農(nóng)業(yè)生物技術(shù)教學(xué)大綱

1、指導(dǎo)教師：韓英鵬教學(xué)大綱-基礎(chǔ)植物分子生物技術(shù)（一）實驗課程簡介（實驗課程的特點，發(fā)展現(xiàn)狀）農(nóng)業(yè)生物技術(shù)實驗課程的開設(shè)，是建立在理論課基礎(chǔ)上。在分子水平進行生物學(xué)操作是目前很多學(xué)科、領(lǐng)域共同關(guān)心并十分重視的問題。農(nóng)業(yè)生物技術(shù)實驗課程就是明確生物技術(shù)的一般原理在該實驗中所涉及的技術(shù)方法，原理和策略，增強學(xué)生對生物技術(shù)尤其是基因操作中基本原理與技術(shù)的認(rèn)識，并鍛煉學(xué)生科研動手能力，挖掘其創(chuàng)造意識。隨著生物科學(xué)和生物技術(shù)的日益發(fā)展，人們越來越重視對生物學(xué)研究手段的了解和掌握。特別是二十世紀(jì)八十年代以來，以分子生物學(xué)為代表的學(xué)科領(lǐng)域取得了翻天覆地的變化。農(nóng)業(yè)生物技術(shù)實驗開展是東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)系專業(yè)

2、適應(yīng)學(xué)科發(fā)展應(yīng)運而生的特色課程，將使學(xué)生真正了解并深層次體會生物技術(shù)的神奇與奧妙。目前農(nóng)業(yè)生物技術(shù)實驗課程剛剛開設(shè)，實驗條件、實驗項目開設(shè)還處在初級階段，它的學(xué)時數(shù)及開設(shè)內(nèi)容還有待進一步豐富。（二）實驗教學(xué)目標(biāo)及基本要求實驗課的培養(yǎng)目標(biāo)與理論課的培養(yǎng)目標(biāo)視一致，通過實驗課進一步加深對基因操作原理的認(rèn)識和掌握，從實踐的角度讓學(xué)生掌握基因是怎樣去研究的、基因工程是如何實現(xiàn)的，如何設(shè)計研究基因的基本方案，為學(xué)生進入研究生階段開展分子生物學(xué)研究打好理論和思維基礎(chǔ)，為本科畢業(yè)從事生物技術(shù)和生物科學(xué)工作強化基因操作的認(rèn)識。（三）教材及主要參考書農(nóng)業(yè)生物技術(shù)實驗指導(dǎo)（四）考核辦法實驗結(jié)果正確度30%操作態(tài)度

3、30%實驗報告填寫20%動手能力20%（五）開出實驗個數(shù)：（驗證實驗個；綜合實驗一個；設(shè)計實驗1個）（六）應(yīng)開實驗學(xué)期：2010-2011學(xué)年第一學(xué)期實驗項目質(zhì)粒DNA的小量制備1 .實驗特點實驗類型：驗證實驗類別：專業(yè)基礎(chǔ)計劃學(xué)時：4每組人數(shù)：7首開日期：2006.6.5說明：實驗類別指基礎(chǔ)、專業(yè)基礎(chǔ)、專業(yè)實驗類型指驗證、綜合、設(shè)計。每組人數(shù)指教學(xué)實驗項目中在每套儀器設(shè)備上完成本實驗項目的人數(shù)。2 .實驗?zāi)康呐c要求學(xué)會最常用的小量制備質(zhì)粒DNA的堿裂解方法。3.主要儀器設(shè)備廳P主要儀器設(shè)備名稱型號規(guī)格數(shù)量1超凈工作臺12旋渦混合器13恒溫?fù)u床14微量移液取樣器44.實驗內(nèi)容提要通過溶液I、溶

4、液II、溶液III的加入及離心等操作，得到質(zhì)粒DNA,溶于無菌水中。5 .實驗操作要點(1)取1.5ml的菌液于1.5ml離心管中，12000rpm離心1min,棄上清液，留沉淀備用。(2)在沉淀中加入100巴溶液I,蓋上蓋后立即在渦旋混合器上混勻，室溫下靜置5min。(3)加入200溶液II,蓋上蓋后上下顛倒幾次混勻，插入冰中，放置5min。(4)加入150螞溶液III,蓋上蓋后上下顛倒幾次混勻，插入冰中，放置5min。(5) 15000rpm離心5min,小心吸取400H上精液于另一個干凈的1.5ml離心管中，加入800H95%乙醇，蓋上蓋后立即在渦旋混合器上混勻，室溫下靜置5min。(6

5、) 15000rpm離心10min,小心棄掉上精液，加入500巴70%乙醇，蓋上蓋后立即在渦旋?M合器上混勻。15000rpm離心10min,小心棄掉上清液，盡量倒置棄干凈(7) 再加入500H70%乙醇，蓋上蓋后立即在渦旋混合器上混勻。15000rpm離心10min,小心棄掉上精液，盡量倒置棄干凈(8) 離心管倒置于37七培養(yǎng)箱中(或室溫)空氣干燥。(管底的沉淀質(zhì)粒DNA用肉眼幾乎看不見！)0(9)每管加入10國蒸儲水混勻后收集到一個管中，渦旋混合器上混勻，在離心機中瞬時轉(zhuǎn)一下，使溶液集中在管底。待電泳確認(rèn)。用記號筆標(biāo)記后放入冰箱中備用。(10)清理桌面，清洗儀器，撰寫實驗報告6.注意事項(

6、1)試劑添加順序不能弄混，尤其是溶液I、溶液II、溶液III的加入順序。(2)離心時間要控制，使用時離心機要注意對角線上離心管要配平，防止離心機非正常工作。(3)寫作實驗報告和實驗論文一定要文理通順、邏輯清晰、圖表說明詳細，討論分析透徹(包括操作的錯誤)。實驗項目二質(zhì)粒DNA電泳鑒定1 .實驗特點實驗類型：驗證實驗類別：專業(yè)基礎(chǔ)計劃學(xué)時：4每組人數(shù)：7首開日期：2006.6.8說明：實驗類別指基礎(chǔ)、專業(yè)基礎(chǔ)、專業(yè)實驗類型指驗證、綜合、設(shè)計。每組人數(shù)指教學(xué)實驗項目中在每套儀器設(shè)備上完成本實驗項目的人數(shù)。2 .實驗?zāi)康呐c要求學(xué)會常用的DNA瓊脂糖凝膠電泳。3.主要儀器設(shè)備廳P主要儀器設(shè)備名稱型號規(guī)

7、格數(shù)量1電泳儀12分光光度計13微波爐14微量移液取樣器44 .實驗內(nèi)容提要將實驗一所提取的質(zhì)粒通過1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。5 .實驗操作要點(1)稱取0.5g瓊脂糖粉，放入三角瓶，加入50ml1父TAE電泳緩沖液，放入微波爐中1min,待完全熔化。(2) 冷卻致不燙手(約50-60七)力口1N1EB。(3)把梳子插到凝膠灌制模具的正確位置后緩緩倒入膠溶液。靜置10-20分鐘待膠完全凝固。(4)在水平電泳槽中加滿1MTAE電泳緩沖液。根據(jù)電泳槽的長度把電泳儀的電壓調(diào)至170V(10V/cm),注意正負(fù)電極的位置連接正確。(5)待膠完全凝固后(15-20分鐘)，小心拔出梳子。凝膠上有樣品孔

8、的一側(cè)要朝向電泳槽的負(fù)極。(6)剪1片光面紙(或封口膜)，點6巴蒸儲水、1四10M加樣緩沖液，再加入3H質(zhì)粒DNA溶液制成10HDNA樣品，進行加樣。(7)電泳將進行約30min,關(guān)閉電源，取出凝膠進行觀察。6 .注意事項(1)上樣液各成分及加入量要準(zhǔn)確2）使用EB要小心，防止弄到皮膚及衣物上。3）凝膠在電泳槽中正負(fù)極的位置要明確。實驗項目三感受態(tài)菌的制備1 .實驗特點實驗類型：設(shè)計實驗類別：專業(yè)基礎(chǔ)計劃學(xué)時：4每組人數(shù)：7首開日期：2006.6.12說明：實驗類別指基礎(chǔ)、專業(yè)基礎(chǔ)、專業(yè)實驗類型指驗證、綜合、設(shè)計。每組人數(shù)指教學(xué)實驗項目中在每套儀器設(shè)備上完成本實驗項目的人數(shù)。2 .實驗?zāi)康呐c要

9、求學(xué)會CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞。3.主要儀器設(shè)備廳P主要儀器設(shè)備名稱型號規(guī)格數(shù)量1超凈工作臺12臺式冷凍離心機13制冰機14微量移液取樣器44.實驗內(nèi)容提要應(yīng)用CaCl2法將大腸桿菌DH5u菌種制備成感受態(tài)細胞5 .實驗操作要點(1)將菌液分裝到1.5mL預(yù)冷無菌的聚丙烯離心管中，于冰上放置10min,然后于4C,5000rpm離心10min。(2)將離心管倒置以倒盡上精液，加入1ml冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液，立即在渦旋混合器上混勻，插入冰中放置30min。(3) 4C,5000rpm離心10min,棄上精液后，用1mL冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液垂懸，插入冰中放

10、置30min。(4) 4C,5000rpm離心10min,棄上精液后，用200卜L冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液垂懸，超凈工作臺中按每管100叱分裝到1.5mL離心管中。可以直接用作轉(zhuǎn)化實驗，或立即放入-80C超低溫冰柜中保藏(可存放數(shù)月)。(5)在被細菌污染的桌面上噴灑70%乙醇，擦干桌面，寫實驗報告。6 .注意事項(1)密切注視細菌的生長狀態(tài)和密度，盡量使用對數(shù)生長期的細胞(一般通過檢測OD600來檢測。DH5a菌株OD600為0.5時細胞密度為5x107/ml。)(2)所有操作都在無菌條件和冰上進行（3）所有器皿必須干凈。跡量的去污劑或其他化學(xué)物質(zhì)的存在可能大大降低細菌的轉(zhuǎn)化效率。

11、實驗項目四質(zhì)粒DNA勺轉(zhuǎn)化1 .實驗特點實驗類型：設(shè)計實驗類別：專業(yè)基礎(chǔ)計劃學(xué)時：4每組人數(shù)：7首開日期：2006.6.12說明：實驗類別指基礎(chǔ)、專業(yè)基礎(chǔ)、專業(yè)實驗類型指驗證、綜合、設(shè)計。每組人數(shù)指教學(xué)實驗項目中在每套儀器設(shè)備上完成本實驗項目的人數(shù)。2 .實驗?zāi)康呐c要求學(xué)會熱擊法轉(zhuǎn)化質(zhì)粒DNA3.主要儀器設(shè)備廳P主要儀器設(shè)備名稱型號規(guī)格數(shù)量1超凈工作臺12臺式冷凍離心機13制冰機14微量移液取樣器44.實驗內(nèi)容提要應(yīng)用學(xué)會熱擊法轉(zhuǎn)化質(zhì)粒DNA5 .實驗操作要點(1)將含有50ng重組DNAf口200四的感受態(tài)細胞的Eppendorf管置冰浴中30min以上，在這過程中，可輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，但振蕩不要太激烈和次數(shù)太多，以免影響已連接好的DNA&受體菌表面的吸附。(2)把上述樣品置42c水浴中，熱擊90sec,不要搖動管。這使受體菌極短暫熱刺激，以利于DNA勺吸收，提高轉(zhuǎn)化效率；(3)冰上放置，使細胞冷卻1-2min,并加入500囚的新鮮的LB液體培養(yǎng)基；(4)在涂皿之前，先放37c100rpm/h搖床上，振蕩