20-30 C左右，左右，比柱溫高比柱溫高10 50 C。熱導(dǎo)池檢測(cè)器

13、熱導(dǎo)池檢測(cè)器 thermal conductivity detector, TCD 氫火焰離子化檢測(cè)器氫火焰離子化檢測(cè)器 flame ionization detector, FID電子捕獲檢測(cè)器電子捕獲檢測(cè)器 electron-capture detector, ECD熱離子化檢測(cè)器熱離子化檢測(cè)器 thermionic detector, TID火焰光度檢測(cè)器火焰光度檢測(cè)器 flame photometric detector, FPD熱導(dǎo)池檢測(cè)器熱導(dǎo)池檢測(cè)器 TCDTCD 工作原理：工作原理：被分離的組分具有與被分離的組分具有與載氣不同的熱導(dǎo)系數(shù)，當(dāng)檢測(cè)器載氣不同的熱導(dǎo)系數(shù)，當(dāng)檢測(cè)器的金屬

14、絲被加熱并溫度達(dá)到恒定的金屬絲被加熱并溫度達(dá)到恒定后，通過熱導(dǎo)池的載氣組成若發(fā)后，通過熱導(dǎo)池的載氣組成若發(fā)生變化就會(huì)帶走與載氣不同的熱量，生變化就會(huì)帶走與載氣不同的熱量，從而引起熱敏元件阻值的變化。從而引起熱敏元件阻值的變化。氫火焰離子化檢測(cè)器氫火焰離子化檢測(cè)器 FIDFID 工作原理：工作原理：以氫氣和空氣的混合物燃燒火焰為能源，將進(jìn)入檢測(cè)以氫氣和空氣的混合物燃燒火焰為能源，將進(jìn)入檢測(cè)器的有機(jī)物離子化，生成許多離子對(duì)，帶電離子被安裝在檢測(cè)器器的有機(jī)物離子化，生成許多離子對(duì)，帶電離子被安裝在檢測(cè)器上的電極吸引產(chǎn)生微弱的電流，經(jīng)放大被記錄儀記錄。對(duì)含碳物上的電極吸引產(chǎn)生微弱的電流，經(jīng)放大被記錄儀

15、記錄。對(duì)含碳物質(zhì)檢測(cè)靈敏度高，而對(duì)不含碳物質(zhì)無響應(yīng)。質(zhì)檢測(cè)靈敏度高，而對(duì)不含碳物質(zhì)無響應(yīng)。4.2.3 色譜理論基礎(chǔ)色譜理論基礎(chǔ)基線：基線：無試樣通過檢測(cè)器時(shí)，檢測(cè)到的信號(hào)即無試樣通過檢測(cè)器時(shí)，檢測(cè)到的信號(hào)即為基線為基線?；€漂移基線漂移：基線隨時(shí)間定向緩慢地變化。：基線隨時(shí)間定向緩慢地變化?；€基線基線漂基線漂移移2、色譜術(shù)語、色譜術(shù)語峰高峰高 h （peak hight ）：峰的頂點(diǎn)到峰底之間的垂直距離。：峰的頂點(diǎn)到峰底之間的垂直距離。峰面積峰面積A （peak area） ：峰與峰底之間的面積。：峰與峰底之間的面積。保留值保留值 A、時(shí)間表示的保留值、時(shí)間表示的保留值 保留時(shí)間（保留時(shí)間（

16、tR）：）：組分從進(jìn)樣到柱后出現(xiàn)濃度極大值時(shí)組分從進(jìn)樣到柱后出現(xiàn)濃度極大值時(shí)所需的時(shí)間所需的時(shí)間 死時(shí)間（死時(shí)間（tM）：）：不與固定相作用的氣體（如空氣）的保不與固定相作用的氣體（如空氣）的保留時(shí)間。留時(shí)間。 調(diào)整保留時(shí)間（調(diào)整保留時(shí)間（tR ）：）：tR= tRtM B、用體積表示的保留值、用體積表示的保留值 保留體積（保留體積（VR）：VR = tRF0 （ F0為色譜柱出口處的載氣流量，為色譜柱出口處的載氣流量， 單位：?jiǎn)挝唬簃 L / min。）。） 死體積（死體積（VM）： VM = tM F0 調(diào)整保留體積（調(diào)整保留體積（VR）： V R = VR VM 組分組分2與組分與組分1

17、調(diào)整保留值之比：調(diào)整保留值之比： r21 = tR2 / tR1= VR2 / V R1 相對(duì)保留值只與柱溫和固定相性質(zhì)有關(guān)，與其相對(duì)保留值只與柱溫和固定相性質(zhì)有關(guān)，與其他色譜操作條件無關(guān)，它表示了固定相對(duì)這兩種組他色譜操作條件無關(guān)，它表示了固定相對(duì)這兩種組分的選擇性。分的選擇性。C. 相對(duì)保留值相對(duì)保留值r21色譜分析的實(shí)驗(yàn)依據(jù)：色譜分析的實(shí)驗(yàn)依據(jù)：、根據(jù)色譜峰的位置（保留時(shí)間）可以、根據(jù)色譜峰的位置（保留時(shí)間）可以進(jìn)行定性分析。進(jìn)行定性分析。 2、根據(jù)色譜峰的面積或峰高可以進(jìn)行定量、根據(jù)色譜峰的面積或峰高可以進(jìn)行定量分析。分析。 3、根據(jù)色譜峰的展寬程度，可以對(duì)某物質(zhì)、根據(jù)色譜峰的展寬程度

18、，可以對(duì)某物質(zhì)在實(shí)驗(yàn)條件下的分離特性進(jìn)行評(píng)價(jià)。在實(shí)驗(yàn)條件下的分離特性進(jìn)行評(píng)價(jià)。3、色譜分析的基本理論、色譜分析的基本理論4、色譜操作條件的選擇、色譜操作條件的選擇(1)、 固定相的選擇固定相的選擇 氣液色譜，應(yīng)根據(jù)“相似相溶”的原則分離非極性組分時(shí)，通常選用非極性固定相。各組分按沸點(diǎn)順序出峰，低沸點(diǎn)組分先出峰。 分離極性組分時(shí)，一般選用極性固定液。各組分按極性大小順序流出色譜柱，極性小的先出峰。分離非極性和極性的（或易被極化的）混合物，一般選用極性固定液。此時(shí)，非極性組分先出峰，極性的（或易被極化的）組分后出峰。醇、胺、水等強(qiáng)極性和能形成氫鍵的化合物的分離，通常選擇極性或氫鍵性的固定液。組成復(fù)

19、雜、較難分離的試樣，通常使用特殊固定液，或混合固定相。(2)、柱長(zhǎng)和柱內(nèi)徑的選擇、柱長(zhǎng)和柱內(nèi)徑的選擇 增加柱長(zhǎng)對(duì)提高分離度有利，但組分的保留時(shí)間tR ，且柱阻力，不便操作。 柱長(zhǎng)的選用原則是在能滿足分離目的的前提下，柱長(zhǎng)的選用原則是在能滿足分離目的的前提下，盡可能選用較短的柱，有利于縮短分析時(shí)間。盡可能選用較短的柱，有利于縮短分析時(shí)間。填充色譜柱的柱長(zhǎng)通常為13米，內(nèi)徑34厘米。(3)、柱溫的確定、柱溫的確定 首先應(yīng)使柱溫控制在固定液的最高使用溫度（超過該溫度固定液易流失）和最低使用溫度（低于此溫度固定液以固體形式存在）范圍之內(nèi)。 柱溫升高，分離度下降，色譜峰變窄變高。柱溫，被測(cè)組分的揮發(fā)度，

20、即被測(cè)組分在氣相中的濃度，K，tR，低沸點(diǎn)組份峰易產(chǎn)生重疊。 柱溫，分離度，分析時(shí)間。對(duì)于難分離物質(zhì)對(duì)，降低柱溫雖然可在一定程度內(nèi)使分離得到改善，但是不可能使之完全分離，這是由于兩組分的相對(duì)保留值增大的同時(shí)，兩組分的峰寬也在增加，當(dāng)后者的增加速度大于前者時(shí)，兩峰的交疊更為嚴(yán)重。 柱溫一般選擇在接近或略低于組分平均沸點(diǎn)時(shí)的溫度。 組分復(fù)雜，沸程寬的試樣，采用程序升溫。程序升溫(1)(1)、色譜定性鑒定方法、色譜定性鑒定方法A.A.利用純物質(zhì)定性的方法利用純物質(zhì)定性的方法 利用保留值定性利用保留值定性：通過對(duì)比試樣中具有與純物質(zhì)相同保通過對(duì)比試樣中具有與純物質(zhì)相同保留值的色譜峰，來確定試樣中是否含

21、有該物質(zhì)及在色譜圖留值的色譜峰，來確定試樣中是否含有該物質(zhì)及在色譜圖中的位置。不適用于不同儀器上獲得的數(shù)據(jù)之間的對(duì)比中的位置。不適用于不同儀器上獲得的數(shù)據(jù)之間的對(duì)比。 利用加入法定性利用加入法定性：將純物質(zhì)加入到試樣中，觀察各組分將純物質(zhì)加入到試樣中，觀察各組分色譜峰的相對(duì)變化。色譜峰的相對(duì)變化。 B.B.利用文獻(xiàn)保留值定性利用文獻(xiàn)保留值定性 相對(duì)保留值相對(duì)保留值r r2121：相對(duì)保留值相對(duì)保留值r r2121僅與柱溫和固定液性質(zhì)有僅與柱溫和固定液性質(zhì)有關(guān)。在色譜手冊(cè)中都列有各種物質(zhì)在不同固定液上的保留關(guān)。在色譜手冊(cè)中都列有各種物質(zhì)在不同固定液上的保留數(shù)據(jù)，可以用來進(jìn)行定性鑒定。數(shù)據(jù)，可以用

22、來進(jìn)行定性鑒定。5、色譜定性、定量分析方法、色譜定性、定量分析方法C.C.與其他分析儀器聯(lián)用的定性方法與其他分析儀器聯(lián)用的定性方法小型化的臺(tái)式色質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）色譜-紅外光譜儀聯(lián)用儀；組分的結(jié)構(gòu)鑒定A.外標(biāo)法外標(biāo)法將待測(cè)組分的純物質(zhì)配成將待測(cè)組分的純物質(zhì)配成不同濃度不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，使的標(biāo)準(zhǔn)溶液，使?jié)舛扰c待測(cè)組分接近，然后取固定量的上述溶液進(jìn)濃度與待測(cè)組分接近，然后取固定量的上述溶液進(jìn)行色譜分析，得到各標(biāo)準(zhǔn)樣品的對(duì)應(yīng)色譜圖。行色譜分析，得到各標(biāo)準(zhǔn)樣品的對(duì)應(yīng)色譜圖。圖圖 某組分的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的色譜圖某組分的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的色譜圖外標(biāo)法（續(xù)）外標(biāo)法（續(xù)）再在同樣的條件下（同樣的色譜操作條件和進(jìn)再在

23、同樣的條件下（同樣的色譜操作條件和進(jìn)同樣的體積），分析待測(cè)試樣，得到色譜圖。同樣的體積），分析待測(cè)試樣，得到色譜圖。圖圖 某樣品的色譜圖某樣品的色譜圖外標(biāo)法（續(xù)）外標(biāo)法（續(xù)）以標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜峰面積作圖，得到一條標(biāo)準(zhǔn)以標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜峰面積作圖，得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，再在標(biāo)準(zhǔn)曲線上根據(jù)待測(cè)樣品的峰面積曲線，再在標(biāo)準(zhǔn)曲線上根據(jù)待測(cè)樣品的峰面積查出待測(cè)組分的濃度。查出待測(cè)組分的濃度。圖圖 標(biāo)準(zhǔn)（工作）曲線圖標(biāo)準(zhǔn)（工作）曲線圖B. B. 內(nèi)標(biāo)法內(nèi)標(biāo)法內(nèi)標(biāo)物要滿足以下要求：內(nèi)標(biāo)物要滿足以下要求：（1）試樣中不含有該物質(zhì)；）試樣中不含有該物質(zhì)；（2）與被測(cè)組分性質(zhì)比較接近；）與被測(cè)組分性質(zhì)比較接近；（3）不與試

24、樣發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；）不與試樣發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；（4）出峰位置應(yīng)位于被測(cè)組分附近，且無組分峰影響。）出峰位置應(yīng)位于被測(cè)組分附近，且無組分峰影響。試樣配制：試樣配制：準(zhǔn)確稱取一定量的試樣準(zhǔn)確稱取一定量的試樣W，加入一定量?jī)?nèi)標(biāo)物，加入一定量?jī)?nèi)標(biāo)物mS計(jì)算式：計(jì)算式：SsiisiSsiisiAfAfmmAfAfmm;100100100%SsiisSsiisiiAfAfWmWAfAfmWmc內(nèi)標(biāo)法內(nèi)標(biāo)法特點(diǎn)1. 內(nèi)標(biāo)法的準(zhǔn)確性較高，操作條件和進(jìn)樣量的稍許變動(dòng)對(duì)定內(nèi)標(biāo)法的準(zhǔn)確性較高，操作條件和進(jìn)樣量的稍許變動(dòng)對(duì)定量結(jié)果的影響不大。量結(jié)果的影響不大。2. 每個(gè)試樣的分析，都要進(jìn)行兩次稱量，不適合大批量試樣每個(gè)試樣

25、的分析，都要進(jìn)行兩次稱量，不適合大批量試樣的快速分析。的快速分析。3. 若將內(nèi)標(biāo)法中的試樣取樣量和內(nèi)標(biāo)物加入量固定，則：若將內(nèi)標(biāo)法中的試樣取樣量和內(nèi)標(biāo)物加入量固定，則：常數(shù)SiiAAc %第三節(jié)第三節(jié) 高效液相色譜（高效液相色譜（HPLC）液相色譜儀液相色譜儀4.3.1 高效液相色譜法的特點(diǎn)高效液相色譜法的特點(diǎn) 特點(diǎn)：高壓、高效、高速特點(diǎn)：高壓、高效、高速 高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定有機(jī)及生化試樣的高效分離分析方法。高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定有機(jī)及生化試樣的高效分離分析方法。一、一、HPLCHPLC與與GCGC差別差別 1分析對(duì)象的區(qū)別分析對(duì)象的區(qū)別 GC：適于能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點(diǎn)較：適于能氣化、熱穩(wěn)定性好

26、、且沸點(diǎn)較 低的樣品；但對(duì)高沸點(diǎn)、揮發(fā)性差、低的樣品；但對(duì)高沸點(diǎn)、揮發(fā)性差、 熱穩(wěn)定性差、離子型及高聚物的樣熱穩(wěn)定性差、離子型及高聚物的樣 品，尤其對(duì)大多數(shù)生化樣品不可檢測(cè)品，尤其對(duì)大多數(shù)生化樣品不可檢測(cè) 占有機(jī)物的占有機(jī)物的20% HPLC：適于溶解后能制成溶液的樣品（包括：適于溶解后能制成溶液的樣品（包括 有機(jī)介質(zhì)溶液），不受樣品揮發(fā)性和有機(jī)介質(zhì)溶液），不受樣品揮發(fā)性和 熱穩(wěn)定性的限制，對(duì)分子量大、難熱穩(wěn)定性的限制，對(duì)分子量大、難 氣化、熱穩(wěn)定性差的生化樣品及高分氣化、熱穩(wěn)定性差的生化樣品及高分 子和離子型樣品均可檢測(cè)子和離子型樣品均可檢測(cè) 用途廣泛，占有機(jī)物的用途廣泛，占有機(jī)物的80%2

27、流動(dòng)相差別的區(qū)別流動(dòng)相差別的區(qū)別GC：流動(dòng)相為惰性，氣體組分與流動(dòng)相無親合作用：流動(dòng)相為惰性，氣體組分與流動(dòng)相無親合作用 力，只與固定相有相互作用。力，只與固定相有相互作用。 HPLC：流動(dòng)相為液體，流動(dòng)相與組分間有親合作用：流動(dòng)相為液體，流動(dòng)相與組分間有親合作用 力，能提高柱的選擇性、改善分離度，對(duì)分離起力，能提高柱的選擇性、改善分離度，對(duì)分離起 正向作用。且流動(dòng)相種類較多，選擇余地廣，改正向作用。且流動(dòng)相種類較多，選擇余地廣，改 變流動(dòng)相極性和變流動(dòng)相極性和pH值也對(duì)分離起到調(diào)控作用，當(dāng)值也對(duì)分離起到調(diào)控作用，當(dāng) 選用不同比例的兩種或兩種以上液體作為流動(dòng)相選用不同比例的兩種或兩種以上液體作

28、為流動(dòng)相 也可以增大分離選擇性。也可以增大分離選擇性。3操作條件差別操作條件差別GC：加溫操作：加溫操作HPLC：室溫；高壓（液體粘度大，峰展寬?。菏覝?；高壓（液體粘度大，峰展寬小）4.3.2 4.3.2 流程及主要部件流程及主要部件1.1.流程流程2.2.主要部件主要部件(1) 高壓輸液泵高壓輸液泵主要部件之一，壓力：主要部件之一，壓力：150350105 Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），液），液體的流動(dòng)相高速通過時(shí)，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高體的流動(dòng)相高速通過時(shí)，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點(diǎn)之一。速是

29、高效液相色譜的特點(diǎn)之一。應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性(2) (2) 梯度淋洗裝置梯度淋洗裝置外梯度外梯度: 利用兩臺(tái)高壓輸液泵，利用兩臺(tái)高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。譜柱。內(nèi)梯度內(nèi)梯度: 一臺(tái)高壓泵一臺(tái)高壓泵, 通過比通過比例調(diào)節(jié)閥例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。比例抽入高壓泵中混合。(3) (3) 進(jìn)樣裝置進(jìn)樣裝置 流路中為高壓力工作狀態(tài)， 通常使

30、用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置， 其結(jié)構(gòu)如圖所示：(4) (4) 高效分離柱高效分離柱 柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑16 mm，柱長(zhǎng)，柱長(zhǎng)540 cm。發(fā)展趨勢(shì)是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。發(fā)展趨勢(shì)是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。(5) (5) 高效液相色譜檢測(cè)器高效液相色譜檢測(cè)器 紫外光度檢測(cè)器（紫外光度檢測(cè)器（UV）：）：最小檢測(cè)量最小檢測(cè)量10-9gmL-1，對(duì)，對(duì)流量和溫度的波動(dòng)不敏感，可用于梯度洗脫。流量和溫度的波動(dòng)不敏感，可用于梯度洗脫。 最常用的檢測(cè)器。最常用的檢測(cè)器。HPLC的特點(diǎn)和實(shí)際應(yīng)用的特點(diǎn)和實(shí)際應(yīng)用1. 1. 固定相與裝柱方法的選擇：固定相與裝柱方法的選

31、擇： 選粒徑小的、分布均勻的球形固定相選粒徑小的、分布均勻的球形固定相 （dp10mdp10m） 首選化學(xué)鍵合相，勻漿法裝柱首選化學(xué)鍵合相，勻漿法裝柱2. 2. 流動(dòng)相及其流速的選擇：流動(dòng)相及其流速的選擇： 選粘度小、低流速的流動(dòng)相選粘度小、低流速的流動(dòng)相甲醇，甲醇， 約約1ml/min 1ml/min 3. 3. 柱溫的選擇：選室溫柱溫的選擇：選室溫25250 0C C左右左右2. 2. 固定相及分離柱固定相及分離柱 氣相色譜中的固定液原則上都可以用于液相色譜，其氣相色譜中的固定液原則上都可以用于液相色譜，其選用原則與氣相色譜一樣。選用原則與氣相色譜一樣。 選擇合適的固定相，降低填料粒度可顯

32、著提高柱效，選擇合適的固定相，降低填料粒度可顯著提高柱效，但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項(xiàng)技術(shù)要求非常但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項(xiàng)技術(shù)要求非常高的工作，一般很少自行制備。高的工作，一般很少自行制備。 選擇短柱、細(xì)內(nèi)徑提高分析速度；選擇短柱、細(xì)內(nèi)徑提高分析速度； 研制高效柱填料是一活躍領(lǐng)域。研制高效柱填料是一活躍領(lǐng)域。3. 3. 流動(dòng)相及流動(dòng)相的極性流動(dòng)相及流動(dòng)相的極性 （1）可顯著改變組分分離狀況的流動(dòng)相選擇在液相色譜）可顯著改變組分分離狀況的流動(dòng)相選擇在液相色譜中顯得特別重要。中顯得特別重要。 液相色譜的流動(dòng)相又稱為：淋洗液，洗脫液相色譜的流動(dòng)相又稱為：淋洗液，洗脫劑。劑。

33、（2）親水性固定液常采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極）親水性固定液常采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。相柱。 （3）若流動(dòng)相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液）若流動(dòng)相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。的出峰順序相反。 選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問題：選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問題：（1）盡量使用高純度試劑作流動(dòng)相，防止微量雜質(zhì)長(zhǎng)期累）盡量使用高純度試劑作流動(dòng)相，防止微量雜

34、質(zhì)長(zhǎng)期累積損壞色譜柱和使檢測(cè)器噪聲增加。積損壞色譜柱和使檢測(cè)器噪聲增加。（2）避免流動(dòng)相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞）避免流動(dòng)相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。相等。（3）試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉）試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。淀并在柱中沉積。（4）流動(dòng)相同時(shí)還應(yīng)滿足檢測(cè)器的要求。當(dāng)使用紫外）流動(dòng)相同時(shí)還應(yīng)滿足檢測(cè)器的要求。當(dāng)使用紫外檢測(cè)器時(shí)，流動(dòng)相不應(yīng)有紫外吸收。檢測(cè)器時(shí)，流動(dòng)相不應(yīng)有紫外吸收。一種新型的液體色譜，一種新型的液體色譜，19

35、64年，年，J. C. Moore首首先研究成功。先研究成功。不僅可用于小分子物質(zhì)的分離與鑒定，而且可不僅可用于小分子物質(zhì)的分離與鑒定，而且可作為用來分析化學(xué)性質(zhì)相同但分子體積不同的作為用來分析化學(xué)性質(zhì)相同但分子體積不同的高分子同系物。高分子同系物?，F(xiàn)階段，現(xiàn)階段，已經(jīng)成為最為重要的測(cè)定聚合物的分已經(jīng)成為最為重要的測(cè)定聚合物的分子量與分子量分布的方法。子量與分子量分布的方法。介紹介紹GPC以凝膠為固定相。凝膠是一種經(jīng)過交聯(lián)的、以凝膠為固定相。凝膠是一種經(jīng)過交聯(lián)的、具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和不同孔徑的多聚體的通稱。具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和不同孔徑的多聚體的通稱。如葡聚糖凝膠、瓊脂糖等軟質(zhì)凝膠；多孔硅膠、如葡聚

36、糖凝膠、瓊脂糖等軟質(zhì)凝膠；多孔硅膠、聚苯乙烯凝膠等硬質(zhì)凝膠；聚苯乙烯凝膠等硬質(zhì)凝膠；聚合物在分離柱上按聚合物在分離柱上按分子流體力學(xué)體積大小被分離開分子流體力學(xué)體積大小被分離開.濃度檢測(cè)器濃度檢測(cè)器solventsolution體積大的分子先體積大的分子先被淋洗出來被淋洗出來體積小的分子后體積小的分子后被淋洗出來被淋洗出來(1) (1) 測(cè)定原理測(cè)定原理淋出體積：自試樣進(jìn)入色譜柱到淋洗出來，所接收淋出體積：自試樣進(jìn)入色譜柱到淋洗出來，所接收到的淋出液的體積，稱為該試樣的到的淋出液的體積，稱為該試樣的淋出體積淋出體積Ve。當(dāng)儀器與實(shí)驗(yàn)條件確定后，溶質(zhì)的淋出體積與其分當(dāng)儀器與實(shí)驗(yàn)條件確定后，溶質(zhì)的

37、淋出體積與其分子量有關(guān)，分子量越大，其淋出體積越小。子量有關(guān)，分子量越大，其淋出體積越小。分子量越小，分子的體積越小，在流動(dòng)過程中，不僅分子量越小，分子的體積越小，在流動(dòng)過程中，不僅會(huì)從載體間較大空隙通過，還會(huì)從載體內(nèi)部的小孔通會(huì)從載體間較大空隙通過，還會(huì)從載體內(nèi)部的小孔通過，經(jīng)過的路程長(zhǎng)；而體積大的大分子量的分子只能過，經(jīng)過的路程長(zhǎng)；而體積大的大分子量的分子只能從載體間的空隙通過，經(jīng)過的路程短，所以最大的分從載體間的空隙通過，經(jīng)過的路程短，所以最大的分子會(huì)最先被淋洗出來。子會(huì)最先被淋洗出來。(2) (2) 體積排除機(jī)理體積排除機(jī)理溶質(zhì)分子的體積越小溶質(zhì)分子的體積越小, 其淋出體積越大其淋出體

38、積越大. 這種這種解釋不考慮溶質(zhì)與載體間的吸附效應(yīng)以及溶解釋不考慮溶質(zhì)與載體間的吸附效應(yīng)以及溶質(zhì)在流動(dòng)相和固定相中的分配效應(yīng)質(zhì)在流動(dòng)相和固定相中的分配效應(yīng), 其淋出體其淋出體積僅僅由溶質(zhì)分子的尺寸和載體的孔徑尺寸積僅僅由溶質(zhì)分子的尺寸和載體的孔徑尺寸決定決定, 分離完全是由于體積排除效應(yīng)所致分離完全是由于體積排除效應(yīng)所致, 所所以以GPC又被稱為又被稱為體積排除色譜體積排除色譜(SEC， Size Exclusion Chromatography)GPCGPC曲線曲線淋出體積代表了分子量的大小淋出體積代表了分子量的大小-M；濃度響應(yīng)代表了含量濃度響應(yīng)代表了含量-W(M)GPC曲線就是聚合物的分

39、子量分布曲線曲線就是聚合物的分子量分布曲線濃度響應(yīng)濃度響應(yīng)淋出體積或淋出時(shí)間淋出體積或淋出時(shí)間W(M)M大大小小(3) (3) 級(jí)分分子量的確定級(jí)分分子量的確定直接法：在測(cè)定淋出液濃度的同時(shí)測(cè)定其粘度直接法：在測(cè)定淋出液濃度的同時(shí)測(cè)定其粘度或光散射?；蚬馍⑸?。間接法：采用一組分子量不等、單分散的樣品間接法：采用一組分子量不等、單分散的樣品（標(biāo)樣），分別測(cè)定其淋出體積與分子量，從（標(biāo)樣），分別測(cè)定其淋出體積與分子量，從而標(biāo)定色譜柱分離的分子量與其淋出體積間的而標(biāo)定色譜柱分離的分子量與其淋出體積間的關(guān)系關(guān)系-分子量分子量-淋出體積標(biāo)定曲線淋出體積標(biāo)定曲線。分子量分子量- -淋出體積標(biāo)定曲線淋出體積

40、標(biāo)定曲線VelogMABCDV0logMalogMblogeMABV一般而言，分子量與淋出一般而言，分子量與淋出體積間具有如下關(guān)系體積間具有如下關(guān)系:當(dāng)分子量大于當(dāng)分子量大于Ma時(shí)時(shí), 曲線如何曲線如何?當(dāng)分子量小于當(dāng)分子量小于Mb時(shí)時(shí), 曲線如何曲線如何?色譜柱的分離范圍色譜柱的分離范圍: MbMaM1M2M3M4M5VeV1V2V3V4V5 普適校正原理 由于GPC對(duì)聚合物的分離是基于分子流體力學(xué)體積，即對(duì)于相同的分子流體力學(xué)體積，在同一個(gè)保留時(shí)間流出，即流體力學(xué)體積相同。 兩種柔性鏈的流體力學(xué)體積相同： 1M1=2M2 k1M11+1=k1M22+1 兩邊取對(duì)數(shù)：lgk1+(1+1)lgM1=lgk2+(2+1)lgM2 即如果已知標(biāo)準(zhǔn)樣和被測(cè)高聚物的k、值，就可以由已知相對(duì)分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)樣品M1標(biāo)定待測(cè)