現(xiàn)代生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)

1、實(shí)驗(yàn)一 實(shí)驗(yàn)儀器的介紹（4課時(shí)）介紹本院已有的實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備，使學(xué)生了解儀器設(shè)備的基本原理和操作方法。實(shí)驗(yàn)二 質(zhì)粒的提取和純化（8課時(shí)）實(shí)驗(yàn)?zāi)康模毫私鈮A裂解法制備質(zhì)粒的原理，掌握質(zhì)粒的小量制備方法。實(shí)驗(yàn)原理：質(zhì)粒DNA的抽提是基因工程操作中最常用與最基本的技術(shù)，現(xiàn)已有多種成熟的方案可供選擇。最常用的有利用堿性條件下質(zhì)粒DNA與染色體DNA變復(fù)性的不同進(jìn)行分離的堿法；利用酸性、低離子強(qiáng)度時(shí)超螺旋在水相中，開環(huán)、線型分子在酚相中進(jìn)行分離的酸酚法；利用羥基磷灰石在特定的條件下(8molL尿素，0.24molL磷酸緩沖液pH6.8)只吸附雙鏈DNA的羥基磷灰石法(在上述條件下染色體DNA均成單鏈，質(zhì)粒

2、DNA保持雙鏈)等。本實(shí)驗(yàn)選做的是堿法。1. 裂解細(xì)胞 裂解細(xì)胞是指通過溶菌酶、去污劑等試劑破裂細(xì)胞壁與膜的過程。對(duì)于不同的菌要選用不同的方法，通常有煮沸法、非離子型去污劑法、堿性SDS法(簡稱堿法)等。三種方法比較而言，非離子型去污劑法較溫和，適用于抽提10kb左右的質(zhì)粒；而煮沸法與堿性SDS法相對(duì)較劇烈，只能抽提小于10kb的質(zhì)粒。常用的離子型去污劑是SDS、非離子型去污劑有Triton X-100等。2分離 即將質(zhì)粒DNA和染色體DNA分離。堿法的分離原理如下：大腸桿菌的染色體約有4700kb長，在處理細(xì)胞過程中都斷裂成不同長度的雙鏈DNA片段。當(dāng)溶液的pH調(diào)到大于12時(shí)雙鏈DNA中的氫

3、鍵被破壞，于是染色體DNA的雙鏈分離成單鏈；而超螺旋狀態(tài)的質(zhì)粒DNA僅僅是氫鍵被破壞，并只發(fā)生部分雙鏈解離成單鏈的變化。再當(dāng)pH調(diào)回中性時(shí)單鏈DNA互相纏繞且與蛋白質(zhì)結(jié)合生成網(wǎng)絡(luò)狀大分子，而超螺旋的質(zhì)粒發(fā)生復(fù)性反應(yīng)后仍是小分子，通過離心的方法很容易將二者分開，達(dá)到分離的目的。3純化 細(xì)胞裂解液中的雜質(zhì)除了染色體DNA外還有各種細(xì)胞壁、膜碎片、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)類物質(zhì)及RNA。純化的步驟就是有針對(duì)性地將它們?nèi)コ?。RNA可用牛胰Rnase A分解除去。蛋白質(zhì)可通過酚、酚氯仿、氯仿異戊醇，使蛋白質(zhì)變性劑而除去，同時(shí)，氯仿有強(qiáng)烈的溶脂傾向，對(duì)于在除去蛋白質(zhì)的同時(shí)去除脂質(zhì)類雜質(zhì)很有好處。氯仿還能將微量的、溶于

4、DNA水溶液的酚抽提掉，而微量的酚對(duì)于以后的酶切、轉(zhuǎn)化等過程都會(huì)產(chǎn)生不利影響。氯仿異戊醇的蛋白質(zhì)變性能力較弱，主要用于含酚試劑處理后的抽提。正確的去除蛋白質(zhì)雜質(zhì)的過程：應(yīng)該是酚 酚+氯仿(1:1) 氯仿（或氯仿異戊醇24:1)處理，根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況也可考慮省略第一或第二步，但切記不可將氯仿（氯仿異戊醇）的處理步驟省略掉。抽提過程完成后的水溶液中仍有痕量的酚、氯仿等，可用乙醇沉淀的方法將它們除去。用無水乙醇沉淀的特點(diǎn)是能將DNA進(jìn)行濃縮，且同時(shí)也更換了整個(gè)緩沖系統(tǒng)，但DNA也有一定的損失。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：試劑1.LB培養(yǎng)液(1L) 細(xì)菌培養(yǎng)用蛋白胨 10g細(xì)菌培養(yǎng)用酵母粉 5gNaCl 10g用10mol

5、L NaOH調(diào)至pH7.0，高壓蒸氣滅菌, 4貯存。2溶液，可成批配置，滅菌后4貯存。葡萄糖50mmolLTris-C1(pH8.0)25mmolLEDTA10mmolL3溶液(新鮮配制) NaOH 0.2molL SDS 14溶液5molL KAc60ml冰醋酸11.5ml水28.5ml配制好的溶液含3molL鉀鹽，5molL 醋酸(pH4.8)。卡那霉素(Kana): 50mg/ml, 過濾除菌。5重蒸酚：市售苯酚蒸餾純化(收集179181之間的酚)后，用TE飽和，使水相的pH在7.5以上，4保存。6氯仿:異戊醇(24:1)7無水乙醇8RNaseA(10mgml)93molL NaAc(p

6、H5.2)10TE：10mmolL Tris-C1(pH8.0) 1mmolL EDTA材料 含有質(zhì)粒(pNTE-EGFP, pEGFPN3)的大腸桿菌DH5a。操作步驟1挑取瓊脂培養(yǎng)板上的含有pNTE-EGFP, pEGFPN3質(zhì)粒的單菌落，接種至5ml LB培養(yǎng)液(含Kana 50gm1)，37振蕩培養(yǎng)過夜。2取出1.5ml培養(yǎng)液至1.5ml離心管中，12 000rmin離心2min，棄上清。3將細(xì)菌沉淀重懸于100l預(yù)冷的溶液工中，強(qiáng)烈振蕩混勻。4加入200l溶液，蓋嚴(yán)管蓋，輕輕顛倒混勻5次，冰浴5min。5加入150l預(yù)冷的溶液，溫和振蕩10s，冰浴5min。612 000rmin 室

7、溫離心5min，取上清至一個(gè)新的無菌的1.5m1 Eppendorf管中。7加入等體積酚氯仿(1:1)，振蕩混勻，12 000rmin離心2min，上清轉(zhuǎn)移至另一個(gè)Eppendorf管中?！咀⒁狻糠泳哂懈g性，操作時(shí)小心。 8加入等體積氯仿，振蕩混勻，12 000rmin離心2min，上清轉(zhuǎn)移至另一個(gè)Eppendorf管中。9加入2倍體積預(yù)冷無水乙醇-20沉淀10min。1012 000rmin離心10min，去上清，沉淀用70乙醇洗滌一次，空氣中晾干。11加入20l TE溶解質(zhì)粒DNA，加入RNaseA，終濃度20gm1 37水浴0.5h。12經(jīng)0.7瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后觀察抽提結(jié)果。

8、【注意】EB為致癌物，操作時(shí)一定要戴乳膠或一次性手套。 13將該管質(zhì)粒保存于-20備用。注意事項(xiàng) 1該實(shí)驗(yàn)成功的標(biāo)志是把染色體DNA、蛋白質(zhì)與RNA去除干凈，獲得一定得率的質(zhì)粒DNA。去掉染色體DNA最為重要，也較困難，因?yàn)樵谌刻崛∵^程中，只有一次機(jī)會(huì)去除染色體DNA，其關(guān)鍵步驟是加入溶液與溶液時(shí)，控制變性與復(fù)性操作時(shí)機(jī)，既要使試劑與染色體DNA充分作用使之變性，又要使染色體DNA不斷裂解成小片段，從而能與質(zhì)粒DNA相分離。這就要求試劑與溶菌液充分搖勻，搖動(dòng)時(shí)用力適當(dāng)，一般來說當(dāng)溶液加入時(shí)可用力振蕩幾次，因?yàn)榇藭r(shí)細(xì)菌還沒有與堿和SDS作用，染色體DNA尚未釋放，不必?fù)?dān)心其分子斷裂，加入SDS

9、后，則要注意不能過分用力振蕩，溫和混勻,但又必須讓它反應(yīng)充分。加入溶液II混勻之后,一定在冰上放置,不要搖動(dòng),對(duì)于溶液溶液III,同樣處理! 2. 加入溶液I之前,注意將離心管倒扣過來,將培養(yǎng)基完全流出。 加乙醇沉淀DNA時(shí)，要把離心管加蓋倒翻搖動(dòng)45次，注意觀察水相與乙醇之間沒有分層現(xiàn)象之后，才可以放在冰箱中去沉淀DNA,以獲得更多的DNA。 3乙醇沉淀DNA離心后，要把離心管四周的上清液抽干或自然揮發(fā)(可將離心管倒置于濾紙上以盡量讓管內(nèi)液體流出)。否則，用TE緩沖液溶解DNA時(shí)，既困難又不完全。 4為了得到純凈的DNA樣品和清晰的電泳條帶，加入1l RNA酶，將管置50水浴箱內(nèi)30min，

10、消化RNA。 6抽提產(chǎn)物經(jīng)電泳分離、EB染色后，在紫外線燈下可觀察到三個(gè)條帶，自前往后分別為：超螺旋、線性及開環(huán)質(zhì)粒DNA。【思考題】堿法提取質(zhì)粒的原理是什么？實(shí)驗(yàn)三 質(zhì)粒DNA的電泳和純度檢測（8課時(shí)）實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆誅NA瓊脂糖電泳技術(shù)，了解紫外分光光度法測定DNA濃度和純度的原理。實(shí)驗(yàn)原理：帶電荷的物質(zhì)在電場中的趨向運(yùn)動(dòng)稱為電泳。其中，凝膠電泳由于其操作簡單、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，使它成為分離、鑒定和提純核酸的首選標(biāo)準(zhǔn)方法。 與蛋白質(zhì)分子類似，核酸分子也是兩性解離分子。在pH3.5時(shí)，堿基上的氨基基團(tuán)解離，而三個(gè)磷酸基團(tuán)中只有第一個(gè)磷酸解離，整個(gè)分子帶正電荷，在電場中向負(fù)極泳動(dòng)；在pH值為8.

11、08.3時(shí)，堿基幾乎不解離，磷酸全部解離，核酸分子帶負(fù)電荷，向正極移動(dòng)。不同大小和構(gòu)象的核酸分子的電荷密度大致相同，在自由泳動(dòng)時(shí)，各核酸分子的遷移率區(qū)別很小，難以分開。所以采用適應(yīng)濃度的凝膠介質(zhì)作為電泳支持物，發(fā)揮分子篩的功能，使得分子大小和構(gòu)象不同的核酸分子泳動(dòng)率出現(xiàn)較大差異，達(dá)到分離的目的。值得注意的是，等長度的單鏈DNA和雙鏈DNA在中性或堿性凝膠中的遷移率大致相等。1影響泳動(dòng)的四大因素(1)影響泳動(dòng)的首要因素是電泳樣品的物理性質(zhì)：包括電荷多少、分子大小、顆粒形狀和空間結(jié)構(gòu)。一般來說顆粒帶電荷的密度愈大，泳動(dòng)速率愈快；顆粒物理形狀愈大，與支持物介質(zhì)摩擦力越大，泳動(dòng)速度越小。即泳動(dòng)率與顆粒

12、的分子大小，介質(zhì)粘度成反比；與顆粒所帶電荷成正比。在檢測未知DNA分子量時(shí)，DNA分子的空間構(gòu)型不同，即使相同的分子量其遷移率也不同。如質(zhì)粒DNA存在閉環(huán)(型，CC)，單鏈開環(huán)(型，OC)和線性(型，L)。三者之間的遷移速率，一般為型型型，但是有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)相反的情況，因?yàn)榕c瓊脂糖濃度、電流強(qiáng)度、離子強(qiáng)度及溴乙錠染料含量有關(guān)。當(dāng)膠濃度較高或電場強(qiáng)度較大時(shí)，型DNA與型DNA互換位置，而型DNA總是遷移最慢。(2)支持物介質(zhì)：DNA的凝膠電泳常使用兩種支持材料：瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠。通過這兩種介質(zhì)的濃度變化調(diào)整所形成凝膠的分子篩網(wǎng)孔大小，分離不同分子量的核酸片段。瓊脂糖凝膠的孔徑大，可以分離長度

13、為100bp至近60kb的DNA分子；聚丙烯酰胺凝膠的孔徑小，可分離小片段(5500bp)DNA，效果最好。因此，選用不同的凝膠種類和濃度可以分辨大小不同的DNA片段。(3)電場強(qiáng)度：電泳場兩極間單位支持物長度的電壓降即為電場強(qiáng)度或電壓梯度。電場強(qiáng)度愈大，帶電顆粒的泳動(dòng)速率愈快，但凝膠的有效分離范圍隨電壓的增大而減小。在低電壓時(shí)，線性DNA分子的泳動(dòng)率與電壓成正比。一般凝膠電泳的電場強(qiáng)度不超過5Vcm；對(duì)于大分子量真核基因組DNA片段的電泳常采用0.51.0Vcm電泳過夜，以取得較好的分辨率和整齊的帶型。電壓10002000V，電場強(qiáng)度20600Vcm的電泳為高壓電泳，必須用聚丙烯酰胺做介質(zhì)。

14、(4)緩沖液離子強(qiáng)度：緩沖液是電泳場中的導(dǎo)體，它的種類、pH值、離子濃度直接影響電泳的效率。Tris.C1緩沖體系中，由于Cl的泳動(dòng)速度比樣品分子快得多，易引起帶型不均一現(xiàn)象，所以常利用TAE、TBE和TPE三種緩沖體系。緩沖液的pH值直接影響DNA解離程度和電荷密度，緩沖液pH值與DNA樣品的等電點(diǎn)相距越遠(yuǎn)，樣品所攜帶電荷量越多，泳動(dòng)速度越快。DNA電泳緩沖液，常采用偏堿性或中性條件，使核酸分子帶負(fù)電荷，向正極泳動(dòng)。緩沖液的離子強(qiáng)度與樣品泳動(dòng)速度成反比，電泳的最適離子強(qiáng)度一般在0.020.2之間。2指示劑 電泳過程中，常使用一種有顏色的標(biāo)記物以指示樣品的遷移過程。核酸電泳常用的指示劑有是溴酚

15、藍(lán)，溴酚藍(lán)呈藍(lán)紫色，分子量為670Da，在不同濃度凝膠中，遷移速度基本相同，它的分子篩效應(yīng)小，近似于自由電泳，故被普遍用作指示劑。在0.6，1，2的瓊脂糖凝膠中，溴酚藍(lán)的遷移率分別與1kb，0.6kb和0.15kb的雙鏈線性DNA片段大致相同。指示劑一般加在電泳上樣緩沖液中，為了使樣品能沉人膠孔，還要加入適量的蔗糖、聚蔗糖400或甘油以增加比重。3染色劑 核酸需經(jīng)過染色才能顯示出帶型，最常用的是溴乙錠染色法。溴乙錠(ethidium bromide，EB)是一種熒光染料，這種扁平分子可以嵌入核酸雙鏈的配對(duì)堿基之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光。EB-DNA復(fù)合物中的EB發(fā)出的熒光，比游離的凝膠

16、中的EB本身發(fā)出的熒光強(qiáng)大10倍，因此不需要洗凈背景就能清楚地觀察到核酸的電泳帶型。通常，可以在凝膠中加入終濃度為0.5gm1的EB，這樣在電泳過程中可以隨時(shí)觀察核酸的遷移情況，這種方法適用于一般性的核酸監(jiān)測。也可以在電泳結(jié)束后用0.5gm1的EB溶液染色10-15min后進(jìn)行紫外觀察，由于EB在可見光下易分解，故應(yīng)存棕色瓶中于4條件下保存。注意：EB有潛在的致癌危險(xiǎn)，操作時(shí)必須戴乳膠手套或一次性手套。GelRed-EB替代品(核酸凝膠染料)GelRed 和 GelGreen 是目前市場中最靈敏的凝膠核酸染料，使用 312nm 激發(fā)的 UV 凝膠成像系統(tǒng)時(shí)， GelRed 可以完美的替代 EB

17、 ；使用 254nm 激發(fā)的 UV 凝膠成像系統(tǒng)或可見光激發(fā)的凝膠觀察裝置時(shí)， GelGreen 足以替代任意一種 SYBR 染料）產(chǎn)品名稱：GelRed-EB替代品(核酸凝膠染料)英文名稱：GelRed Nucleic Acid Gel Stain, 10,000X產(chǎn)品規(guī)格：0.5ml產(chǎn)品貨號(hào)：41002產(chǎn)品價(jià)格：700.00產(chǎn)品產(chǎn)地：美國:產(chǎn)品說明:特性:高靈敏度GelRed 和 GelGreen 是目前市場中最靈敏的凝膠核酸染料穩(wěn)定性極好可以使用微波爐加熱，可以在室溫下保存更安全艾姆斯氏試驗(yàn)結(jié)果表明，該染料的誘變性遠(yuǎn)小于 溴化乙錠 （ EB ）廣泛的適應(yīng)性適用于預(yù)制凝膠和凝膠電泳后染色染

18、色過程簡單與 EB 一樣，在預(yù)制膠和電泳過程中不必?fù)?dān)心染料降解；而電泳后染色過程也只需 30 分鐘且無需脫色或沖洗對(duì) DNA 和 RNA 的遷移影響極小對(duì)核酸遷移的影響小于 SYBR Green I與標(biāo)準(zhǔn)凝膠成像系統(tǒng)以及可見光激發(fā)的凝膠觀察裝置完美兼容使用 312nm 激發(fā)的 UV 凝膠成像系統(tǒng)時(shí)， GelRed 可以完美的替代 EB ；使用 254nm 激發(fā)的 UV 凝膠成像系統(tǒng)或可見光激發(fā)的凝膠觀察裝置時(shí)， GelGreen 足以替代任意一種 SYBR 染料GelRed 和 GelGreen 無論用于預(yù)制凝膠染色還是凝膠電泳后染色，都表現(xiàn)出了極高的靈敏度。為配合 312 nm UV 凝膠成

19、像系統(tǒng)而設(shè)計(jì)的 GelRed ，在使用了我們新開發(fā)的具有專利的試驗(yàn)步驟后（該試驗(yàn)步驟中使用稀釋的 NaCl 溶液替代傳統(tǒng)的 TBE 緩沖溶液），在凝膠電泳后染色中優(yōu)于或者至少相當(dāng)于 SYBR Gold 。但與 SYBR Gold 不同， GelRed 在預(yù)制凝膠中使用時(shí)仍然有極高的靈敏度。我們新開發(fā)的 GelGreen 可以滿足使用 488 nm 激光凝膠掃描儀或者可見光激發(fā)的 Dark Reader 的研究人員的使用要求。 GelGreen 無論是在預(yù)制凝膠還是凝膠電泳后染色中都與 SYBR Green I 靈敏度相當(dāng)，但不存在后者的穩(wěn)定性問題。實(shí)際上， GelRed 和 GelGreen

20、，特別是 GelRed 非常穩(wěn)定，可以長期在室溫下保存。當(dāng)這兩種染料稀釋在 TBE 或者類似的電泳緩沖溶液中時(shí)甚至可以使用微波爐加熱，便于采用常規(guī)方法制備預(yù)制凝膠。含有染料的預(yù)制凝膠可以成批制備，長期保存。同樣重要的是， GelRed 和 GelGreen 相比 EB 或 SYBR Green I 提高了安全性。 獨(dú)立的測試服務(wù)公司（ Litron Laboratories, Inc. ）進(jìn)行的標(biāo)準(zhǔn)艾姆斯氏測試結(jié)果表明， 在 18.5 g /mL （該濃度遠(yuǎn)高于推薦用于電泳后染色的 約 4 g/mL 的 3X 染色液 ）濃度下， GelGreen 沒有誘變性，而 GelRed 也僅在 S9 代

21、謝活化時(shí)有微弱的誘變性。 GelRed 和 GelGreen 的特殊化學(xué)結(jié)構(gòu)使其難以穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，正是這一特性降低了染料的細(xì)胞毒性。如圖3。相反， SYBR Green I 廣泛地用于活細(xì)胞線粒體和核 DNA 染色，這正是由于它能快速的被細(xì)胞吞入。由于已知 SYBR Green I 對(duì)紫外線導(dǎo)致的突變有強(qiáng)烈的增強(qiáng)作用（ Ohta et al.Mutat. Res.492, 91(2001) ），因此它的高細(xì)胞膜透性使它在紫外環(huán)境觀察時(shí)成為凝膠染色的主要有害物質(zhì)。試劑：(1)質(zhì)粒pNTE-EGFP。(2)瓊脂糖。(3)10mgml溴乙錠溶液。(4)DNA分子量參照物（marker）。(5)

22、50TAE電泳緩沖液。(6)10溴酚藍(lán)上樣緩沖液。器材：(1)恒溫水浴(2)電泳槽(3)電泳儀(4)微波爐(5)紫外線檢測儀(6)移液器；100-1000l， 10-100l,0.5-10l實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：（操作步驟）電泳：(1)稱取1.0 g瓊脂糖，加入100ml 1TAE電泳緩沖液中。(2)加熱或沸水浴后使瓊脂糖溶解。(3)凝膠冷至60左右，加入溴乙錠至終濃度為0.5gm1。(4)將瓊脂糖溶液倒人模具，凝膠厚度一般為0.30.5cm，檢查有無氣泡。室溫下1530min后，瓊脂糖溶液完全凝固。(5)連接電泳槽與電泳儀之間的電源線，正極為紅色，負(fù)極為黑色。(6)取掉模具兩端的膠布，放入電泳槽，加樣孔

23、在負(fù)極端。(7)加入1TAE電泳緩沖液至電泳槽中，液面高于膠面1mm，小心取出梳子。(8)取5l實(shí)驗(yàn)一制備的質(zhì)粒DNA，在DNA樣品中加入110的上樣緩沖液并混勻。(9)用移液器將DNA樣品加入梳孔中。(10)接通電源，DNA樣品往正極移動(dòng)。電壓選擇為35Vcm。注意：長度以兩個(gè)電極之間的距離計(jì)算。(11)根據(jù)指示劑遷移的位置，判斷是否終止電泳；切斷電源后，含EB的凝膠可以直接于紫外線燈下觀察結(jié)果或拍照記錄。濃度和純度分析：1取10l DNA 用TE緩沖液稀釋至1ml，混勻。以無DNA的TE為空白，測定樣品在260nm和280nm波長下的光密度吸收值，每個(gè)樣品重復(fù)3次，取3次結(jié)果的平均值作為最

24、終結(jié)果。2換算出OD260/OD280的比值，較純的DNA，該值在1.6-1.8之間。3根據(jù)雙鏈DNA 1 OD260nm=50mg，計(jì)算出樣品DNA的濃度，計(jì)算公式為所測的OD260nm 50/10（mg/ml）附錄一、核酸換算數(shù)據(jù)dsDNA10kb=6.60106 Dalton1 OD260nm=50mgssDNA10kb=3.30106 Dalton1 OD260nm=40mgRNA10kb=3.45106 Dalton1 OD260nm=40mg附錄二、瓊脂糖凝膠濃度與線性DNA的最適分辨范圍瓊脂糖凝膠濃度線性DNA的最適分辨范圍（bp）0.5%0.7%1.0%1.2%1.5%2.0%

25、1，000-30,000800-12,000500-1,000400-7,000200-3,00050-2,000實(shí)驗(yàn)四 DEAE纖維素梯度層析實(shí)驗(yàn)（8課時(shí)） 1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求通過DEAE-纖維素陰離子交換劑，采用一條線型離子強(qiáng)度和恒定pH洗提曲線，對(duì)雞蛋白蛋白（CEA）樣品進(jìn)行分級(jí)分離，以了解梯度洗提的層析方法。2、實(shí)驗(yàn)原理DEAE-纖維素是以纖維素為母體接有二乙基氨基乙基（DEAE）活性基團(tuán)的弱堿性陰離 C2H5 子交換劑（纖維素-O-CH2-CH2-NH ）。它在離子交換層析中可用于蛋白質(zhì)、核酸、激素、 C2H5酶等大分子的分離與純化。對(duì)于某些組分比較復(fù)雜或性質(zhì)比較相近的蛋白質(zhì)樣品。在

26、采用一般的恒溶劑系統(tǒng)進(jìn)行離子交換柱層析時(shí)，往往不容易分離，這時(shí)可采用梯度洗提（裝置見圖1-2）。即利用一定的樣品離子在不同的離子強(qiáng)度（或pH）溶液中對(duì)一定的離子交換劑的平衡常數(shù)不同，在洗提過程中，通過不斷改變洗提的離子強(qiáng)度（pH不變）根據(jù)實(shí)驗(yàn)的具體情況，也可同時(shí)改變離子強(qiáng)度和pH，以逐步改變樣品中各組分與離子交換劑的交換能力，最后得到分離，這種層析方式即稱為梯度洗提層析。洗提劑的梯度產(chǎn)生如圖所示，當(dāng)A1=A2時(shí)，產(chǎn)生線形梯度；當(dāng)A1A2時(shí)，產(chǎn)生凹型梯度；當(dāng)A1A2時(shí)，產(chǎn)生凸型梯度（見圖1）。不同的樣品，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)情形，選擇合適的梯度洗提曲線。3、實(shí)驗(yàn)器材與裝置3-1、實(shí)驗(yàn)儀器（1）電腦及裝置（

27、2）紫外檢測儀（3）恒流泵（4）磁力攪拌器（5）混合器（5）梯度混合儀 （6）離心機(jī)3-2、實(shí)驗(yàn)器材（1）層析柱（201.0cm）（2）自動(dòng)取液器 （3）燒杯 100 ml （4）量筒 （5）玻棒3-3、實(shí)驗(yàn)裝置圖 （1）、 圖1： 梯度洗脫示意圖（2）、圖2：DEAE層析實(shí)驗(yàn)裝置圖4、試劑與配制4-1實(shí)驗(yàn)試劑（1）、DEAE-52 （2）、雞蛋白蛋白（CEA） （3）、三羧甲基氨基甲烷（Tris） （4）、鹽酸（5）、氯化鈉4-2試劑配制：（1）、Buffer A（20mM pH8.0 Tris-HCl ）的配制：取Tris6.057g，溶于900ml蒸餾水中，用0.92ml 濃HCl調(diào)至p

28、H8.0，用蒸餾水定容到lL。（2）、Buffer B的配制：Buffer A 50ml加NaCl(1.0M)2.9g。（3）：CEA樣液的配制：20.0mg CEA+1ml Buffer A5、方法與步驟：（1）、DEAE-纖維素處理：本實(shí)驗(yàn)采用20 mMol/L ,pH8.0 Tris-HCl平衡好的DEAE-纖維素。*新DEAE-纖維素的處理詳見實(shí)驗(yàn)后注。（2）、裝柱：將處理好的DEAE-纖維素置于燒杯中，并加有約1倍體積的Buffer A，用玻棒攪勻，隨即緩緩倒入垂直架好并底端出口關(guān)閉的層析中，靜置約5分鐘，打開底端出口，或吸取過多上清液，繼續(xù)添加纖維素懸液，直至沉積高度為8.0-10

29、.0cm。在裝柱中要防止柱床流干。柱裝好后，應(yīng)無節(jié)痕，氣泡，斑紋，界面平整。（3）、平衡：柱裝好后，接上調(diào)好流速的恒流泵。用Buffer A以0.6-0.8ml/min流速，平衡30分鐘既可。（4）、梯度混合儀的調(diào)試：先將梯度混合儀左面容器，倒入60 ml Buffer B后，置于電攪拌器上，并在燒杯內(nèi)放入電磁攪棒子。將另一只100ml燒杯，倒入60 ml Buffer B后，置于電磁攪拌器一側(cè)的升降臺(tái)上，調(diào)節(jié)升降臺(tái)使兩燒杯底面和液面均水平。 將一根兩端接有玻璃管的橡皮管（連通管）內(nèi)盛滿Buffer A，并在管中央用十字夾夾緊后，一端插入盛有Buffer A的燒杯中，另一端插入盛有Buffer

30、 B的燒杯中（均插到最底部），用膠布使管子固定在燒杯一側(cè)（管內(nèi)與管口不得留有氣泡），所有裝置裝好后，不得再移動(dòng)，以防破壞水平面。（5）、加樣：加樣前（最好在平衡結(jié)束或加樣前5-10分鐘）先啟動(dòng)已調(diào)試完畢的色譜工作站，如：電腦、紫外檢測儀和恒流泵（除梯度洗提裝置外）等裝置，使整個(gè)裝置處于工作狀態(tài)，然后使柱內(nèi)液面降至床表面，吸取1.0ml樣液沿管壁小心加入柱內(nèi)，慢慢打開底端出口，使樣液緩緩進(jìn)入柱床體內(nèi)，等液面降至床表面時(shí)，再吸取少量Buffer A，洗滌柱內(nèi)壁2-3次，每次洗滌均需將液面降至床表面，并防止沖壞床表面，最后將溶液加至3cm高。（6）、洗滌：層析柱接上恒流泵，用Buffer A以0.6

31、-0.8ml/min流速，洗滌（當(dāng)出現(xiàn)第一個(gè)穿過峰并回到基線后5-10分鐘后）15分鐘方可。（7）、洗脫：將恒流泵進(jìn)口端與梯度洗脫裝置盛有Buffer A的容器底部出口相連接，然后打開層析柱底部出口，最后打開恒流泵上的開關(guān)，以調(diào)好的0.8ml/min流速和方向進(jìn)行梯度洗提層析。在洗提中，隨著Buffer A的容器中洗提液的減少，液面將下降，此時(shí)Buffer B的容器中溶液將由連通管虹吸到Buffer A的中來，以不斷地補(bǔ)充和趨向平衡并且迅速攪勻，這樣就產(chǎn)生了一種濃度以梯度形式不斷增加的洗提曲線進(jìn)行梯度洗提層析。待樣液最后一個(gè)峰已回到基線時(shí)，繼續(xù)洗脫10分鐘，結(jié)束層析。（8）、保存和打印結(jié)果：層

32、析完畢，將結(jié)果保存到老師要求的文件夾中和打印出結(jié)果報(bào)告（結(jié)果見圖1），并給出結(jié)論性的結(jié)果。（9）、結(jié)束實(shí)驗(yàn)：最后移去層析柱，回收柱內(nèi)的DEAE，清洗層析柱，同時(shí)用恒流泵輸送蒸餾水清洗所有與紫外檢測儀相連的管道10分鐘。并將所有器皿也清洗干凈，結(jié)束實(shí)驗(yàn)。6、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：（1）、層析分離結(jié)果圖圖1.DEAE柱層析分離純化CEA洗脫曲線圖（2）、結(jié)論實(shí)驗(yàn)五 蛋白質(zhì)的水解和氨基酸的紙層析法分離（8課時(shí)）一、目的1學(xué)習(xí)水解蛋白質(zhì)的方法。2掌握紙層析的基本技術(shù)。3學(xué)習(xí)用紙層析分離、鑒定氨基酸的方法。二、原理1蛋白質(zhì)的水解蛋白質(zhì)可以用酸、堿或酶如胃蛋白酶，胰蛋白酶，糜蛋白酶水解成最終產(chǎn)物氨基酸。實(shí)驗(yàn)室中常使用

33、酸解法水解蛋白質(zhì)。當(dāng)在6 mol，鹽酸溶液中將蛋白質(zhì)在110t加熱大約20 h，肽鍵斷裂，此時(shí)蛋白質(zhì)完全分解為氨基酸。 酸法水解蛋白質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)是在水解過程中不發(fā)生外消旋作用，所得到的氨基酸均為L一氨基酸。大多數(shù)氨基酸在煮沸酸中是穩(wěn)定的，但色氨酸則完全被破壞。絲氨酸和蘇氨酸在酸解過程中或多或少地也有破壞。色氨酸的水解產(chǎn)物已知是一種棕黑色的物質(zhì)腐黑質(zhì)，因此，用酸法水解蛋白質(zhì)得到的水解液為棕黑色的。2紙層析法分離氨基酸紙層析是以濾紙作為支持物的分配層析法。它利用不同物質(zhì)在同一推動(dòng)劑中具有不同的分配系數(shù)，經(jīng)層析而達(dá)到分離的目的。在一定條件下，一種物質(zhì)在某溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)是一個(gè)常數(shù)，若以K表示分配系數(shù)

34、 層析溶劑（又稱推動(dòng)劑），是選用有機(jī)溶劑和水組成的。濾紙纖維素與水有較強(qiáng)的親和力（纖維素分子的葡萄糖基上的-OH基與水通過氫鍵相作用）能吸附很多水分，一般達(dá)濾紙重的22左右（其中約有6的水與纖維素結(jié)合成復(fù)合物），由于這部分水?dāng)U散作用降低形成固定相；而推動(dòng)劑中的有機(jī)溶劑與濾紙的親和力很弱，可在濾紙的毛細(xì)管中自由流動(dòng)，形成流動(dòng)相。層析時(shí)，點(diǎn)有樣品的濾紙一端浸入推動(dòng)劑中，有機(jī)溶劑連續(xù)不斷地通過點(diǎn)有樣品的原點(diǎn)處，使其上的溶質(zhì)依據(jù)本身的分配系數(shù)在兩相間進(jìn)行分配。隨著有機(jī)溶劑不斷向前移動(dòng)，溶質(zhì)被攜帶到新的無溶質(zhì)區(qū)并繼續(xù)在兩相間發(fā)生可逆的重新分配，同時(shí)溶質(zhì)離開原點(diǎn)不斷向前移動(dòng)，溶質(zhì)中各組分的分配系數(shù)不同，前

35、進(jìn)中出現(xiàn)了移動(dòng)速率差異，通過一定時(shí)間的層析，不同組分便實(shí)現(xiàn)了分離。物質(zhì)的移動(dòng)速率以Rf值表示： 各種化合物在恒定條件下，層析后都有其一定的Rf值，借此可以達(dá)到定性、鑒別的目的。溶質(zhì)的結(jié)構(gòu)與極性、溶劑系統(tǒng)的物質(zhì)組成與比例、pH值、濾紙的質(zhì)地以及層析的溫度、時(shí)間等都會(huì)影響Rf值。三、儀器試劑和材料1儀器 （1）干燥箱 （2）水浴鍋 （3）安培瓶 （4）層析缸 （5）吹風(fēng)機(jī) （6）噴霧器2試劑 （1）6molL HCl （2）標(biāo)準(zhǔn)氨基酸（lmgmL）：稱取亮氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、纈氨酸、組氨酸各lmg，分別溶于lml 0.01molL的HCl溶液中，保存于冰箱 （3）酸性展層劑：正丁醇：88甲酸：水15：3：2（VV）（臨用前配制以免酯化）堿性展開劑：正丁醇：12%氨水：95%乙醇=13：3：3（VV） （4）0.5的茚三酮丙酮溶液 （5）10異丙醇溶液3材料 （1）層析濾紙（10cm 10cm），普通濾紙（21cm 21cm） （2）毛細(xì)管、培養(yǎng)皿、鑷子四、操作步驟1蛋白質(zhì)的水解稱取0.2g酵母粉，放進(jìn)一個(gè)小安培瓶中，向瓶中加入l ml 6molL的鹽酸，于噴燈火焰上封口。將安培瓶放入干燥箱內(nèi)，在110下水解20 h后，把安培瓶內(nèi)的水解液倒進(jìn)蒸發(fā)皿內(nèi)，將蒸發(fā)皿放于沸水浴上加熱