南農(nóng) 細胞生物學 11

1、第十三章細胞衰老-5凋亡第一節(jié) 細胞衰老早期的細胞衰老研究 關于細胞衰老(cellular aging或cell senescence)的研究，在衰老生物學中占有特殊的地位。大量研究表明，衰老實際上也是一種細胞的重要生命活動。然而對這一問題的認識過程卻是漫長而曲折的。 大約在100年前，當魏斯曼提出種質(zhì)不死而體質(zhì)會衰老和死亡的學說時，他是將單細胞生物，特別是原生動物排除在外的。確實，當時觀察到原生動物的某些無性系可以長期保持很高的分裂速度，因此關于原生動物不死的說法曾經(jīng)廣為流行。但以后的研究卻發(fā)現(xiàn)原生動物的細胞分裂不是均等的，新細胞的結構成分并不是完全更新的，新細胞中也存在著老化的結構成分；少

2、數(shù)強壯的無性系的存在并不能否定原生動物細胞衰老的事實。因此關于原生動物細胞“不死性”的說法就逐漸被廢棄了，代之而起的是關于某些無性系的穩(wěn)定性的觀點。 然而，當Carrel和Ebeling宣布他們培養(yǎng)的雞心臟細胞可以無限制地生長和分裂(直到他們報告時，已連續(xù)培養(yǎng)了34年)時，細胞“不死性”的觀點不但卷土重來，而且?guī)缀跞〉昧藳Q定性的勝利。后來他們還報告說，雞胚成纖維細胞在離體培養(yǎng)條件下的生長速度與培養(yǎng)基中加入的雞血漿供體年齡呈負相關，似乎表明年老動物的血漿中存在有衰老因子。他們認為細胞本身不會衰老，衰老是由于環(huán)境的影響。20世紀4050年代L系小鼠細胞和HeLa細胞系的建立，又使細胞“不死性”的觀

3、點的統(tǒng)治地位更加鞏固了。根據(jù)這種觀點，細胞本身沒有衰老和死亡，衰老只是一種多細胞現(xiàn)象，多細胞生物體內(nèi)觀察到的細胞衰老，起因不在細胞本身，而是由于體內(nèi)、體外環(huán)境的影響。這種觀點在60年代初，主要由于Hayflick等人的工作而受到猛烈的沖擊，并從根本上動搖了。 二、Hayflkk界限 1961年，Hayflick和Moorhead報告說，培養(yǎng)的人二倍體細胞表現(xiàn)出明顯的衰老、退化和死亡的過程。若以1：2的比率連續(xù)進行傳代(群體倍增)，則平均只能傳代4060次，此后細胞就逐漸解體并死亡。Hayflick等的發(fā)現(xiàn)很快就得到許多研究者的證實。他們的工作表明，細胞，至少是培養(yǎng)的細胞，不是不死的，而是有一定

4、的壽命；它們的增殖能力不是無限的，而是有一定的界限，這就是有名的Hayflick界限(HayflickLimitation)。Hayflick等的工作是對Carrel等人堅持的關于細胞“不死性”的學說的徹底否定。此外，運用現(xiàn)代的培養(yǎng)技術并不能重復出Carrel所觀察到的培養(yǎng)細胞無限生長的現(xiàn)象。Hayflick認為Carrel每次向培養(yǎng)基中加入的雞胚提取物可能混雜人了新鮮的細胞。而不死的HeLa細胞和 L系小鼠細胞已被證明是不正常的細胞，它們的染色體數(shù)目或形態(tài)已經(jīng)不同于原先的細胞了。此外，Hayflick等還發(fā)現(xiàn)，從胎兒肺得到的成纖維細胞可在體外條件下傳代50次，而從成人肺得到的成纖維細胞只能傳

5、代20次，可見細胞的增殖能力與供體年齡有關。這一現(xiàn)象也為許多研究者所證實。Goldstein選用了早老癥(Hayflick-Guilford綜合癥)及Werner氏綜合癥患者的成纖維細胞進行培養(yǎng)。這兩種病的患者表現(xiàn)出極其明顯的衰老特征，例如9歲的早老癥患者組織中已經(jīng)有老年色素的沉積，外貌看起來就像70多歲的人那樣老，通常在20歲前死去。從這種病人身上得到的成纖維細胞在體外只能傳代24次，其DNA合成亦較少，且細胞表面不具有正常成纖維細胞所具有的HLA抗原標記。Wern er氏綜合癥患者的成纖維細胞在體外培養(yǎng)條件下的行為亦大體相同。這些研究有力地說明，體外培養(yǎng)的二倍體細胞的增殖能力反映了它們在體

6、內(nèi)的衰老狀況。 Hayfiick還比較了取自壽命長度不同的生物的胚成纖維細胞在體外培養(yǎng)條件下的傳代數(shù)和壽命，發(fā)現(xiàn)物種壽命與培養(yǎng)細胞壽命之間存在著確定的相關關系，例如Galapagos龜平均最高壽命最長，達175歲，其培養(yǎng)細胞的傳代數(shù)亦最多，達 90125次；小鼠平均最高壽命為35年，其培養(yǎng)細胞的傳代次數(shù)亦少，僅14 28次。 為了確定培養(yǎng)的人二倍體細胞的衰老是細胞本身決定的還是由于培養(yǎng)環(huán)境的惡化(例如培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏，細菌的污染或有毒物質(zhì)的積累)， Hayflick設計了巧妙的實驗：他以間期有無巴氏小體作為供體細胞的標記，將取自老年男性個體的細胞(間期無巴氏小體)和取自年輕女性個體的細胞

7、(間期可見巴氏小體)進行單獨或混合培養(yǎng)，并統(tǒng)計其倍增次數(shù)；結果發(fā)現(xiàn)，混合培養(yǎng)中的兩類細胞的倍增次數(shù)與各自單獨培養(yǎng)時相同，即在同一培養(yǎng)基中，當年輕細胞旺盛增殖的同時，年老細胞就停止生長了。這一結果有力地說明，決定細胞衰老的因素在細胞內(nèi)部，而不在外部環(huán)境。為了進一步探求體外培養(yǎng)的二倍體細胞衰老表達的控制機理，Wright和Hayflick用細胞松弛素B處理細胞，然后離心以除去細胞核，得到胞質(zhì)體(cytoplast)，再用胞質(zhì)體與完整細胞進行雜交，觀察雜 種細胞衰老的表達。結果發(fā)現(xiàn)，年輕的細胞胞質(zhì)體與年老的完整細胞融合時，得到的雜種細胞不能分裂；而年老的細胞胞質(zhì)體與年輕的完整細胞融合時，雜種細胞的分

8、裂能力與年輕細胞幾乎相同。這一實驗的結果說明，是細胞核而不是細胞質(zhì)決定了細胞衰老的表達。至此，Hayflick界限，即關于細胞的增殖能力和壽命是有限的觀點，為廣大的研究者所接受，認為適用于很多類型的細胞；對于這些細胞來說，衰老是不可避免的，衰老的原因在于細胞本身。三、細胞在體內(nèi)條件下的衰老 實際上，在生活有機體內(nèi)，細胞的衰老和死亡是常見的現(xiàn)象，甚至在個體發(fā)育的早期也會發(fā)生。例如蝌蚪發(fā)育時尾和鰓的消失就是通過細胞的死亡而實現(xiàn)的。但體內(nèi)細胞類型不同，其增殖狀況各異。神經(jīng)元及心肌細胞在發(fā)育的早期即已停止分裂，成為固定的有絲分裂后細胞，爾后它們逐漸衰老和死亡。人腦在衰老時神經(jīng)元的不斷喪失即是一個明證。

9、肝細胞、軟骨細胞屬于回復性分裂后細胞，它們通常不分裂，但終身保持分裂能力，例如部分切除肝細胞后，剩余的肝細胞即能進行旺盛的同步分裂。引起人們最大興趣的要算那些在正常情況下終生保持分裂的細胞，如骨髓細胞，上皮細胞等。它們的分裂能力是否隨著有機體年齡的增高而下降?它們會不會衰老?這些問題引起了研究者們極大的興趣。 以往曾有人研究過不同年齡BCF，小鼠小腸腺窩上皮細胞的周期長度，發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增高，細胞周期長度明顯延長。2月齡小鼠細胞周期總長度為 101h，而27月齡者竟達152h，延長50?？梢娝ダ蟿游矬w內(nèi)，細胞分裂速度顯著減慢，其原因主要是G，期明顯延長，S期的長度變化不大。其他研究者的工作亦得

10、到大體相同的結論。然而細胞周期的延長，亦即細胞分裂能力的下降的原因是什么?是由于細胞本身的衰老，還是由于體內(nèi)環(huán)境的惡化?為了解答這個問題，研究者們采用了組織移植技術。Krohn用近交系小鼠進行皮膚移植實驗。他將小鼠的皮膚移植到其F，后代身上，當F1變老時，又移植到F2身上，這樣他進行了系列移植，結果移植的皮膚細胞可生活78年，遠遠超過其原來供體的壽命，這表明引起小鼠皮膚細胞在體內(nèi)衰老的主要是體內(nèi)環(huán)境。Daniel用小鼠乳腺上皮進行了系列移植實驗，如果兩次移植的間隔時間為1年，則可存活6年，也明顯長于小鼠的壽命，說明衰老個體內(nèi)的環(huán)境因素影響了上皮細胞的增殖和衰老。 研究得最為充分的要算骨髓干細胞

11、的移植。骨髓干細胞產(chǎn)生淋巴細胞、紅血細胞、粒細胞及血小板的前體細胞。Hirokawa等將老年動物進行強輻射處理，破壞其免疫干細胞，然后移植人年輕動物的骨髓和新生小鼠的胸腺，結果觀察到年老受體動物細胞免疫功能復壯。這似乎表明免疫功能的復壯是由于年輕動物的干細胞取代了原來老化了的干細胞。Astle和Hirokawa(1984)重復并證實了Hirokawa等的實驗，他們還發(fā)現(xiàn)，如果移植的骨髓干細胞是來自年老的動物，那么免疫反應就仍然保持在較低的水平上，不會復壯。他們認為免疫反應是 否復壯，關鍵在于供體與受體的年齡組合。他們的結論是，老年動物干細胞的免疫缺陷只是在老年受體中才表達。進一步的研究表明老年

12、動物體內(nèi)似乎存在有阻抑細胞或阻抑因子，抑制了免疫反應。 總之，根據(jù)以上的研究，雖然不能認為骨髓干細胞沒有衰老，但可以說，它們的衰老至少是比較緩慢的。揭示干細胞衰老緩慢的機理，對于了解衰老的本質(zhì)，無疑是十分重要的。四、衰老細胞結構的變化 細胞在衰老過程中，其結構會發(fā)生深刻的變化。 (一)細胞核的變化 在體外培養(yǎng)的二倍體細胞中發(fā)現(xiàn)，細胞核的大小是倍增次數(shù)的函數(shù)，即隨著細胞分裂次數(shù)的增加，核不斷增大。 細胞核結構的衰老變化中最明顯的是核膜的內(nèi)折(inva畫na“。n)，這在培養(yǎng)的人肺成纖維細胞中比較明顯。在體內(nèi)細胞中也可觀察到核膜不同程度的內(nèi)折，神經(jīng)細胞尤為明顯，這種內(nèi)折與年齡俱增。核膜內(nèi)折在老年小

13、鼠的普肯耶細胞、海馬、垂體前葉及肝細胞中均可觀察到。染色質(zhì)固縮化是衰老細胞核中的另一個重要變化。體外培養(yǎng)的細胞中，晚代細胞的核里可明顯看到染色質(zhì)的固縮化，而早代細胞的核只有輕微的固縮作用。除了培養(yǎng)細胞外，體內(nèi)細胞，如老年果蠅的細胞，老年靈長類的垂體細胞及大鼠頜下腺的腺泡細胞中，都可觀察到染色質(zhì)的固縮化。染色質(zhì)固縮作用與染色質(zhì)蛋白的二硫鍵有關。此外，在酵母 Sgsl突變體衰老細胞中還觀察到核仁裂解為小體的現(xiàn)象。 (二)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的變化 Hasan和Glees比較了不同年齡大鼠海馬細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結構，發(fā)現(xiàn)年輕動物的細胞中，糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)育良好，排列有序；而在年老動物中，這種有序的排列已不復存在，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)成分

14、彌散性地分散于核周胞質(zhì)中。在衰老大鼠的側前庭核及小腦普肯耶細胞中，均觀察到糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)解體的趨勢。在光學顯微鏡下用堿性染料染色，可以觀察到小鼠和人的大腦及小腦某些神經(jīng)元中尼氏物質(zhì)的含量隨年齡增長而下降，而尼氏小體實際上代表了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體群。觀察體外培養(yǎng)的人胚肺成纖維細胞，發(fā)現(xiàn)26次倍增以前的細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜腔膨脹擴大，含有不定形的致密物質(zhì)，且為核糖體所覆蓋；而40次倍增以后的細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜腔未見膨脹，所含不定形致密物質(zhì)亦少，且具無核糖體覆蓋區(qū)段?？偟恼f來，衰老細胞中糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的總量似乎是減少了。 (三)線粒體的變化 多數(shù)研究者的工作表明，細胞中線粒體的數(shù)量隨年齡增大而減少，而其體積則隨年齡增大而增大

15、。例如在衰老小鼠的神經(jīng)肌肉連接的前突觸終末中可以觀察到線粒體數(shù)量隨年齡增大而減少。同時許多報告表明，在小鼠、大鼠及人肝的衰老細胞中，線粒體發(fā)生膨大。膨大的線粒體中有時可見到清晰的嵴，偶爾亦會 觀察到線粒體內(nèi)容物呈現(xiàn)網(wǎng)狀化并形成多囊體，以及外膜破壞，多囊體釋出的情況。 在培養(yǎng)的人成纖維細胞中，還觀察到兩種不同類型的線粒體：I型固縮緊密，型大而稀疏，通常每個細胞只含一種類型的線粒體；隨著倍增次數(shù)的增加， I型線粒體越來越多。 (四)致密體的生成 致密體(densebodies)是衰老細胞中常見的一種結構，絕大多數(shù)動物細胞在衰老時都會有致密體的積累。除了致密體外，這種細胞成分還有許多不同的名稱，如脂

16、褐質(zhì)(Upofuscin)、老年色素(ageOrsenilepigment)、血褐質(zhì)(hemofuscin)、脂色素(1ipochrome)、黃色素(yellowpigment)、透明蠟體(hyaloceroid)及殘體 (residualbodies)等等。致密體的發(fā)現(xiàn)可上溯至19世紀，但只是近年來才逐漸弄清了它們的起源。較近的研究提供了大量證據(jù)，表明致密體是由溶酶體或線粒體轉化而來。多數(shù)致密體具單層膜且有陽性的磷酸酶反應，這和溶酶體是一致的。少數(shù)致密體顯然是由線粒體轉化而來，因為可以看到雙層膜結構，有時嵴的結構也依稀可見。脂褐質(zhì)通常產(chǎn)生自發(fā)熒光，它是自由基誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化作用的產(chǎn)物。 (五

17、)膜系統(tǒng)的變化 年輕的功能健全的細胞的膜相是典型的液晶相，這種膜的脂雙層比較柔韌，脂肪酸鏈能自由移動，每個脂質(zhì)分子與其相鄰分子之間的位置交換極其頻繁，埋藏于其中的蛋白質(zhì)分子表現(xiàn)出最大的生物學活性。衰老的或有缺陷的膜通常處于凝膠相或固相，這時磷脂的脂肪酸尾被“凍結”了，完全不能自由移動，而膜就變?yōu)閯傂缘牧?，因此埋藏于其中的蛋白質(zhì)也就不能再運動了；在機械刺激或壓迫等條件下，膜就會出現(xiàn)裂隙，其選擇透性及其他功能均受到損害。 此外，細胞衰老時，細胞間間隙連接及膜內(nèi)顆粒的分布也發(fā)生變化。間隙連接在細胞間離子和小分子代謝物的交換上起著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)的 IMR90晚代細胞的間隙連接明顯減少，組成

18、間隙連接的膜內(nèi)顆粒聚集體變小。為了觀察間隙連接的變化對細胞間的代謝聯(lián)系產(chǎn)生的影響，研究者們還用放射自顯影技術來研究重建間隙連接的年輕或年老細胞間3H脲嘧啶核苷酸的交換。結果發(fā)現(xiàn)，重新集聚4 h后，70的年輕細胞從共同培養(yǎng)的年輕供體細胞得到3H脲嘧啶，而只有30的年老細胞從共同培養(yǎng)的年老供體細胞中得到了這種物質(zhì)。這表明，衰老時間隙連接的減少，使細胞間代謝協(xié)作減少了。 用冷凍斷裂法可以看到細胞膜P面的膜內(nèi)顆粒在年老細胞中明顯減少，而正面顆粒相對增加，但總顆粒數(shù)的變化不顯著。這種變化反映了衰老細胞中膜內(nèi)顆粒在膜平面上進行側向運動能力的喪失。五、細胞衰老的分子機制 20世紀90年代以來，關于細胞衰老的

19、分子機制的研究有了重大進展，最突 出的成果有：單基因的突變導致壽命的顯著延長，對這些基因的克隆及其產(chǎn)物特性和功能的研究，使我們對細胞衰老的分子機制的認識大大加深了；端粒和端粒酶與細胞衰老關系的發(fā)現(xiàn)，提供了控制細胞衰老的新途徑，除此以外，在其他一些有關衰老機制的研究上，也取得了不同程度的進展。 (一)氧化性損傷學說的發(fā)展 早在20世紀50年代，Harman就已提出衰老的自由基理論，以后又不斷有所發(fā)展。這一理論認為，代謝過程中產(chǎn)生的活性氧基團或分子(reactiveoxygen species，ROS)引發(fā)的氧化性損傷的積累，最終導致衰老。細胞從外界吸收的氧中約有23變成了ROS，ROS主要有三種

20、類型：·02，即超氧自由基；·OH，即羥自由基；H202。它們的高度活性，引發(fā)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸分子的氧化性損傷，從而導致細胞結構的損傷乃至破壞。例如ROS可以氧化不飽和脂肪酸，并產(chǎn)生過氧化脂質(zhì)，后者進一步分解，產(chǎn)生小分子醛類物質(zhì)，進而引起蛋白質(zhì)等大分子的交聯(lián)。根據(jù)衰老的自由基理論，清除ROS，就可以延長壽命。事實也確實如此。近年來發(fā)現(xiàn)，超表達CuZnSOD和過氧化氫酶的轉基因果蠅壽命比野生型長34；而將人SODl的基因轉入成年果蠅的運動神經(jīng)元中，使果蠅壽命延長40。差不多同時，有人在線蟲中發(fā)現(xiàn)了一個ageI突變體，其壽命為野生型的兩倍，且其SOD及過氧化氫酶活性及對ROS

21、的抵抗力均比野生型高。那末，age 5和SOD的基因有什么關系?它們是否是同一個基因呢?研究者克隆了線蟲SOD的基因，發(fā)現(xiàn)其位置在tra 2和UTIC。4兩個位點之間，這和當時推定的ageJ基因的位置重疊，從而燃起了人們的希望。如果這二者是同一基因，那末age 5突變體的長壽應歸因于SOD的抗氧化功能了。然而，很快就發(fā)現(xiàn)，這兩個基因在位置上有一定的距離，從而否定了當初的猜想?，F(xiàn)在我們知道，ageI基因編碼磷脂酰肌醇3激酶的p110催化亞基，其產(chǎn)物介導磷脂酰肌醇的信號傳遞路線，而和抗氧化作用無關。 進一步的研究更使人們對SOD這一類抗氧化因子對衰老的影響提出了疑問，有人將小鼠的谷胱甘肽過氧化物酶

22、基因及SODl、SOD2和SOD3基因中的一種剔除，并未引起衰老的加速。 除了age 5基因外，近年來還在線蟲中發(fā)現(xiàn)了另一種和壽命的延長有關的基因，即clkJ基因。這個基因是酵母中參與CoQ合成的Cat5基因的同類物。確實線蟲的clk I突變體中CoQ含量也較低。CoQ是線粒體呼吸鏈的成員， CoQ的缺乏，使電子傳遞減慢，ROS的形成減少，代謝變慢，這可能是cigJ突變體壽命較長的原因。 (二)端粒與衰老 端粒(telomere)是染色體末端的一種特殊結構，其DNA由簡單的串聯(lián)重復序列組成。它們在細胞分裂過程中不能為DNA聚合酶完全復制，因而隨著細胞分裂的不斷進行而逐漸變短，除非有端粒酶(te

23、lomerase)的存在。端粒酶是一種核糖核蛋白酶，由RNA和蛋白質(zhì)組成。端粒酶RNA是合成端粒DNA的模板，而端粒酶的反轉錄酶亞基(在人細胞中為hTRT)則催化端粒DNA的合成。 合成的端粒重復序列加在染色體的末端。人的染色體端粒由TTAGGG CCCTAA重復序列組成。在生殖細胞中，由于存在端粒酶的活性，端粒保持約 15 kb的長度，而在人的體細胞中，由于不存在端粒酶的活性，端粒要短得多。 1990年Harley等人用人工合成的(TTAGGG)，作為探針，對胎兒、新生兒、青年人及老年人的成纖維細胞的端粒長度進行測定，發(fā)現(xiàn)端粒長度隨年齡增長下降。在體外培養(yǎng)的成纖維細胞中，端粒長度則隨著分裂次

24、數(shù)的增加而下降。在這些研究的基礎上，提出了細胞衰老的“有絲分裂鐘”學說，該學說認為，隨著細胞的每次分裂，端粒不斷縮短；當端粒長度縮短達到一個閾值時，細胞就進人衰老。到了1998年，Wright等人提出了更加令人信服的證據(jù)。他們將人的端粒酶反轉錄酶亞基(hTRT)基因通過轉染，引入正常的人二倍體細胞(人視網(wǎng)膜色素上皮細胞和包皮成纖維細胞)，發(fā)現(xiàn)表達端粒酶的轉染細胞，其端粒長度明顯增加，分裂旺盛，作為細胞衰老指標的9半乳糖苷酶活性則明顯降低，與對照細胞形成極鮮明的反差。此外，表達端粒酶的細胞壽命比正常細胞至少長20代，且其核型正常。這一研究提供的證據(jù)確實令人信服，說明端粒長度確實與衰老有著密切的關

25、系。 當然也有不少研究報告不支持這一學說。就在同一年(1998年)，Carman等報告說，二倍體的敘利亞倉鼠胚細胞在復制分裂的各階段始終表達端粒酶，其端粒長度亦保持恒定，然而經(jīng)過2030代分裂后，仍然進入衰老。另外，某些小鼠終生保持較長的端粒，但并未因此而獲得較長的壽命；特別是剔除端粒酶基因的小鼠已經(jīng)獲得，但在其前5代中，迄今未觀察到相應的表型的變化(如壽命的縮短)。看來，衰老的“端粒鐘學說”還需要經(jīng)受更多的檢驗。 (三)rDNA與衰老 這方面的研究主要是在Scerevisiae中進行的。這種酵母的細胞分裂是不對稱的，每次分裂，產(chǎn)生一個大的母細胞和一個小的子細胞，母細胞分裂若干代后就進人衰老。

26、經(jīng)過大量的研究，已經(jīng)確定細胞衰老的步伐是由rDNA的變化所決定的。Scereuisiae中，rDNA以100200份串聯(lián)拷貝的形式存在于第12號染色體上，在酵母達到生命的“中年”時的某一時刻，通過同源重組產(chǎn)生的第一份環(huán)狀rDNA片段會膨沖而出，成為染色體外rDNA環(huán)(extrachromosomalrDNA circle，ERC)。隨著細胞分裂的不斷進行，ERC不斷復制增加。當積累到500 1 000份拷貝時，細胞就進入衰老(圖131)。用雙向電泳法也證明，年老的細胞中積累了許多密閉的環(huán)狀rDNA，而年輕細胞中則以線性的基因組DNA為主，只含有極少量的環(huán)狀rDNA。ERC的積累，導致細胞衰老，

27、并伴隨著核仁的裂解。 ERC積累引起細胞衰老的機制是在酵母中發(fā)現(xiàn)的，一般認為它適用于哺乳類中由分裂細胞組成的組織。但關于哺乳類動物細胞中環(huán)狀DNA隨年齡積累的報導并不多見，而且已知的環(huán)狀DNA不包括rDNA。這方面還需要進一步的研究。 OOOO (四)沉默信息調(diào)節(jié)蛋白復合物與衰老 沉默信息調(diào)節(jié)蛋白復合物(silencinginformationregulatorcomplex，SirCom plex)，簡稱S汀復合物，包括S汀1、S讓2、S汀3、Sid，通常存在于異染色質(zhì)中。它們一方面與RAPl和組蛋白H3114結合，一方面附在核基質(zhì)上。S汀復合物的功能是阻止它們所在位點的DNA的轉錄。在酵母

28、中，S讓復合物通常存在于端粒及與性別決定有關的HML和HMR位點上。核糖體DNA重復序列 1DNA'7 1票薯稱分離 ， 掃蕩必需 的細胞因子 死亡 圖131 酵母中ERC生成示意圖酵母rDNA由多份重復序列組成，同源重組往往發(fā)生在相鄰重復序列的某 DNA損傷點上；SGSl基因和SIR基因減緩ERC積累的速率 1994年Kennedy等發(fā)現(xiàn)，在一種被稱為SIR442的酵母突變體中，Sir3蛋白和Sir4蛋白發(fā)生重新分布的現(xiàn)象，即由端粒等處向核仁轉移，這種轉移伴隨著壽命的延長。這一研究表明，核仁的沉默化與壽命的延長有關。他們發(fā)現(xiàn)，從這個突變體中得到的Sir4蛋白，其羧基末端的121個氨基

29、酸殘基被除去。這個區(qū)域本是Sir4蛋白與端粒和HM處的RAPl蛋白相互作用的結構域。這一區(qū)域的去除，使Sir復合物得以自由定位，從端粒和HM位點轉移至核仁，使核仁的rDNA處于沉默狀態(tài)，抑制了復制，同源重組及ERC的生成和積累，從而延長了壽命。 (五)SGSl基因、WRN基因與衰老 在酵母中發(fā)現(xiàn)了一種sgsl突變體，其壽命明顯短于野生型。野生型平均分裂245代，最高分裂代數(shù)為40代；而sgsl突變體平均分裂95代，最高分裂代數(shù)為18。這表明SGSl基因的缺陷或喪失明顯影響了壽命。研究者進一步克隆了SGSi基因并分析它所編碼的蛋白，發(fā)現(xiàn)它屬于RecQ亞族的DNA解旋酶。 對sgsl突變細胞的觀察

30、，發(fā)現(xiàn)其核仁結構在年輕細胞中正常，而在年老細胞中，核仁裂解為小體。應用免疫熒光法發(fā)現(xiàn)了SGSl蛋白在細胞中的定位。超過90的細胞中，SGSl蛋白集中在核仁。核仁如果缺少SGSl蛋白就會裂解。同時，在sgsl突變細胞衰老時，可觀察到SIR蛋白向核仁的轉移，轉移至核仁的SIR蛋白有阻止核仁裂解和細胞衰老的作用。當比較正常酵母(SGSl SIR3)和(sgsllsir3)突變體時，發(fā)現(xiàn)經(jīng)12次分裂后，前者核仁裂解率為6，而后者達19，說明SIR蛋白向核仁的轉移，抑制了核仁的裂解，延長了壽命。 另一方面，近年來人們也以Werner綜合癥(WS)為對象，進行衰老機制的研究。Werner綜合癥是一種引發(fā)早

31、老的疾病。WS病人出生后10歲前基本正常； 1020歲時，缺少正常的青春期快速生長過程；20多歲時，出現(xiàn)雙眼白內(nèi)障、白發(fā)、脫發(fā)等正常人老年時才會出現(xiàn)的現(xiàn)象；30多歲時，出現(xiàn)骨質(zhì)疏松，型糖尿病，動脈粥樣硬化，腫瘤等；40歲以后，心血管病、腫瘤發(fā)生頻率大大增加。取自 WS病人的細胞在體外條件下培養(yǎng)，分裂代數(shù)比正常人的細胞少得多；其細胞中發(fā)生染色體重排，刪除突變頻率大大增加，所以WRN基因是保證正常壽命所必需的。WRN基因與SGSl基因同源。WRN蛋白含1 432個氨基酸殘基，具有 7個DNA解旋酶所特有的標志性序列。對WS病人的WRN蛋白的分析表明，不同病人的WRN蛋白發(fā)生了不同的突變，影響其正常

32、功能，造成DNA復制的嚴重障礙。用免疫熒光法也證明，正常人的成纖維細胞中，WRN蛋白位于核仁中，而來自WS病人的皮膚成纖維細胞中，觀察不到典型的WRN蛋白。這些結果表明，編碼DNA解旋酶的人WRN基因和酵母SGSl基因是保證細胞正常生命周期所必需的，如果發(fā)生突變，就會引起衰老的提前發(fā)生和壽命的縮短。 (六)發(fā)育程序與衰老 近年來，用線蟲進行的發(fā)育程序與衰老關系的研究取得了重要的進展，線蟲 (Canorhabaitiselegans)的幼蟲期持續(xù)約4天，然后達到性成熟并進入成蟲期。 成蟲期延續(xù)數(shù)周，隨即衰老死亡。當線蟲幼蟲在發(fā)育過程中遇到不良環(huán)境(如蟲口過密、食物短缺或高溫)，引起性外激素濃度的

33、變化，結果幼蟲就進入一種特殊的稱為dauer幼蟲的階段，可以延續(xù)6個月之久。dauer幼蟲全身被以厚的角質(zhì)層，口緊閉，處于休眠狀態(tài)。如果環(huán)境條件改善，dauer幼蟲又可發(fā)育為成蟲，經(jīng)過數(shù)周，完成其生活史。線蟲的這種特殊的發(fā)育模式引起了研究者的強烈興趣，因為這牽涉到發(fā)育方向的決定和壽命的延長。遺傳分析表明，存在著兩類有關 dauer幼蟲形成(dauer formation)的基因，稱為d。廠基因。第一類為do撐和 agel基因，第二類為ddJ6基因。do口編碼類胰島素受體，agel編碼磷脂酰肌醇3激酶(PI3激酶)的p110催化亞基，dd16編碼一種轉錄活化劑。野生型線蟲若處于正常條件下，dd口

34、和agel正常表達，DAF2受體蛋白及其下游的PI3激酶進行正常的信號傳導，決定了正常的成蟲發(fā)育。在饑餓或蟲口過密的條件下，d。J6基因表達，轉錄活化因子DAFl6的活性明顯增強，使線蟲朝dauer幼蟲的方向發(fā)育。在某些dd口或agel突變體中，dd口或agel基因部分得到表達。這樣，部分活化的DAF2AGEl信號傳導導致決定成蟲發(fā)育和 dauer幼蟲特異的防御機制的同時表達，其結果是完成正常的成蟲發(fā)育，而又獲得壽命的延長(延長24倍)。這些工作為衰老機制的探索提供了有意義的信息。高等哺乳動物，包括人類的發(fā)育程序要遠為復雜，要真正揭示衰老的機制需要深入持久的努力。 (七)線粒體DNA與衰老 2

35、0世紀80年代，Cummings等人曾經(jīng)提出，線粒體DNA中存在著衰老 DNA(SenDNA)。近十年來，這方面未見突破性的進展。線粒體DNA的高突變速率引起研究者的重視是毫不奇怪的。近年來，應用PCR擴增技術進一步證明，隨著年齡的增長，線粒體DNA的突變是相當顯著的。衰老的骨骼肌細胞中 165 kb的線粒體DNA產(chǎn)生了許多隨機的各不相同的刪除突變。由于線粒體 DNA參與電子傳遞鏈中某些成員的編碼，因而線粒體DNA的突變可能導致電子傳遞鏈不能執(zhí)行其正常功能。例如某種刪除突變引起細胞色素氧化酶的缺失，從而干擾了電子傳遞。結果引起ATP水平和NADNADH比率的下降，促進了ROS的生成，反過來又引

36、起線粒體DNA產(chǎn)生更多的突變。 雖然線粒體DNA突變的積累對細胞衰老產(chǎn)生一定的影響，然而這可能不是引起衰老的初始原因。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，線蟲的agel基因的突變引起壽命的延長，同時也明顯減緩了線粒體DNA丟失突變的積累。這表明線粒體DNA的突變可能處于受agel突變直接影響的其他衰老事件的下游。 總的來說，細胞衰老機制的研究在近十年中確有不少建樹，但謎底的真正揭曉，還要走相當長的路。 第二節(jié) 細胞凋亡細胞凋亡的概念及其生物學意義 細胞凋亡一詞，即apoptosis(apo-ptosis)，源自古希臘語，意指花瓣或樹葉的脫落、凋零。選用這一名詞，是強調(diào)這一過程是一種自然的生理學過程。細胞凋亡是一

37、個主動的由基因決定的自動結束生命的過程。由于細胞凋亡受到嚴格的由遺傳機制決定的程序性調(diào)控，所以也常常被稱為細胞編程性死亡(pro grammedcelldeath，PCD)。PCD最初是發(fā)育生物學中提出的概念，其含義是發(fā)育過程中(例如幼蟲發(fā)育為成蟲)發(fā)生的某類細胞(例如肌肉細胞)的大量死亡，而這種細胞死亡要求一定的基因表達。 在生物的生長發(fā)育過程中，細胞有絲分裂固然是十分重要的事件，但細胞凋亡也是不可或缺的另一個重要方面。細胞凋亡對于多細胞生物個體發(fā)育的正常進行，自穩(wěn)平衡的保持以及抵御外界各種因素的干擾方面都起著非常關鍵的作用。通過細胞凋亡，有機體得以清除不再需要的細胞，而不引起炎癥反應。在發(fā)

38、育過程中，幼體器官的縮小和退化如蝌蚪尾的消失等，都是通過細胞凋亡來實現(xiàn)的。在成熟個體的組織中，細胞的自然更新，被病原體感染細胞的清除也是通過 PCD來完成的。在發(fā)育過程中和成熟組織中細胞發(fā)生凋亡的數(shù)量是驚人的。健康的成人體內(nèi)，在骨髓和腸中，每小時約有10億個細胞凋亡。脊椎動物的神經(jīng)系統(tǒng)在發(fā)育過程中，約有50的細胞凋亡，通過細胞凋亡來調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞的數(shù)量，使之與需要神經(jīng)支配的靶細胞的數(shù)量相適應。胚胎發(fā)育過程中產(chǎn)生了過量的神經(jīng)細胞，它們競爭靶細胞所分泌的生存因子。只有接受了足夠量的生存因子的神經(jīng)細胞才能存活，其他的細胞則發(fā)生凋亡。實際上，發(fā)育過程中手和足的成形過程就伴隨著細胞的凋亡。胚胎時期，它們呈

39、鏟狀，以后指或趾之間的細胞凋亡，才逐漸發(fā)育為成形的手和足(圖132)。淋巴細胞的克隆選擇過程中，細胞凋亡更是起著關鍵的作用。此外，各種殺手免疫細胞對靶細胞的攻擊并引起其死亡，也是基于細胞凋亡。另一方面，細胞凋亡的失調(diào)包括不恰當?shù)募せ罨蛞种茣е录膊?，例如Alzheimer氏病、各種腫瘤、艾滋病以及自身免疫病等。 細胞凋亡的現(xiàn)象最早是Kerr在1965年觀察到的。他發(fā)現(xiàn)大鼠肝細胞，在局部缺血條件下連續(xù)不斷地轉化為小的圓形的細胞質(zhì)團，這些細胞質(zhì)團是由膜包裹的細胞碎片(包括細胞器和染色質(zhì))組成。當時他稱這種現(xiàn)象為“皺縮型壞死”。但后來，他覺得這一名稱并不恰當，因為這些圓形細胞質(zhì)團是在生理條件下產(chǎn)生的

40、。經(jīng)過深思熟慮后，他于1972年將這一現(xiàn)象重新定名為細胞凋亡。此后，細胞凋亡很快就受到各國科學家的重視，進行了深入的研究，進入20世紀 90年代，有關細胞凋亡的研究更是蓬勃發(fā)展，每隔數(shù)周就有重要的突破性的報告發(fā)表，進展之快，不是一般的生物學領域能夠望其項背的?，F(xiàn)在我們對細胞凋 亡的機制已經(jīng)有了比較清晰的了解，當然不少細節(jié)仍需進一步闡明；細胞凋亡與疾病關系的研究也已取得長足的進展。有理由相信，細胞凋亡的研究成果，將為人類某些重大疾病的治療和控制提供有力的武器。 圖132 小鼠趾間經(jīng)特異性染色所觀察到的凋亡形態(tài)細胞凋亡過程中的小鼠趾；B：一天后的小鼠趾(引自MDJacobson e(。)細胞凋亡的

41、形態(tài)學和生物化學特征 (一)細胞凋亡與壞死 細胞凋亡與壞死(necrosis)是兩種截然不同的細胞學現(xiàn)象。如前所述，細胞凋亡是一種主動的由基因決定的細胞自我破壞的過程，而壞死則是極端的物理、化學因素或嚴重的病理性刺激引起的細胞損傷和死亡。二者的主要區(qū)別是：細胞凋亡過程中，細胞膜反折，包裹斷裂的染色質(zhì)片段或細胞器，然后逐漸分離，形成眾多的凋亡小體(apoptoticbodies)，凋亡小體則為鄰近的細胞所吞噬，整個過程中，細胞膜的整合性保持良好，死亡細胞的內(nèi)容物不會逸散到胞外環(huán)境中去，因而不引發(fā)炎癥反應；相反，在細胞壞死時，細胞膜發(fā)生滲漏，細胞內(nèi)容物，包括膨大和破碎的細胞器以及染色質(zhì)片段，釋放到

42、胞外，導致炎癥反應(圖133)。我們在下面將會講到，細胞凋亡的機制及其調(diào)控是極其復雜的，在長期的進化過程中形成的這種復雜的機制對于維持生物體的正常功能是極其重要的。 (二)細胞凋亡的形態(tài)學特征 細胞凋亡的發(fā)生過程，在形態(tài)學上可分為三個階段：凋亡的起始。這一階段的形態(tài)學變化表現(xiàn)為細胞表面的特化結構如微絨毛的消失，細胞間接觸的消失，但細胞膜依然完整，未失去選擇透性；細胞質(zhì)中，線粒體大體完整，但核糖體逐漸從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上脫離，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊腔膨脹，并逐漸與質(zhì)膜融合；染色質(zhì)固縮，形成新月形帽狀結構等形態(tài)，沿著核膜分布。這一階段經(jīng)歷數(shù)分鐘，然后進人第二階段；凋亡小體的形成。首先，核染色質(zhì)斷裂為大小不等的片段，與某些

43、細胞器如線粒體一起聚集，為反折的細胞膜所包圍。從外觀上看，細胞表面產(chǎn)生了許多泡狀或芽狀突起(圖134)。以后，逐漸分隔，形成單個的凋亡小體；凋亡小體逐漸為鄰近的細胞所吞噬并消化。從細胞凋亡開始，到凋亡小體的出現(xiàn)才數(shù)分鐘，而整個細胞凋亡過程可能延續(xù)49 h。 圖133 細胞凋亡與壞死的比較 1正常細胞；2細胞凋亡的起始，染色質(zhì)固縮、分離并沿核膜分布，細胞質(zhì)亦發(fā)生固縮；3凋亡中的細胞，細胞膜反折，包圍細胞碎片，如染色質(zhì)片斷和細胞器，形成芽狀突起，以后逐漸分隔，形成凋亡小體；4凋亡小體被鄰近細胞吞噬；5壞死的早期階段，染色體形成串狀片段，細胞器膨脹，線粒體基質(zhì)呈絮狀；6壞死的最后階段，細胞膜破裂，細

44、胞解體內(nèi)容物散逸 (三)細胞凋亡的生化特征 在caspase家族半胱氨酸蛋白酶在凋亡中的關鍵作用(見后)發(fā)現(xiàn)以前，人們所認識到的細胞凋亡的最主要特征是DNA發(fā)生核小體間的斷裂，結果產(chǎn)生含有不同數(shù)量核小體單位的片段，在進行瓊脂糖凝膠電泳時，形成了特征性的梯狀條帶(DNAladders)，其大小為180200bp的整數(shù)倍。到目前為止，梯狀條帶仍然是鑒定細胞凋亡最可靠的方法。催化DNA降解的是依賴于CMg”的核酸內(nèi)切酶，而Zn2則抑制其活性。 凋亡細胞的另一個重要特征是tTG(組織轉谷氨酰胺酶dssuetransglutami- nase)的積累并達到較高的水平。tTG催化某些蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，主

45、要是通過建立谷氨酰胺和賴氨酸之間的交聯(lián)以及多胺摻人蛋白質(zhì)而實現(xiàn)的，其結果導致蛋白質(zhì)聚合。這類蛋白聚合物不溶于水，不為溶酶體的酶所降解，它們進入凋 亡小體，有助于保持凋亡小體暫時的完整性，防止有害物質(zhì)的逸出。tTG只在不再分裂的、已完成分化的細胞中處于活性狀態(tài)。tTG是依賴于Ca2的酶，在生活的正常細胞中，由于Ca2濃度較低(<1Pm。lL)，tTG的活性很低；當?shù)蛲銎鹗紩r，Ca2濃度上升，從而使tTG活化。 圖134 正常與凋亡細胞形態(tài)比較 A：正常T細胞雜交瘤細胞(掃描電鏡)；B：凋亡T細胞雜交瘤細胞(掃描電鏡) C：膜出泡抑制劑處理的凋亡細胞(透射電鏡) (四)誘導細胞凋亡的因子 誘

46、導細胞凋亡的因子大致可分為兩大類： (1)物理性因子：包括射線(如紫外線、丁射線等)，較溫和的溫度刺激(如熱激、冷激)等。 (2)化學及生物因子：包括活性氧基團和分子(如超氧自由基、羥自由基、 H202)、鈣離子載體、VK3、視黃酸、細胞毒素(如fumonisins和AAL毒素)。DNA和蛋白質(zhì)合成的抑制劑(如環(huán)己亞胺)、正常生理因子(如激素、細胞生長因子等)的失調(diào)，腫瘤壞死因子。(TNFa)，抗FasApo1CD95抗體等。 (五)細胞凋亡的檢測 細胞凋亡的檢測是基于凋亡細胞所形成的形態(tài)學和生物化學特征，特別是 DNA的斷裂。 1形態(tài)學觀測 應用各種染色法可觀察到凋亡細胞的各種形態(tài)學特征，有

47、些染料如臺盼藍 (trypanblue)為活細胞排斥，但可使死細胞著色。DAPI是常用的一種與DNA結合的熒光染料。借助DAPI染色，可以觀察到細胞核的形態(tài)變化。Giemsa染色法可以觀察到染色質(zhì)固縮、趨邊、凋亡小體的形成等形態(tài)。此外，使用透視和掃描電鏡則可觀察凋亡細胞核的形態(tài)、結構變化如染色質(zhì)固縮、凋亡小體的形成、細胞發(fā)泡等現(xiàn)象。 有時也有用兩種染料進行復染，以便更可靠地確定細胞凋亡的變化。例如用吖啶橙(AO)和溴乙錠(EB)進行復染，AO只進入活細胞，正常的細胞核及處于凋亡早期的細胞核呈現(xiàn)綠色；EB只能進入死細胞，將死細胞及凋亡晚期細胞的核染成橙紅色。 2DNA電泳 細胞發(fā)生凋亡時，DNA

48、發(fā)生特征性的核小體間的斷裂，產(chǎn)生大小不同的片段，但都是180200 bp的整數(shù)倍。凋亡細胞中提取的DNA在進行常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳，并用溴乙錠進行染色時，這些大小不同的DNA片段就呈現(xiàn)出梯狀條帶。絕大多數(shù)凋亡細胞中DNA的斷裂都表現(xiàn)出這種特征(圖135)。 圖135 細胞色素c誘導的凋亡細胞DNA電泳圖(引自趙允、翟中和) 1細胞色素c誘導0 h；2細胞色素c誘導1 h；3細胞色素c誘導2 h；4細胞色素 c誘導3 h；5細胞色素c誘導4 h；6陰性對照；7Marke， 3TUNEL測定法，即DNA斷裂的原位末端標記法 TUNEL測定法是terminal deoxynucleotidyl tr

49、ansferase(TdT)mediated dUTPnickendlabeling的縮寫，意指末端脫氧核苷酸移換酶介導的dUTP缺口末端標記測定法。這一方法能對DNA分子中3OH斷裂缺口進行原位標記。凋亡細胞的核DNA中產(chǎn)生的3OH末端，可借助一種可觀測的標記物，如熒光素進行原位標記，并用熒光顯微鏡進行觀察。 4彗星電泳法 彗星電泳法(cometassay)的原理是將單個細胞懸浮于瓊脂糖凝膠中，經(jīng)裂解處理后，再在電場中進行短時間的電泳，并用熒光染料染色，凋亡細胞中形成的DNA降解片段，在電場中泳動速度較快，使細胞核呈現(xiàn)出一種彗星式的圖案；而正常的無DNA斷裂的核在泳動時保持圓球形，這是一種快

50、速簡便的凋亡檢測法。 5流式細胞分析 最常用來分析細胞凋亡的流式細胞技術是根據(jù)凋亡細胞DNA斷裂和丟失，采用碘化丙錠使DNA產(chǎn)生激發(fā)熒光，用流式細胞儀檢出凋亡的亞二倍體細胞，同時又能觀察細胞的周期狀態(tài)。三、細胞凋-ff的分5-機制 (一)easpase家族與凋亡 1caspase家族 caspases是近年來發(fā)現(xiàn)的一組存在于胞質(zhì)溶膠中的結構上相關的半胱氨酸蛋白酶，它們的一個重要共同點是特異地斷開天冬氨酸殘基后的肽鍵。caspase一詞是從cysteineasparticacicspecific protease的詞頭和詞尾縮寫衍生而來，反映了這個特征，而這種高度的特異性在蛋白酶中是很少見的。

51、由于這種特異性，使caspase能夠高度選擇性地切割某些蛋白質(zhì)，這種切割只發(fā)生在少數(shù)(通常只有1個)位點上，主要是在結構域間的位點上，切割的結果或是活化某種蛋白，或是使某種蛋白失活，但從不完全降解一種蛋白質(zhì)。 caspase的研究源于線蟲(Celegans)細胞程序化死亡的研究。線蟲在發(fā)育過程中，有131個細胞將進入程序化死亡；研究發(fā)現(xiàn)有11個基因與PCD有關，其中ced3和ced4基因是決定細胞凋亡所必需的，ced9基因抑制PCD。線蟲細胞程序化死亡的研究促進了其他動物特別是哺乳類動物中細胞凋亡的研究。人們發(fā)現(xiàn)哺乳類細胞中存在著Ced3的同源物ICE(interleukin邛converti

52、ng en zyme)，它催化白介素印的活化，即從其前體上將幾印切割下來。在大鼠成纖維細胞中過量表達ICE和Ced3都會引起細胞凋亡，表明了ICE和Ced3在結構和功能上的相似性；然而剔除ICE的基因的小鼠其表型正常，并未發(fā)現(xiàn)細胞凋亡發(fā)生明顯改變。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，另一個ICE成員，后來被稱為apopain， CPP32或Yama的半胱氨酸蛋白酶，催化poly(ADP ribose)polymerase(PARP)，即聚(ADP核糖)聚合酶的裂解，結果導致細胞的凋亡，因而認為apopain執(zhí)行著與線蟲中的Ced3相同的功能。apopain被稱為是“死亡酶”，而PARP被認為是 “死亡底物”。a

53、popainCPP32Yama是在1995年由兩個實驗室分別同時報導，時間上只有兩周之差。Ced4的哺乳類同源物則遲遲未能發(fā)現(xiàn)，直到1997年，才被證明是Apaf 1(即一種細胞凋亡蛋白酶活化因子apoptosisproteaseactivating factor)。而Ced 9的哺乳類對應物則較早地被證明是BCL2，這一問題將在以后的部分述及。 現(xiàn)已確定至少存在11種caspase(表131)： 表131 caspase超家族成員及其相應底物 名稱及其別名 底物 caspase I(1CE) ProILfi；pro-caspase 3，7 caspase 2(Nedd2ICHl) caspa

54、se 3(apopa,nCPP32Yama) PARP；SREBP；DFF；DNA caspase 7(1CELAP3Mch3CMH caspase 8(FLICEMACHMch5) caspase 9(1CELAP6Mch6) caspase 10(Mch4FLICE2) caspase 11(1CH3) Lamin A；keratin 18 PARP；pro-caspase 6；DFF PARP 這些caspases中，caspase 1和caspase 11，以及可能還有caspase 4被認為不直接參與凋亡信號的轉導，它們主要參與白介素前體的活化；而caspase 2、cas pase

55、 8、caspase 9和caspase 10參與細胞凋亡的起始；參與細胞凋亡執(zhí)行的則是 caspase 3、caspase 6和caspase 7，其中caspase 3和7具有相近的底物和抑制劑特異性，它們降解PARP、DFF45(DNAfragmentationfactor 45)，導致DNA修復的抑制并啟動DNA的降解。而caspase 6的底物是laminA和keratin 18，它們的降解導致核纖層和細胞骨架的崩解。 2caspase的活化 細胞中合成的caspase以無活性的酶原狀態(tài)存在，以后經(jīng)活化方能執(zhí)行其功官旨。一般的蛋白酶活化時，只是將N端的肽段切除，而caspase的活化

56、則需在兩個亞基的連接區(qū)的天冬氨酸位點進行切割，結果產(chǎn)生了由兩個亞基組成的異二聚體，此即具有活性的酶。通常N端的肽在活化時也被除去，但對于caspase 7是否去除N端肽對活性無影響。目前認為細胞凋亡的起始者(caspase 2，8，9和 10)和執(zhí)行者(caspase 3，6和7)之間存在著上下游關系，即起始者活化執(zhí)行者。 凋亡起始者(caspase 2，8和10)的活化屬于同性活化(homo activation)。 caspase 8和10含有串聯(lián)重復的“死亡效應子”結構域(death effector domain， DED)，而caspase 2和9則含有不同但類似的caspase募集

57、結構域(caspase re cruitmentdomainCARD)，這兩種結構域是募集caspase 2，8和10所必需的。 caspase 8和10的活化要求下列成員的參與： (1)配體受體對，如FasLFas，TNFTNF受體。 (2)連接器或接頭蛋白FADD(fas-associateddeathdomainprotein)。 (3)修飾子蛋白：當?shù)蛲鲂盘栍蒚NFTNF受體途徑傳導時，則要求修飾子蛋白TRADD(TNFreceptorassociateddeathdomainprotein)的參與。 (4)caspase 2，8和10的酶原。 當Fas(CD95)或TNF受體為其天然配體FasL或TNF所啟動時，就形成了由Fas或TNF受體、連接器蛋白FADD和caspase 2，8和10的酶原組成的死亡誘導信號復合物(death-inducing signaling complex，DISC)。受體蛋白通過直接與連接器蛋白FADD作用(有時需要修飾子蛋白的中介)而使caspase 2，8及10的酶原聚集在其附近，即細胞質(zhì)表面。當酶原達到一定濃度時，它們就進行同性活化(h