X連鎖無丙種球蛋白血癥學(xué)習(xí)教案

1、會計學(xué)1X連鎖無丙種球蛋白血癥連鎖無丙種球蛋白血癥第一頁，編輯于星期日：七點 三十四分。Brief Introduction of XLA：X連鎖無兵種球蛋白血癥（X-lingked agammaglobulinemia , XLA），又稱Bruton無丙種球蛋白血癥，是最早發(fā)現(xiàn)的人類原發(fā)型免疫缺陷病（pomary immunodeficiency disease ,PID）之一，臨床上以反復(fù)細(xì)菌感染為特征，血清中各類免疫球蛋白明顯降低或缺乏，對抗原刺激不能產(chǎn)生抗體應(yīng)答，血循環(huán)中B 淋巴細(xì)胞減少，淋巴結(jié)及淋巴組織缺乏生發(fā)中心和淋巴濾泡，骨髓中無漿細(xì)胞，但前B 淋巴細(xì)胞數(shù)量正常，T淋巴細(xì)胞數(shù)量及

2、功能正常。第1頁/共18頁第二頁，編輯于星期日：七點 三十四分。BTK geneXLAmutate發(fā)病原因：發(fā)病原因：BTK屬于非受體酪氨酸蛋白激酶，該類激酶泛參與細(xì)胞信號傳導(dǎo)，影響細(xì)胞的存活、增殖和分化，BTK是B細(xì)胞發(fā)育成熟的關(guān)鍵因素、 正常人除T細(xì)胞和漿細(xì)胞外均有BTK表達(dá)，而BTK基因突變只影響B(tài)細(xì)胞的數(shù)量，這說明BTK存B細(xì)胞的生長發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用。第2頁/共18頁第三頁，編輯于星期日：七點 三十四分。The Struction of BTK Protein：（Begin from N Terminal）The number of amino acidThe locati

3、on of each exonBtk包含5個結(jié)構(gòu)域：PH結(jié)構(gòu)域(Pleckstrin homology domain)、TH結(jié)構(gòu)域(Tec homology domain)、SH3結(jié)構(gòu)域(Src homology3 domain)、SH2結(jié)構(gòu)域(Src homology2 domain)和催化結(jié)構(gòu)域(Tyrosine kinase domain)這些結(jié)構(gòu)域可以識別并結(jié)合多種信號分子，為Btk參與多種信號通路奠定基礎(chǔ)PH結(jié)構(gòu)域通過識別并結(jié)合膜磷脂的代謝產(chǎn)物磷脂肌醇三磷酸將Btk募集到細(xì)胞膜上，參與胞外刺激引發(fā)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)7TH結(jié)構(gòu)域由Btk motif和富含脯氨酸區(qū)域兩部分組成，SH3結(jié)構(gòu)域可特異

4、識別TH結(jié)構(gòu)域的富含脯氨酸區(qū)域，因此可以發(fā)生分子內(nèi)部的折疊此外，SH3結(jié)構(gòu)域還可與Syk/ZAP70等分子發(fā)生相互作用，這對下游的PKC激活有重要作用。第3頁/共18頁第四頁，編輯于星期日：七點 三十四分。BTK 突變的分子機(jī)制：突變的分子機(jī)制：Btk是許多受體的信號傳遞所必需的，如B細(xì)胞抗原受體(BCR)、CD38、白介素一5受體(IL5R)和IL10R，并作為IL6和FcaRI信號傳遞途徑的組成部分。而BCR對維持成熟B細(xì)胞的數(shù)量和對抗原的反應(yīng)能力是必不可少的。當(dāng)BCR被交聯(lián)(crosslinking)后，Btk可以被激活。目前已知，在Btk的信號傳導(dǎo)途徑中，涉及其上游的Btk激活分子和下

5、游的Btk效應(yīng)分子兩部分:作用于Btk的上游激活分子包括：(1)Src家族激酶。研究表明，當(dāng)BCR交聯(lián)后，最早發(fā)生的事件是激活Src家族激酶，后者可使Btk激酶區(qū)中的Y551酪氨酸殘基位點磷酸化，導(dǎo)致Btk激酶活性增高和SH3區(qū)的Y223酪氨酸殘基位點自身磷酸化，進(jìn)一步對下游效應(yīng)蛋白產(chǎn)生作用。(2)作用于Btk PH區(qū)的協(xié)同激活分子。通過失功能或獲得功能性突變已證明，Btk中的PH區(qū)是調(diào)節(jié)Btk活性的關(guān)鍵區(qū)域。結(jié)合在Btk PH區(qū)的多種蛋白和脂質(zhì)配體包括異三聚體G蛋白的亞單位,這些分子與BtkPH區(qū)相互作用的結(jié)果，可促進(jìn)Btl(的細(xì)胞膜定位，使Src家族激酶激活Btk。此外，由于許多PH區(qū)的配

6、體涉及G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)信號，提示Btl(可作為GPCR信號途徑的一個成分，與BCR協(xié)同或獨立于B隙信號途徑發(fā)揮作用。第4頁/共18頁第五頁，編輯于星期日：七點 三十四分。BTK 突變的分子機(jī)制：突變的分子機(jī)制：第5頁/共18頁第六頁，編輯于星期日：七點 三十四分。BTK基因拼接點突變致基因拼接點突變致XLA的基因診斷：的基因診斷：流式細(xì)胞儀檢測單核細(xì)胞BTK表達(dá)：采集患者及其家庭成員肝素抗凝的外周血，密度梯度離心分離外周血單個核細(xì)胞(PBMC)。使用抗BTK單克隆抗體標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)BTK。流式細(xì)胞儀分析PBMc上的BTK表達(dá)。 基因組DNA 和cDNA 的制備及其PCR擴(kuò)增： 每人抽取外

7、周血5 ml(肝素抗凝)，按本實驗室常規(guī)方法提取基因組DNA和RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成eDNA。根據(jù)基因庫(Genbank)中BTK 基因組DNA(序列號U78027)及mRNA(序列號X58957)的基因序列，自行設(shè)計了18對包括BTK基因19個外顯子編碼區(qū)和側(cè)翼拼接點基因組DNA 的PCR引物，3對包括BTK mRNA全長的eDNA引物，進(jìn)行21次PCR反應(yīng)，每次反應(yīng)用0.1/lg基因組DNA或eDNA作為模板。對擴(kuò)增出的cDNA 片段(命名為F、M、B)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，比較其各片段的大小。DNA的PCR擴(kuò)增和序列分析采用PCR直接測序法，用正義、反義兩對引物進(jìn)行雙向測序。上述PCR反應(yīng)

8、產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀純化后，分別以上述引物和含內(nèi)含子側(cè)翼的內(nèi)引物，總共21對止義和反義測序引物，用測序試劑盒(PEApplied Biosystems)直接進(jìn)行雙向測序。所用PCR和測序引物。用ABI Prism 377全自動測序儀(測序。第6頁/共18頁第七頁，編輯于星期日：七點 三十四分。BTK基因拼接點突變致基因拼接點突變致XLA的基因診斷結(jié)論：的基因診斷結(jié)論：單核細(xì)胞上BTK蛋白的表達(dá)：流式細(xì)胞儀測得患兒單核細(xì)胞上的BTK蛋白表達(dá)為0，同齡對照、母親和父親分別為7242 、3067 、5868 。BTK cDNA 片段電泳結(jié)果：電泳結(jié)果顯示患兒BTKcDNA M 片段的長度較其父母的長約81

9、個堿基。患兒父親、患兒母親、患兒的BTK cDNA F、M、B電泳分析第7頁/共18頁第八頁，編輯于星期日：七點 三十四分。BTK基因拼接點突變致基因拼接點突變致XLA的基因診斷結(jié)論：的基因診斷結(jié)論：BTK基因測序結(jié)果：患兒BTK基因全基因分析，發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子142位點堿基替換突變A G(IVS142，A G)。外祖母、母親BTK基因內(nèi)含子142位點堿基替換AG雜合突變，為攜帶者。父親BTK基因正常。BTK mRNA基因分析基因，發(fā)現(xiàn)患兒外顯子14與15之間拼接異常，分析到異常變大(多81個堿基)的mRNA。母親、外祖母、父親外顯子14與15之間分析到正常大小tuRNA。這些測序結(jié)果與國際遺傳免疫

10、缺陷病數(shù)據(jù)庫報道的BTK基因突變類型比較證實為新型的BTK基因突變。A：患兒BTK基因15外顯子反向測序結(jié)果：內(nèi)含子142位點堿基 替換突變AG(IVSI42，AG）；B：正常(父親lBTK基因15外顯子反向測序結(jié)果；C、D：分別為患兒母親和外祖母的BTK基因15外顯子反向測序結(jié)果BTK基因內(nèi)含子142位點鹼基替換AG雜合突變。為攜帶者；E：患兒BTK cDNA反向測序結(jié)果比正常BTK cDNA長81個堿基；F、G：分別為患兒父母BTK cDNA反向測序結(jié)果為正常的BTK cDNA第8頁/共18頁第九頁，編輯于星期日：七點 三十四分。XLA的診斷的診斷在年長兒或成人中，低水平的lgG(2L)和

11、低水平或無IgA、IgM是XLA的典型表現(xiàn)”。XLA患者血循環(huán)中缺乏成熟B細(xì)胞，可通過流式細(xì)胞攸測定免疫熒光標(biāo)記的CDl9和(或)CD20B細(xì)胞表達(dá)抗原此法對6十月前嬰兒診斷尤為重要。預(yù)防接種后抗體的檢測：接種滅活疫苗后無或產(chǎn)生較弱的抗體；或注入新抗原，噬菌體, Xl74，可發(fā)現(xiàn)由于無抗體產(chǎn)生或抗體合成受抑而導(dǎo)致的抗原清除延遲。Btk基因的突變分析是XLA的確診實驗第9頁/共18頁第十頁，編輯于星期日：七點 三十四分。第10頁/共18頁第十一頁，編輯于星期日：七點 三十四分。 免疫球蛋白替代療法（治標(biāo)） IVIG; IMIG; alloBMT（治本）治療治療:第11頁/共18頁第十二頁，編輯于

12、星期日：七點 三十四分。IVIG治療XLA,其起始量一般為400600m/kg，然后根據(jù)患兒對治療的反應(yīng)束調(diào)整用藥劑量及給藥間隔和頻率必領(lǐng)個體化，使免疫球蛋白維持在正常的上限水平；一研究機(jī)構(gòu)比較了不同劑量的IVIG與肌肉注射免疫球蛋白(IMIG)的療效差別，結(jié)果顯示每3周接受大劑量IVIG(400mg/kg)并保持血清IgG正常或接近正常值低限(4g/L)組的患兒住院率、感染率較每3劇接受低劑量IVIG(200mg/kg)或IMIG明顯減少。早期開始大劑量IVIG治療的患兒其肺炎、化膿性腦膜炎及胃腸道感染的發(fā)生率明顯降低?；谶@些原困許多研究中心在嬰兒期(生后后6個月)就開始IVIG治療。免疫

13、球蛋白替代療法（治標(biāo)）免疫球蛋白替代療法（治標(biāo)）第12頁/共18頁第十三頁，編輯于星期日：七點 三十四分。免疫球蛋白替代療法缺陷：免疫球蛋白替代療法缺陷：盡管免疫球蛋白冶療是XLA的重大進(jìn)展，但它只能替代IgG而不能建立主動免疫；雖然IVIG可明顯降低患兒感染的頻率和嚴(yán)重程度，卻不能杜絕感染。第13頁/共18頁第十四頁，編輯于星期日：七點 三十四分。第14頁/共18頁第十五頁，編輯于星期日：七點 三十四分。 allo-BMT（治本）的討論及預(yù)后（治本）的討論及預(yù)后通過allo-BMT治療免疫缺陷性疾病，可重建正常的免疫系統(tǒng)?？梢詮浹a(bǔ)丙種球蛋白替代治療的缺陷：治療費用昂貴，且長期應(yīng)用，患者的依從性差。后重建體液免疫多年健康存活，不再需要替代治療，生活質(zhì)量得到明顯提高，因此allo-BMT治療是有意義的。預(yù)處理有的使用TBI方案，確保Bu有效血藥濃度，會出現(xiàn)難以接受的不良反應(yīng)。但多數(shù)是采用改良的BUCY方案，用Bu1620mg/kgC