微生物菌種及其復(fù)壯與保藏

1、微生物發(fā)酵工程微生物發(fā)酵工程2 微生物菌種及其復(fù)壯與保藏微生物菌種及其復(fù)壯與保藏Company Logo 復(fù)習(xí)復(fù)習(xí) 現(xiàn)代微生物發(fā)酵工程研究的內(nèi)容現(xiàn)代微生物發(fā)酵工程研究的內(nèi)容1菌種的選育和擴(kuò)大菌種的選育和擴(kuò)大2最經(jīng)濟(jì)地利用營(yíng)養(yǎng)物最經(jīng)濟(jì)地利用營(yíng)養(yǎng)物，按需確定培養(yǎng)基按需確定培養(yǎng)基3滅菌滅菌4微生物在最優(yōu)條件下產(chǎn)物的大規(guī)模生產(chǎn)微生物在最優(yōu)條件下產(chǎn)物的大規(guī)模生產(chǎn)5發(fā)酵產(chǎn)物的提取純化發(fā)酵產(chǎn)物的提取純化6廢物的處理、再生和生產(chǎn)環(huán)境的凈化廢物的處理、再生和生產(chǎn)環(huán)境的凈化Company Logo 名詞概念名詞概念 v初級(jí)代謝產(chǎn)物初級(jí)代謝產(chǎn)物v次級(jí)代謝產(chǎn)物次級(jí)代謝產(chǎn)物Company Logo 2 微生物菌種及其復(fù)

2、壯與保藏微生物菌種及其復(fù)壯與保藏工業(yè)生產(chǎn)常用的微生物及工業(yè)生產(chǎn)常用的微生物及要求要求菌種的退化與復(fù)壯菌種的退化與復(fù)壯菌種的保藏菌種的保藏Company Logo2.1工業(yè)生產(chǎn)常用的微生物及要求工業(yè)生產(chǎn)常用的微生物及要求v微生物的多樣性微生物的多樣性v 1. 細(xì)菌細(xì)菌: 分布最廣分布最廣,數(shù)量最多數(shù)量最多,單細(xì)胞原核單細(xì)胞原核, v 二分裂殖二分裂殖.v 枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌- 淀粉酶、蛋白酶淀粉酶、蛋白酶v 嗜熱乳桿菌嗜熱乳桿菌-乳酸乳酸v 醋酸桿菌醋酸桿菌-醋酸醋酸v 棒狀桿菌棒狀桿菌-氨基酸氨基酸v 短桿菌短桿菌-肌苷酸肌苷酸Company Logov2.酵母菌酵母菌: 單細(xì)胞真核單細(xì)

3、胞真核, 含糖含糖,偏酸偏酸,v出芽繁殖出芽繁殖, 假絲假絲.v啤酒酵母啤酒酵母-釀酒、細(xì)胞色素釀酒、細(xì)胞色素C、單細(xì)胞蛋、單細(xì)胞蛋 v 白、白、 甘油、琥珀酸甘油、琥珀酸v假絲酵母假絲酵母-面包、石油脫蠟、飼料面包、石油脫蠟、飼料v類酵母類酵母-脂肪酶脂肪酶Company Logov3.霉菌霉菌:絲狀真菌絲狀真菌v生產(chǎn)菌種生產(chǎn)菌種:根霉根霉,毛霉毛霉,犁頭霉犁頭霉,紅曲霉紅曲霉,青霉等青霉等v產(chǎn)品產(chǎn)品:酶制劑酶制劑; 抗生素抗生素;有機(jī)酸有機(jī)酸;甾體激甾體激素素Company Logov4.放線菌放線菌: 原核生物原核生物, 有機(jī)質(zhì)豐富的有機(jī)質(zhì)豐富的,微堿性微堿性土壤中土壤中, 孢子或菌絲片

4、斷繁殖孢子或菌絲片斷繁殖.v生產(chǎn)菌種生產(chǎn)菌種:鏈霉菌屬鏈霉菌屬;小單孢菌屬小單孢菌屬; 諾卡菌屬諾卡菌屬等等v產(chǎn)品產(chǎn)品:鏈霉素鏈霉素; 紅霉素紅霉素; 金霉素金霉素;慶大霉素等慶大霉素等Company Logo純凈純凈健壯健壯產(chǎn)量產(chǎn)量質(zhì)量質(zhì)量穩(wěn)定穩(wěn)定2易于控易于控制培養(yǎng)制培養(yǎng)條件條件,周期短周期短3對(duì)誘變對(duì)誘變劑敏感劑敏感4抗污抗污染力染力強(qiáng)強(qiáng)5原料廉原料廉價(jià)價(jià),生長(zhǎng)生長(zhǎng)迅速迅速,目目的產(chǎn)物的產(chǎn)物產(chǎn)量高產(chǎn)量高6不是不是病原病原菌菌17產(chǎn)物產(chǎn)物分泌分泌型型Company Logov菌種退化菌種退化：生產(chǎn)菌種或選育過(guò)程中篩選出來(lái)的較優(yōu)生產(chǎn)菌種或選育過(guò)程中篩選出來(lái)的較優(yōu)良的菌株，由于進(jìn)行一種傳代或保

5、藏之后，群體中良的菌株，由于進(jìn)行一種傳代或保藏之后，群體中某些生理特征和形態(tài)特征逐漸減退或完全喪失的現(xiàn)某些生理特征和形態(tài)特征逐漸減退或完全喪失的現(xiàn)象。象。Company Logo退化的表現(xiàn)產(chǎn)物合成能力下降 產(chǎn)量下降孢子數(shù)量變化菌落大小變化生長(zhǎng)能力和生長(zhǎng)速度變化Company Logov 1.菌種退化的原因菌種退化的原因退化原因基因突變質(zhì)粒的脫落培養(yǎng)和保藏條件的影響連續(xù)移代Company Logov 基因突變導(dǎo)致菌種退化：基因突變導(dǎo)致菌種退化：v v 自發(fā)突變與回復(fù)突變自發(fā)突變與回復(fù)突變 10-7-10-9低產(chǎn)株低產(chǎn)株低產(chǎn)株低產(chǎn)株增多增多高產(chǎn)株高產(chǎn)株Company Logov 質(zhì)粒脫落導(dǎo)致菌種退

6、化：質(zhì)粒脫落導(dǎo)致菌種退化：v控制產(chǎn)量的質(zhì)粒脫落或核內(nèi)控制產(chǎn)量的質(zhì)粒脫落或核內(nèi)DNA和質(zhì)粒復(fù)制不一和質(zhì)粒復(fù)制不一致。致。v連續(xù)傳代加速退化的發(fā)生：連續(xù)傳代加速退化的發(fā)生：大量低產(chǎn)突變株 傳代傳代個(gè)別低產(chǎn)突變株個(gè)別低產(chǎn)突變株Company Logov不良的培養(yǎng)條件不良的培養(yǎng)條件如營(yíng)養(yǎng)成分、溫度濕度、如營(yíng)養(yǎng)成分、溫度濕度、pH值、值、通氣量等和通氣量等和保藏條件保藏條件如營(yíng)養(yǎng)、含水量、溫度、如營(yíng)養(yǎng)、含水量、溫度、氧氣等不僅會(huì)誘發(fā)低產(chǎn)基因型出現(xiàn)，而且會(huì)造氧氣等不僅會(huì)誘發(fā)低產(chǎn)基因型出現(xiàn)，而且會(huì)造成低產(chǎn)基因和高產(chǎn)基因細(xì)胞的數(shù)量比發(fā)生變化。成低產(chǎn)基因和高產(chǎn)基因細(xì)胞的數(shù)量比發(fā)生變化。Company Logo延

7、緩?fù)嘶私馔嘶脑蚍蛛x純化科學(xué)保藏減少傳代Company Logov 2.菌種退化的防止菌種退化的防止盡量減少傳代盡量減少傳代Company Logo2菌種經(jīng)常純化菌種經(jīng)常純化3創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件4用單核細(xì)胞移植傳代用單核細(xì)胞移植傳代5采用有效的菌種保藏方法采用有效的菌種保藏方法Company Logov 3.菌種的復(fù)壯及其方法菌種的復(fù)壯及其方法v復(fù)壯原理復(fù)壯原理v狹義復(fù)壯狹義復(fù)壯：從大量退化的菌株中分離篩選到那些仍從大量退化的菌株中分離篩選到那些仍保持優(yōu)良性狀的個(gè)體保持優(yōu)良性狀的個(gè)體v廣義復(fù)壯廣義復(fù)壯：在菌種的生產(chǎn)性能尚未退化前就經(jīng)常有在菌種的生產(chǎn)性能尚未退化前就經(jīng)常有意

8、識(shí)地進(jìn)行純種分離與生產(chǎn)性能的測(cè)試工作意識(shí)地進(jìn)行純種分離與生產(chǎn)性能的測(cè)試工作Company Logo復(fù)壯方法復(fù)壯方法v平板劃線平板劃線v稀釋分離稀釋分離 純種分離純種分離v淘汰法淘汰法宿主體宿主體內(nèi)復(fù)壯法內(nèi)復(fù)壯法低溫等條低溫等條件處理件處理,使部分退使部分退化菌株死亡化菌株死亡對(duì)于寄生性對(duì)于寄生性微生物的退微生物的退化菌株化菌株,可通可通過(guò)接種到的過(guò)接種到的昆蟲或動(dòng)物昆蟲或動(dòng)物寄主體內(nèi)以寄主體內(nèi)以提高菌株毒提高菌株毒性性Company Logov 2.3菌種的保藏菌種的保藏 一一.菌種保藏菌種保藏v廣義：廣義：在廣泛收集實(shí)驗(yàn)室和生產(chǎn)菌種、菌株的基在廣泛收集實(shí)驗(yàn)室和生產(chǎn)菌種、菌株的基礎(chǔ)上，將它們妥

9、善保管，是指達(dá)到不死、不衰、礎(chǔ)上，將它們妥善保管，是指達(dá)到不死、不衰、不污染以便于研究、交換和使用的目的。不污染以便于研究、交換和使用的目的。v狹義狹義：防止菌種退化、保持菌種的生活能力和優(yōu)防止菌種退化、保持菌種的生活能力和優(yōu)良的生產(chǎn)性能，盡量減少、推遲負(fù)突變、防止死良的生產(chǎn)性能，盡量減少、推遲負(fù)突變、防止死亡，并確保不污染雜菌。亡，并確保不污染雜菌。Company Logo原理干燥低營(yíng)養(yǎng)低溫Company Logo干干燥燥3液體石蠟2凍凍干干4真真空空5液液氮氮6斜面1Company Logo (一).斜面保藏法v特點(diǎn)特點(diǎn)：簡(jiǎn)便有效，易變異，退化甚至死簡(jiǎn)便有效，易變異，退化甚至死v 亡亡。v

10、適合適合：不要求長(zhǎng)期保藏的及不適合冷凍干不要求長(zhǎng)期保藏的及不適合冷凍干v 燥的。燥的。v保存期保存期: 3個(gè)月個(gè)月Company Logo影響保藏效果因素營(yíng)養(yǎng)略貧乏營(yíng)養(yǎng)略貧乏氮源略多氮源略多糖類少糖類少培養(yǎng)基培養(yǎng)基124保存條件保存條件Company Logov （二）（二） .液體石蠟油保藏法液體石蠟油保藏法v保存期保存期: 2-3年，甚至年，甚至5年傳代一次年傳代一次.v特別適合特別適合:在固體培養(yǎng)基上不能形成孢子的絲狀擔(dān)在固體培養(yǎng)基上不能形成孢子的絲狀擔(dān)子菌，如大型食用真菌和藥用真菌以及鐮刀菌、子菌，如大型食用真菌和藥用真菌以及鐮刀菌、紅曲霉等紅曲霉等.v注意：保藏溫度，液體石蠟需滅菌和

11、除水注意：保藏溫度，液體石蠟需滅菌和除水Company Logo（三）（三）.干燥保藏法干燥保藏法適于適于:能產(chǎn)能產(chǎn)生孢子或生孢子或芽孢的微芽孢的微生物生物 沙土沙土v麥麩麥麩硅膠硅膠適合產(chǎn)孢子適合產(chǎn)孢子的霉菌和放的霉菌和放線菌線菌適合絲狀適合絲狀真菌和酵真菌和酵母菌母菌Company Logo砂土砂土沙土管沙土管菌種菌種粒度，除鈣，除鐵及粒度，除鈣，除鐵及pH 。砂和土混合比例：。砂和土混合比例：1：1或或3：2。121 間歇滅菌間歇滅菌3次，每次次，每次1-1.5小時(shí)小時(shí)埋沙土埋沙土干法干法濕法濕法細(xì)胞濃度細(xì)胞濃度 108-109 /ml, 0.2-0.3ml/支。抽真空支。抽真空干燥干燥

12、 4小時(shí)小時(shí)砂土保藏法砂土保藏法特點(diǎn)特點(diǎn):經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便，保存時(shí)間長(zhǎng)，不易經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便，保存時(shí)間長(zhǎng)，不易變異。一般變異。一般2-3年年.Company Logo:用保護(hù)劑制備菌懸液，用保護(hù)劑制備菌懸液， 然后將含菌樣然后將含菌樣快速降至冰凍狀態(tài)，減壓抽真空，使冰升華成水蒸快速降至冰凍狀態(tài)，減壓抽真空，使冰升華成水蒸汽排出，從而使含菌樣脫水干燥，汽排出，從而使含菌樣脫水干燥， 并在真空狀態(tài)立并在真空狀態(tài)立即密封瓶口隔絕空氣，造成無(wú)氧的真空環(huán)境，即密封瓶口隔絕空氣，造成無(wú)氧的真空環(huán)境， 然后然后置于低溫下保存。置于低溫下保存。v特點(diǎn)特點(diǎn)：不易發(fā)生變異，不易發(fā)生變異，5-10年。需要凍干機(jī)。年。需要凍干機(jī)。v

13、適用適用：除了一些不產(chǎn)孢子的絲狀真菌外。除了一些不產(chǎn)孢子的絲狀真菌外。v（四）（四）. 冷凍干燥保藏法冷凍干燥保藏法Company LogoCompany Logov常溫下直接真空干燥。設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方常溫下直接真空干燥。設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方v 便。便。v適于適于: 預(yù)凍后易受凍傷的菌株預(yù)凍后易受凍傷的菌株（五）真空干燥法（五）真空干燥法 Company Logov以甘油、二甲基亞砜等作保護(hù)劑，在液氮超低溫下以甘油、二甲基亞砜等作保護(hù)劑，在液氮超低溫下保藏的方法。保藏的方法。v是防止退化的最有效的方法。是防止退化的最有效的方法。v適合于各種微生物的保藏。適合于各種微生物的保藏。v原理原理：菌種細(xì)胞

14、從常溫過(guò)渡到低溫，并在降到低溫菌種細(xì)胞從常溫過(guò)渡到低溫，并在降到低溫之前，使細(xì)胞內(nèi)的自由水通過(guò)細(xì)胞膜外滲出來(lái)之前，使細(xì)胞內(nèi)的自由水通過(guò)細(xì)胞膜外滲出來(lái)。v（六）（六）.液氮超低溫法液氮超低溫法Company Logov保護(hù)劑：保護(hù)劑：甘油，二甲基亞砜，糊精，血清蛋甘油，二甲基亞砜，糊精，血清蛋白等。白等。v v不同微生物的保護(hù)劑不同，需實(shí)驗(yàn)確定。不同微生物的保護(hù)劑不同，需實(shí)驗(yàn)確定。v甘油甘油10-20%，二甲基亞砜，二甲基亞砜5-10%v安剖瓶的選擇：安剖瓶的選擇：95料或料或GG17的玻璃管制的玻璃管制成。成。液氮超低溫法液氮超低溫法Company Logov菌種制備和凍結(jié)保藏：菌種制備和凍結(jié)保藏：孢子或菌絲體。孢子或菌絲體。-35 以前以前控制降溫速度?？刂平禍厮俣?。v恢復(fù)培養(yǎng)恢復(fù)培養(yǎng):38-40 水中水中v注意防護(hù)：注意防護(hù)：防凍，防爆。防凍，防爆。Company Logov良好的培養(yǎng)基，新鮮培養(yǎng)的菌種，健壯的良好的培養(yǎng)基，新鮮培養(yǎng)的菌種，健壯的菌體，豐滿的孢子，適宜的菌齡菌體，豐滿的孢子，適宜的菌齡2嚴(yán)格無(wú)菌嚴(yán)格無(wú)菌3注意保藏菌種的制備質(zhì)量注意保藏菌種的制備質(zhì)量4創(chuàng)造最適宜的保藏條件創(chuàng)造最適宜的保藏條件菌種保藏注意事項(xiàng)菌種保藏注意事項(xiàng)5v嚴(yán)格控制傳代次數(shù)