生物工程下游技術復習

1、生物工程下游技術一、 名詞解釋（每題4分，共20分）1、 連續(xù)培養(yǎng)反應器：不斷地往反應器中加入營養(yǎng)物，利用罐中的菌體增殖得到產物，并不斷采出。在良好的控制下，罐內菌體的增殖速度可以與采出速度相同而達到穩(wěn)態(tài)。2、 菌體比生長速率：單位濃度菌體在一定條件下引起的反應速率, 其值反映了培養(yǎng)菌體的活力, 受菌株及各種物理化學環(huán)境的影響. 表示為=dx/x.dt、qs=-ds/xdt、qp=dp/xdt3、 得率系數：兩種物質得失之間的計量比,符號Y4、 貼壁培養(yǎng): 貼壁依賴性細胞在培養(yǎng)中要貼附于壁上才能迅速鋪展,開始有絲分裂并迅速進入對數生長期,這種培養(yǎng)方式就叫貼壁培養(yǎng).多數動物細胞的培養(yǎng)都采取這種方

2、式.5、 蛋白質的復性：包含體蛋白質溶解于變性劑溶液中，呈變性狀態(tài)，所有的氫鍵、疏水鍵全部被破壞，疏水側鏈完全暴露，但一級結構和共價鍵不被破壞，當除去變性劑后，一部分蛋白質可以自動折疊成具有活性的正確構型，這一折疊過程稱為蛋白質復性。6、 濃差極化：指在分離過程中，料液中的溶劑在壓力驅動下透過膜，溶質被截留，于是在膜表面與臨近膜面區(qū)域濃度越來越高。在濃度梯度作用下，溶質由膜面向本體溶液擴散，形成邊界層，使流體阻力與局部滲透壓增加，從而導致溶劑透過量下降。溶劑向膜面流動引起溶質向膜面的流動，這種流動如果與濃度梯度所驅動的溶質向本體溶液擴散的速度平衡時，在膜面附近就形成一個穩(wěn)定的濃度梯度區(qū)，這一區(qū)

3、域就稱為濃度極化邊界層，這一現(xiàn)象稱為濃差極化。濃差極化是一個可逆的過程；7、 膜污染：物料中的微粒、膠體粒子或溶質大分子由于與膜存在物理化學相互作用或機械作用而引起的在膜表面或膜孔內吸、沉積造成膜孔徑變小或堵塞，使膜產生透過流量與分離特性的不可逆變化的現(xiàn)象。8、 排阻色譜又稱凝膠色譜或凝膠滲透色譜，是利用被分離物質分子量大小的不同和在填料上滲透程度的不同，以使組分分離。常用的填料有分子篩、葡聚糖凝膠、微孔聚合物、微孔硅膠或玻璃珠等，可根據載體和試樣的性質，選用水或有機溶劑為流動相。9、 分配色譜是利用溶液中被分離物質在兩相中分配系數不同，以使組分分離。其中一相為液體，涂布或使之鍵合在固體載體上

4、，稱固定相；另一相為液體或氣體，稱流動相。常用的載體有硅膠、硅藻土、硅鎂型吸附劑與纖維素粉等。 10、 有效柱長（有效遷移距離，Leff）：不同溶質在其遷移速度大于零，但小于流動相的線性流速時，溶質在色譜柱上的遷移對分離有貢獻，溶質遷移所經歷的柱長也對分離有貢獻，而當其遷移速度等于流動相速度時，溶質遷移所經歷的柱長對分離無貢獻。溶質從開始遷移至其遷移速度等于流動相速度時，溶質在色譜柱上遷移的距離稱為有效遷移距離，也稱為有效柱長。11、 吸附等溫線：指在一定溫度下物質分子在兩相界面上進行的吸附過程達到平衡時它們在兩相中濃度之間的關系。12、 切向流過濾（錯流過濾、交叉流過濾、十字過濾）：就是一種

5、維持恒壓下高過濾速度的技術，其原理就是：使懸浮液在過濾介質表面作切向流動，利用液體的剪切作用將介質表面的固體移走，當移走固體與固體沉積速率相同時，過濾速度就保持恒定，控制不同的切向流速度就可以得到不同的過濾速度。（實際是維持了c).目前幾乎所有的膜固液分離都采用切向流方式13、 包含體（包涵體，inclusion bodies):存在于基因工程細胞中，主要由蛋白質構成，其中大部分是克隆表達的產物，這些產物在一級結構上是正確的，但在立體結構上卻是錯誤的，因此沒有生物學活性。難溶于水，只有在變性劑溶液中才能溶解。14、 蛋白質的復性：包含體蛋白質溶解于變性劑溶液中，呈變性狀態(tài)，所有的氫鍵、疏水鍵全

6、部被破壞，疏水側鏈完全暴露，但一級結構和共價鍵不被破壞，當除去變性劑后，一部分蛋白質可以自動折疊成具有活性的正確構型，這一折疊過程稱為蛋白質復性。15、 切向流過濾（錯流過濾、交叉流過濾、十字過濾）：就是一種維持恒壓下高過濾速度的技術，其原理就是：使懸浮液在過濾介質表面作切向流動，利用液體的剪切作用將介質表面的固體移走，當移走固體與固體沉積速率相同時，過濾速度就保持恒定，控制不同的切向流速度就可以得到不同的過濾速度。16、 雙水相萃?。豪帽惶崛∥镌诙嘀械姆峙洳煌鴮崿F(xiàn)分離的目的；由于蛋白質在有機相中容易失活，因此采用的二相均為親水相，如PEG/葡聚糖、無機鹽等，稱為雙水相，兩相密度不同，輕

7、相富含一種高分子，重相可能富含另一高分子，細胞碎片和蛋白質在二相間的分配系數不同，從而實現(xiàn)分離的目的。17、 反滲透：在高于溶液滲透壓的壓力作用下，只有溶液中的水透過膜，而所有溶液中的大分子、小分子有機物及無機鹽全被截留。理想的反滲透膜應被認為是無孔的，它分離的原理是溶解擴散（或毛細孔流學說）。18、 分配系數：組分在固定相和流動相間發(fā)生的吸附、脫附，或溶解、揮發(fā)的過程叫做分配過程。在一定溫度下，組分在兩相間分配達到平衡時的濃度（單位：g / mL）比，稱為分配系數，用K 表示19、 色譜曲線基線：無試樣通過檢測器時，檢測到的信號即為基線。20、 保留值：試樣中,個組分在色譜柱中的滯留時間,由

8、色譜分離過程中的熱力學因素控制,作定性參數21、 保留時間（tR）：組分從進樣到柱后出現(xiàn)濃度極大值時所需的時間。22、 死時間（tM）：不與固定相作用的溶質，如所相色譜中氣體（如空氣）的保留時間。23、 調整保留時間（tR ）：tR= tRtM 24、 容量因子k：平衡時，組分在各相中達到平衡時總的質量比25、 離子交換色譜：組分在固定相上發(fā)生的反復離子交換反應；組分與離子交換劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關，隨著流動相的pH值及置換劑濃度的變化而變化。26、 排阻色譜：按組分分子大小進行分離的一種色譜。小分子可以擴散到凝膠空隙，由其中通過，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠

9、空隙，中速通過；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。27、 親和色譜：利用生物大分子和固定相表面存在的某種特異性親和力，進行選擇性分離。28、 正相色譜：親水性固定液常采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。29、 反相色譜：若流動相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。30、 非線性色譜: :當組分的進樣量達到一定的水平時，Cm與Cs不存在線性關系的色譜， 一般是制備型色譜。31、 吸附等溫線：指在一定溫度下物質分子在兩相界面上進行的吸附過程達到平衡時它們在兩相中濃度之間的關系。32、 全交換容量

10、:每克干介質或每毫升濕介質具有的功能基含量.是一個定值.33、 工作容量:每克干介質或每毫升濕介質在一定的操作條件下的交換吸附蛋白質的實際容量.是一個變值.34、 疏水性色譜:填料表面具有弱疏水性,蛋白質的疏水基團與填料表面之間產生弱的疏水性相互作用.高濃度的鹽條件下,蛋白質與疏水固定相的吸附能力高,隨著鹽濃度的下降,吸附能力下降.當淋洗液離子強度逐漸降低時,蛋白質樣品按其疏水性的不同依次被洗脫.35、 徑向色譜：采用徑向流技術的色譜,即樣品和流動相沿徑向流動,可以從色譜柱的周圍流向圓心,也可以從圓心流向柱的周圍.通常采用從柱的周圍流向圓心的方式.36、 泳動度(遷移率):帶電質點在單位強度電

11、場下的泳動速度 即:U=V/E=(d/t)/(V/L)37、 變性膠：膠電脈在蛋白質變性的狀態(tài)下進行，主要指SDS變性條件下進生38、 非變性膠：電泳在蛋白質保持天然狀態(tài)下進行，不加變性劑39、 高壓均漿法：高壓泵將電機的旋轉運動轉變成勻漿閥柱桿的直線運動，從高壓室（幾十兆帕）壓出細胞懸浮液，經過碰撞環(huán)的撞擊后改變方向從出口管噴出，使細胞經歷較高的流速下的剪切碰撞發(fā)生較大的變形，從而達到破碎細胞的目的。40、 線性色譜:在色譜學中,如果流動相中樣品的濃度與固定相中的樣品濃度之間是線性關系,那么這種情況下的色譜分配過程就稱為線性色譜41、 生物過程動力學:定量地描述過程的速率以及影響過程速率的諸

12、多因素.包括細胞生長速率、各種基質消耗的速率、代謝產物的生成速率。42、 懸浮培養(yǎng)：是指細胞在培養(yǎng)器中自由懸浮生長的過程.主要用于非貼壁依賴性細胞培養(yǎng),如雜交瘤細胞等.43、 固定化培養(yǎng)：利用吸附或包埋等固定化的方式將細胞限制在一定的空間內,然后以固定化的顆粒進行懸浮培養(yǎng).該方法對貼壁性和非貼壁依賴性細胞都是適合的.44、 膜分離技術：以半透膜為選擇障礙層，允許某些組分透過而保留混合物中的其他組分，從而達到分離目的的技術。45、 離子交換法：通過帶電的溶質分子與離子交換劑中可交換離子進行交換而達到分離純化的方法。主要依賴電荷間的相互作用，利用帶電分子中電荷的微小差異而進行分離。46、肽譜：指蛋

13、白質被酶解或化學降解后肽段的分離分析或制備。二、填空題（共20分）1. 超聲波破碎細胞的效率與聲頻、聲能、處理時間、細胞濃度及細胞類型等因素有關。2. 目前用于固液分離的膜過濾法主要有以下三種: 微孔過濾(微濾)、超濾、 反滲透。3. 在生物工程下游技術領域， 色譜 和 電泳 是目前所知最好的兩種分離蛋白的方法。4. 在生物物質分離中，可以依據一次進樣量多少，將色譜分為： 分析色譜、 半制備色譜（中等規(guī)模制備色譜）、制備色譜 和工業(yè)生產規(guī)模色譜 4大類。5. 無論是什么類型的液相或氣相色譜,其色譜裝置均應包括: 流動相供給、 進樣、 色譜柱、 檢測器 等四大部分。6. 在色譜過程中，有兩種將目

14、標產品從色譜柱上洗脫下來的方法： 一種是維持流動相熱力學參數不變的 等梯度洗脫法，另一種叫 梯度洗脫法。7. 徑向色譜填料主要有： 離子交換樹脂 和 親和色譜填料 兩種。8. 評價HPLC色譜填料性能的主要表征指標包括：（每空0.5分） 保留值 ， 選擇性 , 柱效率 , 填充柱的空喜和穿透性 ,分離度 。9. 請列舉任意四種破碎細胞的方法：（每空0.5分） 高壓勻漿法 高速珠磨法 ，超聲破碎 化學滲透法 。10. 在HPLC領域內經?？梢杂龅降奈降葴鼐€可以有以下5種（形狀）:（每空0.5分） 凹形 , 凸形 , S形 , H形 ， 階梯形 。11. 羥其磷灰石在原理上一般被認為是一種 弱離

15、子交換 色譜。（本小題1分）12. 請列舉二種測量蛋白質含量的方法考馬斯亮藍法 ， 克氏定氮法 。（ 每空1分）。13. 常見的無機色譜填料主要包括： 硅膠 、 可控孔徑玻璃 、 氧化鋁 、 氧化鈦 、 羥基磷灰石 以及 碳 和 石墨 等基質。14.15. 無機HPLC填料最常見的是以 多孔硅膠 為基本材料的填料；含硼的Na2O-B2O3-SiO2系玻璃經過熱處理引起相分離，生成可溶于酸的 Na2O-B2O3 相及不溶于酸的 高硅 相。將酸可溶相浸析出來后剩下的另一相就制成了可控孔徑玻璃，可控孔徑玻璃的主要化學成份就是 二氧化硅 。 (每空1分)16. 不同分子量的蛋白質在電場中的遷移速度與其

16、所帶的 靜電荷數 成正比，與它本身的 半徑 及溶液的 粘度 成反比。(每空1分)17. 溶質保留置換理論的核心是： 當一個溶質被吸附劑西湖時,在溶質份子和吸附劑接觸的表面必然會釋放出一定數目的溶劑分子 。(本小題3分)18 指出三種交聯(lián)葡聚糖的微載體：Cytodex1微載體；Cytodex 2微載體；Cytodex 3微載體19 指出蛋白質復性的三種方法：稀釋法，透析法，液色色譜法等20固液分離的主要方式包括：離心法，過濾法，雙水相萃取，泡沫分離法。21膜的孔徑一般為微米級，依據其孔徑的不同（或稱為截留分子量），可將膜分為微濾膜、超濾膜、納濾膜和反滲透膜22 色譜的保留值可以用保留時間也可以用

17、保留體積來表示。23色譜的峰寬可以用半峰寬、峰底寬、標準偏差表示。24指出下列情況下色譜系統(tǒng)對容質的柱效和分配系統(tǒng)差的關系： 柱效較高，K (分配系數)較大,完全分離； K 不是很大，柱效較高，峰較窄，基本上完全分離； 柱效較低，K 較大,但分離的不好； K 小，柱效低，分離效果更差。25線性色譜的吸附等溫線是直線，非線性色譜的吸附等溫線的形狀常見的有：凸形、凹形、S形、H形、階梯形。從吸附等溫線的形狀可以預見色譜曲線的形狀，一般凸形的吸附等溫線代表色譜圖是拖尾的，凹形吸附等溫線代表的色譜圖是吐舌頭形狀、S形的色譜圖是波浪形的。26Shepadex G25是一種凝膠排阻色譜，主要用于脫鹽。27

18、Shephadex G100是一種凝膠排阻色譜，主要用于蛋白質的純化。28DEAE-Shaphdex A25是一種離子交換層析介質。29CM-纖維素是一種弱陽離子交換介質。30離子交換層析一般是通過梯度一般采用兩種方法達到分離蛋白質的目的。一種是增加洗脫液的離子強度，一種是改變洗脫液的pH值。31QAE-葡聚糖是強堿陰離子交換劑，SP是強酸陽離子交換劑。32目前徑向色譜柱使用的填料主要有離子交換樹脂和親和色譜兩種;33蛋白質含量和純度測定方法。含量測定:克氏定氮法，TCA比濁度法、雙縮脲法、福林-酚法和紫外線法，考馬斯蘭法（Bradford法）。純度衡量:電泳法，層析法，質譜法等。一般應采用二

19、種以上方法，而且同一原理的方法不應該采用二次。34細胞破碎法包括：機械力和非機械力破碎方法；機械方式又包括：液體剪切力和固體剪切力方法，液體剪切力包括：高壓勻漿法和超聲破碎法；固體剪切力包括：高速珠磨法和壓榨法。35高壓勻漿法的主要困難包括：溫控和堵塞問題36高壓勻漿法的破碎率決定于：勻漿閥的結構，操作壓力，破碎次數。37l 蛋白質的分子量測定：超離心法：l 光散射方法：l 凝膠過濾法：測定完成蛋白質分子的分子量。SDS-PAGE電泳法：是基于在SDS的存在下，蛋白質表面都攜帶了大量負電荷而呈桿狀分子，在此情況下，根據其分子形狀和大小進行分離。測定蛋白質亞基的分子量，與凝膠過濾法一起用，測定用

20、蛋白質分子量，可以方便的判斷樣品蛋白質是否為寡聚蛋白質。38、HPLC色譜柱的關鍵在于填料39、凝膠填料主要類型：多糖類和高聚物型40、泳動度(遷移率)取決于帶電質點的性質，即質點所帶的凈電荷的量、質點的大小和質點的形狀。同時決定于：電泳介質阻力、溶液黏度.41、兩性的生物大分子所帶電荷的性質和數量由其等電點及溶液環(huán)境(pH值)所決定;42、生物物質分離的主要技術手段：細胞破碎、固液分離、膜分離、層析技術、電泳技術三、是非題（請將答案填在下表中相應的題號下面，對的打“”，錯的打“×”，每題1分，共 10分）題號12345678910答案1. 錯 微波加熱法破碎細胞特別適合于對熱(不)

21、穩(wěn)定的的產物的提取。2. 對 凝膠過濾操作中，通常上樣量越小，分辨率越高。3. 對 利用液相色譜方法對包含體蛋白質進行復性比稀釋復性法優(yōu)越.4. 對 一旦液料開始與膜接觸，膜污染就開始發(fā)生。5. 對 濃差極化是一個可逆的過程。6. 錯 膜污染是一個可逆的過程。7. 對 層析系統(tǒng)中,有效柱長>最短柱長是使最難分離的一對溶質將達到完全的基線分離的必要條件.8. 對 層析系統(tǒng)中,當實際柱長<最短柱長, 則該分離過程不能達到物質的有效分離.9. 對 層析過程中,有效柱長是隨層析條件的變化而變化的.10. 對 層析過程中,可以通過改變洗脫劑的濃度變化梯度改變有效柱長和最短柱長.11. 錯 分

22、析色譜是線性色譜；12. 錯 制備型色譜是非線性色譜。13. 對 只要樣品進樣量足夠大，色譜過程就是一種非線性色譜。14. 對 非線性色譜的保留值是可變的，峰形是不對稱的，峰高與樣品量不成正比關系15. 錯 生化用離子交換樹脂的電荷密度越大，其分離效果越好。16. 對 HPLC填料的顆粒粒度的分布應該是越小越好的，最好是能實現(xiàn)顆粒的單分散。17. 錯 樣品中蛋白質的純度為99%，說明該樣品中目標蛋白質的含量為樣品總量的99%。18. 對 實驗室可以使用SDS-PAGE電泳測量蛋白質的分子量。19. 錯 所有的蛋白質電泳都是利用不同蛋白質帶的電荷的差異而達到分離不同蛋白質目的的。20. 錯 硅膠

23、在pH114的范圍內都很穩(wěn)定，因此適合于在極端pH條件下的離子交換色譜。21. 錯 葡聚糖凝膠排阻色譜中，上樣量越大，分辨率越高。22. 對 同一蛋白質在不同種類的緩沖液中，只要緩沖液的pH值相同，則蛋白質所帶的電荷數量也相同。23. 錯 凝膠排阻色譜的層析柱越長越好。24. 錯 細胞破碎過程應盡量徹底，使細胞碎片盡可能越小越好。25. 對 HPLC填料的顆粒分散范圍越窄越好。26. 對 利用聚賴氨酸/海藻酸系統(tǒng)進行的細胞微囊化培養(yǎng)，所形成的微囊外膜的孔徑的大小主要是由聚賴氨酸的分子量所決定的。27. 對 非線性色譜的樣品的保留值是可變的.28. 錯 非線性色譜的層析峰形一般來說是高斯正態(tài)分布

24、的對稱峰.29. 對 為了減小樣品在洗脫過程的軸向擴散，可采取增大進樣濃度減少進樣量的方式。30. 錯 動物細胞培養(yǎng)一定要采用貼壁培養(yǎng)的方式。31. 錯 作為動物細胞培養(yǎng)的優(yōu)良微載體應該是剛性的。32. 對 動物細胞培養(yǎng)微戴體的密度應略大于培養(yǎng)基；33. 錯 高速珠磨法比高壓勻漿法破碎細胞的效果好。34. 對 一般講，親水性膜及膜材料電荷與溶質相同的膜較耐污染。35. 對 色譜過程中試樣中的各組分具有不同的K值是分離的基礎36. 對 色譜過程一定溫度下，組分的分配系數K越大，出峰越慢37. 對 單位柱長的塔板數越多，表明柱效越高。38. 對 用不同物質計算可得到不同的理論塔板數。39. 錯 色

25、譜柱效高說明該色譜對物質的分離度高40. 錯 分離度是由色譜柱的柱效所決定的41. 錯 分離度是由色譜柱的分配系數所決定的42. 錯 分離度是由色譜的容量因子所決定的43. 對 分離度由色譜柱的柱效率和物質間的分配系數的差異共同決定。44. 錯 分析色譜是線性色譜;制備色譜屬于非線性色譜。45. 錯 在凝膠排阻層析中，流動相的速度越慢越有利于色譜分離和分析。46. 對 無機高效液相色譜填料主要是以多孔硅膠為基本材料,還有可控孔徑玻璃,氧化鋁,氧化鋯,羥基磷灰石,碳和石墨等.47. 對 兩性的生物大分子所帶電荷的性質和數量由其等電點及溶液環(huán)境(pH值)所決定;48. 對 聚丙烯酰胺濃縮膠的原理包

26、括其pH值=6.9為甘氨酸的等電點。49. 對 SDS-PAGE電泳的遷移率主要由分子量決定，分子量小的移動快。50. 對 SDS-PAGE中SDS的作用是消除蛋白質間的電荷差異，也消除了分子間形狀的差異。51. 對 樣品溶解不好容易造成拖尾52. 錯 Monod常數隨菌體的濃度的變化而變化？53. 對 Monod常數是細胞培養(yǎng)過程中的一個對菌體性質的特征性常數。54. 錯 色譜柱效可從峰寬得到，色譜峰越寬，柱效越低，峰寬相同，柱效相同？55. 錯 決定柱效的因素是分配系數。56. 錯 決定柱效的因素是容量因子。57. 錯 理論塔板數越多，柱效越高。58. 錯 可以說“A柱子的柱效高于B柱子。

27、”59. 錯 分配系數與柱效沒有關系？60. 對 容量因子與柱效有關系？61. 對 柱效不能表示被分離組分的實際分離效果62. 對 用有效塔板數和有效塔板高度作為衡量柱效能的指標時，應指明測定物質63. 錯 微囊化不會使傳質效率受影響（微囊化的缺點：傳質效率受到影響）64. 對 生物反應器的放大要解決的主要問題是由傳質效率的限制引起65. 錯 氣相色譜法適用于高沸點、難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定物質的分析。66. 對 一定溫度下，組分的分配系數K越大，出峰越慢。67. 錯 細胞破碎時破碎率越高越好。68.69.70.四單選題（請將正確答案的字母填在下表中相應的題號下面，每題1分，共10分）題號123456

28、78910答案C1高效液相色譜設備最核心的部分是：（A）高壓輸液系統(tǒng)；（B）高靈敏的檢測系統(tǒng)；（C）高效的層析柱。A2分析型色譜一般是：（A）線性色譜；（B）非線性色譜；（C）離子交換色譜A3DEAE-Sephadex A25是一種：（A）離子交換色譜填料；（B）凝膠排阻色譜填料；（C）親和色譜填料C4顆粒表面主要含C18、C8基團的色譜填料適合作為：（A）離子交換色譜填料；（B）正相色譜填料； （C）反相色譜填料B5下面關于高速珠磨法和高壓勻漿法破碎細胞的提法哪種是正確的？（A）高速珠磨法比高壓勻漿法更優(yōu)越；（B）高速珠磨法和高壓勻漿法各有優(yōu)點；（C）高壓勻漿法比高速珠磨法效率更高；A6多孔

29、硅膠分子中最常見的硅羥基是：（A）單硅羥基；（B）二硅羥基；（C）三硅羥基；B7羥基磷灰石是一種：（A）有機色譜填料；（B）無機色譜填料；（C）親和色譜填料C8符合下面什么條件時的層析方案是不可行的：（A）最短柱長<有效柱長;(B) 實際柱長>最短柱長;(C) 最短柱長>有效柱長A9. 利用生物物質生物功能的差異進行分離的是：(A) 親和層析;(B) 離子交換層析；（C）羥基磷灰石層析1B0下面關于蛋白質純度的提法哪個是正確的：（A）蛋白質純度是指目標蛋白質占樣品總量的百分比；（B）蛋白質純度是指目標蛋白質占樣品中總蛋白的質量百分比；（C）蛋白質純度可以通過考馬斯亮藍法測定；

30、D11關于細胞破碎方法，以下提法哪種是正確的：（A）細胞破碎是以破碎率為基準的；（B）高壓勻漿法比高速珠磨法更加優(yōu)越；（C）高速珠磨法比高壓勻漿法更加優(yōu)越；（D）高速珠磨法和高壓勻漿法各有特點；A12. 在理想狀態(tài)下,下列哪種色譜對二種物質的分離度可以隨柱長的延長而無限增加:(A) 凝膠排阻色譜;(B) 離子交換色譜;(C) 親和色譜;(D) 分配色譜;B13. 下列哪種色譜填料最適合做為徑相色譜的填料:(A) 凝膠排阻色譜;(B) 離子交換色譜;(C) 疏水色譜;(D) 分配色譜;A14Sephadex G50是一種：（A）凝膠排阻色譜填料；（B）親和色譜填料；（C）離子交換色譜填料；（D）

31、吸附色譜填料。C15對于HPLC填料的顆粒大小，下列提法哪種是正確的：（A）制備型HPLC填料以小顆粒為佳；（B）HPLC填料的顆粒越大越好；（C）HPLC填料必須具有合適的顆粒大小和較窄的顆度分布；（D）顆粒大的HPLC填料的剛性比小顆粒HPLC填料的剛性好。D16下面哪種色譜填料是葡聚糖和瓊脂糖交聯(lián)的產物：（A）Sephaadex LH-20(B) Sepharose CL;(C) Sephasorb HP(D) Superdax;A17. 聚合物型基質材料中，下列哪種是應用最為廣泛的：（A）交聯(lián)聚苯乙烯樹脂；（B）交聯(lián)聚甲基丙烯酸酯類樹脂；（C）羥基化聚醚樹脂；（D）交聚聚乙烯醇樹脂；D

32、18對于硅膠而言，其表面的硅羥基是進行化學修飾的基礎，硅膠表面的硅羥基的主要存在形式是：（A） 硅三羥基； （B） 硅二羥基；（C）鄰位硅羥基；（D）單硅羥基；A19不經過化學修飾或改性的硅膠本身可以做為：（A）正相色譜填料；（B）反相色譜填料；（C）離子交換色譜填料；（D）親和色譜填料；A20羥基磷灰石是一種：（A）弱離子交換色譜填料；（B）強離子交換色譜填料；（C）吸附色譜填料；（D）分配色譜填料；A21蛋白質電泳中蛋白質所帶的凈電荷主要是由以下哪種因素所決定的：（A）電泳緩沖液的pH值；（B）電泳緩沖液的類型；（C）電場的強度；（D）蛋白質分子本身的氨基酸組成；B22在保證電泳結果準確性

33、的前提下，為了降低電泳過程的溫度升高，以下哪種方式是最合理的：（A）降低電流和電壓；（B）降低電流并適當提高電壓；（C）降低緩沖液的離子強度；（D）提高電流強度并適當降低電壓。D23下列方法哪種適合用于測量蛋白質的純度：（A）考馬斯亮藍法；（B）克氏定氮法；（C）雙縮脲法；（D）SDS-PAGE電泳法A24蛋白質提取得率主要由以下哪個階段所決定（A）初級分離階段；（B）精制分離階段；（C）破碎細胞階段；（D）各個階段的影響差不多C25在蛋白質進取過程中進行細胞破碎的目的是：（A）追求最大的破碎率；（B）使細胞內容物全部釋放出來；（C）使目標物質最大限度釋放出來；（D）使下階段的過濾階段速度更快

34、。B26超聲破碎細胞的原理是：（A）固體剪切力；（B）液體剪切力；（C）非機械剪切力；（D）聲波直接作用于細胞膜使細胞破裂。B27下列哪種色譜是利用生物物質的功能的不同進行分離的：（A）離子交換色譜（B）親和色譜（C）反相色譜（D）正相色譜A28. 解決培養(yǎng)條件和最優(yōu)化控制的困難的最好方法（A）灌注(B)換液(C)流加(D)以上三種效果都差不多D29、目前細胞培養(yǎng)產物的收率很低，不及總蛋白的1%，主要原因不包括： (A) 血清蛋白質的污染(B) 細胞表達產物濃度低 (C) 產物在培養(yǎng)條件下不穩(wěn)定(D)分離技術限制B 30、生化用離子交換劑的特點不包括（A）粒徑小，分布均勻 (B)疏水性(C)生

35、物相容性(D)適當的電荷密度C31、微囊化使一下哪個受到消極影響（A）抗剪切力（B）細胞生長環(huán)境（C）傳質效率（D）產物濃度A32、雙水相萃取最困難的是（A）如何使需要的蛋白質盡量集中在上相（B）如何使需要的蛋白質盡量集中在下相（C）保持蛋白質穩(wěn)定（D）防止蛋白質的空間結構受破壞五、綜合題（共40分）1 試述非線性色譜的概念及其特點?非線性色譜: 流動相中的樣品濃度(Cm)與固定相中的樣品濃度(Cs)不呈線性關系的色譜.分析色譜大多屬于線性色譜;制備色譜大多屬于非線性色譜非線性色譜的特點. 樣品的保留值可變:非線性色譜的保留值隨樣品及其濃度的不同而變化;. 峰形的不對稱性:不是高斯正態(tài)分布的;

36、. 色譜峰的峰高與濃度不是線性關系:峰高增加的速率隨濃度的增加而下降.2 什么叫吸附等溫線?研究吸附等溫線有什么意義?附等溫線：指在一定溫度下物質分子在兩相界面上進行的吸附過程達到平衡時它們在兩相中濃度之間的關系。研究吸附等溫線可以提供得到以下方面的信息：. 預測代表該吸附等溫線的組分在非線性色譜中色譜峰的形狀；. 為非線性色譜分離與純化物質選擇最佳條件；. 反映被分離物質分子與固定相表面的作用，從而研究分子的構型及吸附狀態(tài)。. 建立分子結構-吸附之間的定量關系，從而由分子結構預測吸附性能。3 做為優(yōu)良的凝色譜介質應該具備什么基本特點?. 介質本身為惰性物質，不與溶質、溶劑分子發(fā)生任何作用；.

37、 應盡量減少介質內含的帶電離子基團，以減少特異性吸附，提高蛋白質的收率；. 介質內孔徑大小要分布均勻，即孔徑分布較窄。. 凝膠珠粒大小均勻；. 介質要有良好的物理化學穩(wěn)定性及較高的機械強度，易于消毒。4 做為優(yōu)良的HPLC填料應具備什么基本的物理化學特性?§ 在物理結構上的要求: 合適的顆粒大小及較窄的粒度分布; 一定的顆粒強度; 一定的孔徑大小和孔徑分布,避免復雜的微孔結構; 一定的溶脹及收縮水平;優(yōu)良的HPLC填料目前的主要發(fā)展方向: 顆粒單分散的填料; 貫穿性超大孔結構的填料; 小顆粒的非多孔填料;§ 在化學結構上的要求:填料的化學結構,特別是顆粒表面和內孔表面的化學

38、結構(如連接在基質上的官能基團或鏈段)是影響色譜熱力學行為(保留值,選擇性等)的主要因素 特定的選擇性; 良好的化學穩(wěn)定性; 避免不可逆吸附;5 試述對硅膠的硅羥基進行表面化學修飾的主要方式. 通過氯化反應：可以將硅羥基轉化成硅氯基，硅氯基性質活潑可以與各種化合物反應而引入相應的基團。這種方法引入的基團是單分子層的，具有較好的傳質能力和色譜性能，但成本較高。. 通過氯硅烷與硅羥基的反應：通過氯硅烷可以將各種烷基鏈引入硅膠表面。氯硅烷包括一氯代型，二氯代型和三氯代型等。. 通過烷氧基硅烷與硅羥基的反應：硅氧基硅烷與硅膠進行縮合反應，使硅膠表面帶上環(huán)氧基或氨基等基團，在此基礎上可以很方便地進一步進

39、行反應或修飾。這一健合反應可以在水相，也可以有機介質中進行6 試述羥基磷灰石做為一種有廣闊發(fā)展前途的色譜填料的主要特點.羥基磷灰石(hydroxyapatite, HAP)是一種弱陽離子或弱陰離子交換層析材料.其材料本是骨骼和牙齒等生物硬組織的主要無機成分,與生物組織有特異性的親和力和相容性.其優(yōu)點是:能精確地分離,純化結構上只有微小差別的生物大分子.做為一種優(yōu)良的色譜填料,羥基磷灰石具有以下特點:. 高機械強度:可以耐受15MPa以上壓力,陶瓷HAP可以耐受幾十MPa的壓力. 高柱效:球形HAP顆粒大小,形狀及孔隙大小均適合HPLC的要求.其顆粒及孔徑小,有比較高的柱效. 化學和熱穩(wěn)定性:是

40、磷酸鈣鹽中最穩(wěn)定的,在中性和堿性不相中非常穩(wěn)定,溶解度很低,熱穩(wěn)定性很高,可采用高溫制備方法生產. 低的非可逆性吸附:HAP有非常低的非可逆性吸附. 表面修飾性:HAP表面比較容易進行各種化學修飾. 總之HAP:高選擇性,高鍵合容量,低的非可逆吸附,良好的化學和熱穩(wěn)定性.7 試述化學滲透法破碎細胞的原理及其優(yōu)缺點?作用機理：某些有機溶劑，抗生素，表面活性劑，金屬螯合劑，變性劑等化學藥品都可以改變細胞壁或膜的通透性，從而使內容物有選擇地滲透出來，這種處理方法叫滲透法。§ 優(yōu)點（相對機械破碎）： 對產物釋出有一定的選擇性； 細胞保持完整，碎片少，利于進一步提?。?核酸釋放量少，黏度低，便

41、于進一步分離。§ 缺陷： 時間長，效率低； 化學試劑有毒； 通用性差8 與傳統(tǒng)的稀釋法和透析法相比，液相色譜復性的優(yōu)點是：. 在進樣后可很快的除去變性劑；. 色譜固定相對變性蛋白質的吸附可明顯的減少、甚至完全消除變性蛋白質分子在脫離變性劑環(huán)境后的分子聚集，從而避免了沉淀的產生，提高蛋白質復性的質量和活性回收率；. 在蛋白質復性的同時，可使目標蛋白質與雜蛋白分離達到純化的目的，使復性和純化同時進行；. 便于回收變性劑，降低廢水處理成本。9 在對包含體蛋白質進行增溶和復性的過程中為什么要加入還原劑,同時為什么還必須加入金屬螯合劑?常用的還原劑有哪些?在復性后為什么要加入氧化劑?常用的氧化

42、劑有哪些?（10分）10 什么叫雙水相萃取?在雙水相萃取中為什么要盡量將細胞碎片集中在下相?可以采取什么可能的措施在使細胞碎片盡量集中在下相的同時,使目標蛋白質盡可能集中在上相?（9分）11 什么是徑向色譜?徑向色譜應用于生物物質分離有什么優(yōu)點?（7分）采用徑向流技術的色譜，即樣品和流動相沿徑向流動，可以從色譜柱的周圍流向圓心，也可以從圓心流向柱的周圍。通常采用從柱的周圍流向圓心的方式。徑向色譜應用于生物物質分離的優(yōu)點：采用徑向流技術，可以在較小的柱床層高度時使用較大的流動相速度；在較高流動相速度時，反壓降低；可以線性地增加樣品處理量，樣品可以在完全相同的色譜條件下直接放大。12 利用微載體進

43、行動物細胞培養(yǎng)的優(yōu)點有哪些？答：微載體培養(yǎng)的優(yōu)點: 表面積/體積比大; 微載體懸浮于培養(yǎng)基中,細胞生長環(huán)境均一,便于監(jiān)測和控制; 培養(yǎng)基利用率高; 采樣重演性好; 收獲過程不復雜; 放大較容易; 勞動強度小,占用空間小.13 為什么動物細胞培養(yǎng)要用血清培養(yǎng)基？血清培養(yǎng)基使用有何缺點？答：1）因為動物細胞正常生長所需要的一些必要成份均存在于血清中，而且這些成份的組成及其含量至今沒有被闡明，因此只能直接采用血清進行培養(yǎng)，而目前尋找無血清的制品代替進行培養(yǎng)并沒有獲得廣泛的成功。2）采用血清培養(yǎng)基有以下缺點： 血清是培養(yǎng)基成本的主要部分；血清中含有細胞生長必須的微量組分，但這些組分的成分及其作用至今未

44、清楚，因此無法取代； 血清的存在是產物純化的主要障礙； 血清是病毒污染及其他未知因素影響的主要來源，增加了細胞培養(yǎng)產品潛在的使用危險； 血清同時也有生長抑制的作用； 血清使用使實驗和生產過程標準化變得困難。14 試述聚賴氨酸/海藻酸（PLL/ALG）微囊化的原理：答：原理是：海藻酸的水溶液以鈣鹽形式存在是呈凝膠狀態(tài)，用螯合劑去除鈣離子后又恢復溶液狀態(tài)，當海藻酸鈣用聚賴氨酸預先處理后，就不再被螯合劑去鈣而溶解。據此，先將動物細胞與海藻酸混合，滴入CaCL2溶液中成微珠，用聚賴氨酸處理表面，再用螯合劑處理，則表面還是呈凝膠狀態(tài)而中間成液態(tài)。15 影響聚賴氨酸/海藻酸微囊化的一些因素：答：1）半透膜

45、的孔徑大小是關鍵，由PLL的分子量所決定；2）海藻酸的純度、黏度及甘露糖醛酸/古羅糖醛酸比例都會影響微囊化的形成及機械性能；3）動物細胞的存活率與微囊化過程的時間及溫度pH、滲透壓等有關；16 高壓勻漿法的作用機理：作用機理：高壓泵將電機的旋轉運動轉變成勻漿閥柱桿的直線運動，從高壓室（幾十兆帕）壓出細胞懸浮液，經過碰撞環(huán)的撞擊后改變方向從出口管噴出，使細胞經歷較高的流速下的剪切碰撞發(fā)生較大的變形，從而達到破碎細胞的目的17 化學滲透法破碎細胞的原理及其優(yōu)缺點。答：作用機理：某些有機溶劑，抗生素，表面活性劑，金屬螯合劑，變性劑等化學藥品都可以改變細胞壁或膜的通透性，從而使內容物有選擇地滲透出來，

46、這種處理方法叫滲透法。優(yōu)點（相對機械破碎）：對產物釋出有一定的選擇性；細胞保持完整，碎片少，利于進一步提??；核酸釋放量少，黏度低，便于進一步分離。缺陷：時間長，效率低；化學試劑有毒；通用性差18 酶溶法機理：就是利用生物酶將細胞壁和細胞膜消化溶解的方法。優(yōu)點：一定的選擇性；細胞外形完整，核酸釋放少，有利于進一步分離過程缺點：（只能用于實驗室）產物抑制造成效率低下；溶酶價格高；通用性差， 不易確定最佳條件；19 微波加熱法機理：微波加熱導致細胞內極性物質，尤其是水分子吸收微波能，產生大量熱量，使胞內溫度迅速上升，液態(tài)水汽化產生的壓力將細胞膜和細胞壁沖裂，形成微小孔洞，進一步加熱可導致細胞內部和細

47、胞壁水分減少，細胞收縮，表面出現(xiàn)裂紋。優(yōu)點：微波穿透性強，選擇性高、加熱效率高。缺陷：一般只適合對熱穩(wěn)定物質的分離；被處理的物料要具有良好的吸水性；不適于富含淀粉和樹膠等的天然植物20 包含體蛋白溶解的方要方式是什么？在溶解過程中為什么要加入還原劑，為什么要在復性完成后才加入氧化劑？答：包涵體的溶解必須用很強的變性劑，如8mol/L尿素、68mol/L鹽酸胍，通過離子間的相互作用破壞包涵體蛋白間的氫鍵而增溶蛋白。其中尿素的增溶效果稍差，異氰鹽酸胍最強；去污劑，如SDS，可以破壞蛋白內的疏水鍵，可以增溶幾乎所有的蛋白，但由于無法徹底去除而不允許用在制藥行業(yè)中；酸，如70%甲酸，可以破壞蛋白的次級

48、鍵從而增溶蛋白，這種方法只適合少數蛋白質。對于含有半胱氨酸的蛋白，在增溶時應加入還原劑（如DTT、GSH、-ME）打開蛋白質中所有二硫鍵，對于沒有二硫鍵的目標蛋白有時也應使用還原劑，因為含二硫鍵的雜蛋白會影響包涵體的溶解，同時還應加入金屬螯合劑，如EDTA或EGTA，用來螯合Cu2+、Fe3+等金屬離子以防止其與還原狀態(tài)的巰基發(fā)生氧化反應。21 包含體蛋白質含 有二個以上二硫鍵應該如何處理？為什么要在復性完成后再加入氧化劑？22 根據流體各組分尺寸大小的不同，利用高分子聚合膜，過濾分離微米級的細胞、細胞碎片和生物大分子的過程，叫微孔膜過濾。§ 優(yōu)點： 容易做到封閉式操作，不受環(huán)境污染

49、 設備投資少，操作安全； 加工量可大可小，十分方便； 有利于分離密度差小而難以離心的固體，可直接用于下游的層析過程。§ 缺點： 技術難以掌握，影響因素多； 穩(wěn)定性和重復性不好； 膜堵塞問題是最難以解決的問題23 雙水相萃取的一般原則：§ 一般的原則是將碎片分配在下層(調節(jié)和無機鹽濃度比例，可以控制細胞碎片在上下層間的分配)其好處有： 核酸等大部分雜質一般處于下相，可以一并除去； 下相是無機鹽富集相，作為廢棄物成本低些； 蛋白質保持于上相的層有利于其活性的保持； 碎片在下相有利于離心機的連續(xù)分離；24 試述包含體復性的基本過程,復性過程錯誤發(fā)生的主要原因是什么?舉例分析主要的

50、復性方法的優(yōu)缺點,為什么LC復性是最好的?包含體復性的基本過程： 分離包含體：第一步是對培養(yǎng)收集的細胞進行破碎，比較有效的方法是高壓勻漿結合溶菌酶處理，然后500020000g離心，可使大部分包涵體沉淀，與可溶性蛋白分離 洗滌：包涵體沉淀需用去污劑（Triton X-100或脫氧膽酸鈉）和低濃度變性劑（2mol/L尿素或鹽酸胍等）洗滌除去脂類和膜蛋白，這一步很重要，否則會導致包涵體溶解和復性的過程中重組蛋白質的降解 溶解：包涵體的溶解必須用很強的變性劑，通過離子間的相互作用破壞包涵體蛋白間的氫鍵而增溶蛋白。去污劑可以破壞蛋白內的疏水鍵，可以增溶幾乎所有的蛋白，但由于無法徹底去除而不允許用在制藥

51、行業(yè)中；酸可以破壞蛋白的次級鍵從而增溶蛋白，這種方法只適合少數蛋白質。對于含有半胱氨酸的蛋白，在增溶時應加入還原劑打開蛋白質中所有二硫鍵，對于沒有二硫鍵的目標蛋白有時也應使用還原劑，因為含二硫鍵的雜蛋白會影響包涵體的溶解，同時還應加入金屬螯合劑用來螯合Cu2+、Fe3+等金屬離子以防止其與還原狀態(tài)的巰基發(fā)生氧化反應。復性過程錯誤發(fā)生的主要原因是：在去除變性劑的同時，重組蛋白質在體外折疊，分子間存在大量錯誤折疊和聚合，復性效率往往很低，包涵體蛋白折疊復性的效率實際上取決于正確折疊過程與聚集過程之間的競爭。復性方法的優(yōu)點：透析、稀釋和超濾復性法，這三種方法是最傳統(tǒng)也是應用最普遍的蛋白質折疊復性方法

52、，使變性劑濃度降低到蛋白質能恢復折疊的濃度。復性方法的缺點：復性活性回收率低，而且難于與雜蛋白分離。稀釋法大大增加溶液體積，不利于后續(xù)的分離純化；透析法耗時長，易形成無活性蛋白質聚集體；超濾法在膜上聚集變性，易造成膜污染；稀釋法處理量太大，不利于工業(yè)放大。LC復性是最好的原因：與傳統(tǒng)的稀釋法和透析法相比，液相色譜復性的優(yōu)點是： 在進樣后可很快的除去變性劑； 色譜固定相對變性蛋白質的吸附可明顯的減少、甚至完全消除變性蛋白質分子在 脫離變性劑環(huán)境后的分子聚集，從而避免了沉淀的產生，提高蛋白質復性的質量和活性回收率； 在蛋白質復性的同時，可使目標蛋白質與雜蛋白分離達到純化的目的，使復性和純化同時進行

53、； 便于回收變性劑，降低廢水處理成本。25 包含體蛋白質含 有二個以上二硫鍵應該如何處理？為什么要在復性完成后再加入氧化劑？26 寫 出斯托克斯公式,分析其基本意義.從該公式分析離心的主要條件.斯托克斯公式(Stokes)：Uc=d2(s-L)r2/18。其意義是： 密度差(s-L)越大，離心沉降速度越快； 在密度差(s-L)存在下，固體顆粒尺寸越大，越容易離心； 液體黏度越大，越不容易離心； 離心力（r2 ）的大小對固液分離很有影響，要增大離心力來提高分離效率。離心的主要條件是：轉速和時間。27 從達西公式分析利用膜進行固液分離要注意的問題,其目前存在的主要困難是什么?達西公式：V=P/(Rc+Rm) 。從式中可見，在P恒定下，濾餅厚度的增加會降低過濾速度。因此寶座過濾速度不變的一個辦法是設法阻止濾餅的生成，或者維持濾餅的厚度不增加。其目前存在的主要困難