海洋生物技術(shù)復(fù)習(xí)題

1、一、 名詞解釋1. 全魚基因（五-43）轉(zhuǎn)基因魚的基因元件包括啟動子和編碼序列都來自魚類，可以是異種魚。2. 多倍體：就是指體細(xì)胞中含有三個或三個以上染色體組的個體。3.基因工程：是指一種或多種生物（供體）的基因的載體在體外進(jìn)行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體內(nèi)，是指按照人們的意愿遺傳并表達(dá)出新的性狀。4.細(xì)胞核移植：利用顯微操作技術(shù)將一個細(xì)胞的細(xì)胞核一直到另一個細(xì)胞中，或者將兩個細(xì)胞的細(xì)胞核（或細(xì)胞質(zhì)）進(jìn)行交換從而可能創(chuàng)造無性雜交生物新品種的一項(xiàng)技術(shù)。5.聚合酶鏈反應(yīng)：是一種在體外利用酶促反應(yīng)大量獲得特異序列的基因組DNA或cDNA的專門技術(shù)，又稱為無細(xì)胞的分子克隆。6.Gynogenesis

2、：是指卵子在精子的刺激下，依靠自身的細(xì)胞核發(fā)育成只具有母系遺傳物質(zhì)的個體的一種有性生殖方式。7.Physiological sex：指兩性在生理方面的差異。是指男女的自然性別，是用生物標(biāo)準(zhǔn)來確定的男性和女性，這種生物標(biāo)準(zhǔn)包括生理結(jié)構(gòu)和解剖結(jié)構(gòu)。生理結(jié)構(gòu)主要是指性染色體的差異，解剖結(jié)構(gòu)主要是指性器官的差異。8.Sex reversal：魚類在生長過程中，在一定條件下，性腺結(jié)構(gòu)發(fā)生了極大的變化，原有的性腺成分被相反性別成分逐漸所取代，導(dǎo)致魚類性別的轉(zhuǎn)化，這種性別的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象稱為性逆轉(zhuǎn)。9.Clone：是指生物體通過體細(xì)胞進(jìn)行的無性繁殖，以及由無性繁殖形成的基因型完全相同的后代個體組成的種群。通常是利

3、用生物技術(shù)由無性生殖產(chǎn)生與原個體有完全相同基因的個體或種群。10.Hertwig effect：用射線照射后的蛙精子與卵子受精后，蛙胚胎的成活率隨著照射劑量的升高而下降，但達(dá)到一定劑量后，蛙胚的成活率反而隨照射劑量的升高而逐步上升。二、簡答題1、天然雌核發(fā)育魚類的鑒別。人工繁殖，仔魚沒有父本特征；滅活精子人工受精，仔魚不出現(xiàn)“單倍體綜合癥”；受精卵的細(xì)胞學(xué)觀察，精核不解凝；視泡期胚胎腦部形態(tài)觀察，單倍體腦部呈S型畸形；紅細(xì)胞大小，天然雌核發(fā)育魚類多為三倍體；肝臟及肝細(xì)胞大小，天然雌核發(fā)育魚肝臟、肝細(xì)胞大；體細(xì)胞染色體記數(shù)，天然雌核發(fā)育魚類染色體多為150±；側(cè)線鱗的數(shù)目，雌核發(fā)育銀鯽

4、側(cè)線鱗為30.4-31.11，普通鯽魚為28.65-29.22。2、產(chǎn)生不育魚的方法。（1）雜交屬間雜交：鮭鱒魚類的雜交試驗(yàn)是做得最多而又最富于成效的。通過遠(yuǎn)緣雜交生產(chǎn)具有生長優(yōu)勢而又不育的雜種是當(dāng)前魚類雜種優(yōu)勢利用的一個重要方面。亞科間雜交：雜種如草魚與團(tuán)頭魴的雜種，其性腺也是不育的。（2）激素閹割不同濃度的甲基睪酮對魚類具有不同的生物學(xué)效應(yīng)，低劑量（15×10-6）促進(jìn)金魚和鯉魚生長，中劑量（1050×10-6）可以導(dǎo)致金魚或羅非魚等由雌性轉(zhuǎn)變?yōu)樾坌裕邉┝?100×10-6以上) 對遺傳性莫桑比克羅非魚產(chǎn)生雌性化效應(yīng)，對兩種性別的青鳉產(chǎn)生雄激素閹割。較高劑量

5、類固醇激素確實(shí)可以抑制性腺發(fā)育，因此可能是誘導(dǎo)不育魚最有希望的方法之一。（3）人工誘導(dǎo)三倍體原理：三倍體魚類性腺不發(fā)育,不能繁殖后代，這樣可以把本來用于性腺發(fā)育的能量全部用于身體生長，提高飼料轉(zhuǎn)化系數(shù)，從而增加產(chǎn)量。 缺點(diǎn)：三倍體出現(xiàn)頻率低、仔幼魚存活率差以及結(jié)果不穩(wěn)定等問題，一時(shí)尚達(dá)不到商品化生產(chǎn)的規(guī)模。 優(yōu)點(diǎn)：人工誘導(dǎo)三倍體，方法簡單，操作容易，且除靜水壓處理外，并不需要專門設(shè)備。食用三倍體魚對人體也沒有什么不良影響。（4）自身免疫閹割注射精巢提取液于未成熟雄魚可促使毀滅魚類自身性腺的抗體產(chǎn)生。（5）外科手術(shù)閹割采取外科手術(shù)，摘除性腺，終止原來的生理性別，由于這種方法既浪費(fèi)錢，又不易掌握，

6、因此也就很難應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐了。3、研究魚類性別控制的意義。（1）提高群體生長率對于雌、雄魚生長速度不一樣的魚類，通過性別控制，實(shí)行單性養(yǎng)殖將會提高產(chǎn)量，降低成本，獲得良好的經(jīng)濟(jì)效益。例如鯉、鯽、草、鱘、鮭鱒魚類是雌魚生長快于雄魚，故雌魚的商品價(jià)值較高，而非鯽則是雄魚生長快于雌魚，一般3個月后雄魚比雌魚重1倍，故全雄魚的生產(chǎn)有更大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。（2）控制繁殖速度對于性成熟周期短，繁殖力強(qiáng)的魚類，可通過單性養(yǎng)殖控制其過度繁殖，避免幼魚與商品魚爭奪餌料和空間。如非鯽3-4個月性成熟，一年可產(chǎn)卵4-8次，在池塘養(yǎng)殖中往往造成繁殖過剩，抑制了整個群體的生長，降低了商品質(zhì)量。（3）延長有效生長期對于性周期較

7、短，雌、雄性成熟年齡不同的魚類，單性養(yǎng)殖可延長有效生長期，避免因性腺的發(fā)育而降低生長速度。如虹鱒雄魚一般二齡成熟，雌魚一般三齡成熟，一般飼養(yǎng)兩年可達(dá)到商品規(guī)格(約0.5公斤)，若能養(yǎng)殖全雌魚或能使雄性虹鱒轉(zhuǎn)化為雌性，即可延長有效生長期，達(dá)到大幅度增產(chǎn)的目的。4、Northern雜交法。DNA印跡技術(shù)由Southern于1975年創(chuàng)建，稱為Southern印跡技術(shù)。RNA印跡技術(shù)正好與DNA相對應(yīng)，故被稱為Northern印跡雜交，與此原理相似的蛋白質(zhì)印跡技術(shù)則被稱為western blotting。Northern印跡雜交的RNA吸印與Southern印跡雜交的DNA吸印方法類似，只是在進(jìn)樣前

8、用甲基氧化汞、乙二醛或甲醛使RNA變性，而不用NaOH，因?yàn)樗鼤釸NA的2-羥基基團(tuán)。RNA變性后有利于在轉(zhuǎn)印過程中與硝酸纖維素膜結(jié)合，它同樣可在高鹽中進(jìn)行轉(zhuǎn)印，但在烘烤前與膜結(jié)合得并不牢固，所以在轉(zhuǎn)印后不能用低鹽緩沖液洗膜，否則RNA會被洗脫。在膠中不能加EB，因它為影響RNA與硝酸纖維素膜的結(jié)合，為測定片段大小，可在同一塊膠上加標(biāo)記物一同電泳，之后將標(biāo)記物膠切下，上色、照相。樣品膠則進(jìn)行Northern轉(zhuǎn)印，標(biāo)記物膠上色的方法是在暗室中將其浸在含5g/ml EB的0.1mol/L醋酸銨中10min，在水中就可脫色。在紫外光下用一次成像相機(jī)拍照時(shí)，上色的RNA膠要盡可能少接觸紫外光，若接

9、觸太多或白熾燈下暴露過久，會使RNA信號降低。從瓊脂糖凝膠中分離功能完整的mRNA時(shí)，甲基氫氧化汞是一種強(qiáng)力、可逆變性劑，但是有毒，因而許多人喜用甲醛作為變性劑。所有操作均應(yīng)避免RNase的污染。5、Southern雜交法。Southern印跡雜交（Southern blot）是研究DNA圖譜的基本技術(shù)，在遺傳病診斷、DNA圖譜分析及PCR產(chǎn)物分析等方面有重要價(jià)值。Southern印跡雜交的基本方法是將DNA標(biāo)本用限制性內(nèi)切酶消化后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離各酶解片段，然后經(jīng)堿變性，Tris緩沖液中和和高鹽下通過毛吸作用將DNA從凝膠中轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上、烘干固定后即可用于雜交。凝膠中DNA片段

10、的相對位置在DNA片段轉(zhuǎn)移到濾膜的過程中繼續(xù)保持著，附著在濾膜上的DNA與32P標(biāo)記的探針雜交，利用放射自顯影術(shù)確立探針互補(bǔ)的每一條DNA帶的位置，從而可以確定在眾多消化產(chǎn)物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。6、哺乳動物克隆(細(xì)胞核移植)操作方法。核移植克隆哺乳動物的技術(shù)操作過程主要包括核受體和核供體的處理和制備、核移植、重組胚的體外或體內(nèi)培養(yǎng)、核移植胚胎移入代孕母畜（寄母）等步驟 。（1）核受體細(xì)胞的準(zhǔn)備受體細(xì)胞的種類：卵母細(xì)胞、受精卵、2-細(xì)胞胚胎。其中卵母細(xì)胞最為普遍。這是因?yàn)樵诼涯讣?xì)胞的細(xì)胞質(zhì)含有某種特定的因子，可以使移植核中所含有的基因表達(dá)程序發(fā)生重新排列，使已經(jīng)分化了的細(xì)胞

11、重新回到發(fā)育過程的原點(diǎn)，同受精卵一樣開始個體發(fā)育過程。去核方法 A.透明帶切開法(兩步法) B.盲吸法目前普遍使用的方法 C.半卵法 D.離心去核法（2）核供體細(xì)胞的準(zhǔn)備 細(xì)胞核供體細(xì)胞首先必須是完整的二倍體，該細(xì)胞必須保持有供體動物完整的基因組；其次，供體細(xì)胞核必須能夠在受體細(xì)胞質(zhì)的作用下，產(chǎn)生細(xì)胞分化過程的倒轉(zhuǎn)，變得如同剛剛受精的合子一樣，能重新完成從受精到發(fā)育成一個正常動物個體的全過程。（3）細(xì)胞核移植 常用的核移植方法有兩種，即胞質(zhì)內(nèi)注射和透明帶下注射。胞質(zhì)內(nèi)注射是用一個外徑58m 的注核針吸取供體核后直接注射進(jìn)卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的方法。透明帶下注射則是把供體細(xì)胞核注射在透明帶與卵母細(xì)胞之

12、間的卵周隙中，核移植后用電刺激進(jìn)行細(xì)胞融合。（4）融合和激活經(jīng)核移植操作的卵子需進(jìn)行融合處理使供體核進(jìn)入到受體細(xì)胞質(zhì)中，形成重構(gòu)卵，融合方式有病毒融合，化學(xué)融合以及廣為使用的電融合。有的核移植重構(gòu)卵(如小鼠、大鼠和牛等)還需要進(jìn)一步充分的激活才能發(fā)育，激活就是模仿受精過程中精子的刺激作用，使卵母細(xì)胞從MII期中解放出來，并轉(zhuǎn)到“受精”的狀態(tài)。目前，激活的方式主要有：電激活和化學(xué)激活。（5）重組胚的體內(nèi)或體外培養(yǎng) 經(jīng)融合和激活的重組胚移入中間受體作體內(nèi)或體外培養(yǎng)，觀察重組胚的發(fā)育率。（6）胚胎移植 重組克隆胚胎移植的受體母畜要選擇皮毛顏色與供體品種不同、繁殖性能強(qiáng)、體格稍大的當(dāng)?shù)仄贩N，進(jìn)行同期發(fā)

13、情處理，按常規(guī)方法移植代孕母畜（寄母）的子宮中，待其發(fā)育到產(chǎn)仔。7、魚類性別決定模式有幾種？1) 染色體決定一對染色體（通常稱為異染色體或性染色體）上集中了絕大多是與性別有關(guān)的基因。2) 多基因決定性別決定基因存在于染色體上，胚胎的性別是染色體上雄性和雌性因子相互作用的結(jié)果。3) 基因型-環(huán)境共同決定性別決定受遺傳和環(huán)境因子雙重控制。影響魚類的性別決定的環(huán)境因素包括發(fā)育早期的溫度、鹽度、光照、水質(zhì)、溫度、PH值、密度、食物豐富度、群體結(jié)構(gòu)合個體間相互作用。8、鑒定多倍體魚類的方法由于處理并不是百分之百成功，而且處理過的群體中也可能是由多倍體、二倍體或嵌合體等混合組成，因此采用一個準(zhǔn)確而又簡便的

14、方法來確定其染色體的倍性就顯得格外重要。多倍體魚可以用間接法（如核體積測量、蛋白質(zhì)電泳、生化分析以及形態(tài)學(xué)檢查等）和直接法（如染色體計(jì)數(shù)以及DNA含量測定等）加以鑒別。核體積測量（1）紅細(xì)胞核體積測量按照一般規(guī)律，細(xì)胞核大小與染色體數(shù)目成正比例增加，而且為了維持恒定的核質(zhì)比率，隨著細(xì)胞核的增大，細(xì)胞大小也按比例增加。紅細(xì)胞核體積: 二倍體與三倍體之比1:1.5；紅細(xì)胞核面積: 二倍體與三倍體之比1:1.3。（2）蛋白質(zhì)電泳蛋白質(zhì)電泳也可用來鑒別多倍體魚類。Balsano等（1972）用血清蛋白電泳圖譜差異來辨別二倍體與三倍體亞馬遜花鳉（Poecilia formosa）?？墒牵瑒⑿忝?/p>

15、等（1978）發(fā)現(xiàn)二倍體與三倍體關(guān)東系銀鯽（Cauratus langsdorfii）在血清蛋白上并沒有明顯的差異，她們用各種蛋白質(zhì)或酶，如血紅蛋白、肌漿蛋白、乳酸脫氫酶（LDH）、葡萄糖磷酸變位酶（PGM）以及磷酸葡萄糖異構(gòu)酶（PGI）等進(jìn)行反復(fù)電泳分析，最后找出肌肉肌漿蛋白（myogen）和肌酸激酶（creaine kinase）是鑒二倍體與三倍體關(guān)東系銀鯽的最好標(biāo)記。 （3）化學(xué)分析Sesaki對關(guān)東系銀鯽二倍體與三倍體種群的肌肉與血液的化學(xué)組成進(jìn)行了生化分析。發(fā)現(xiàn)兩者肌肉的基本組成及蛋白質(zhì)組成大體上一致，但三倍體具有較少的紅細(xì)胞數(shù)量、較高的平均紅細(xì)胞體積與

16、平均紅細(xì)胞血紅蛋白?？墒牵瑑烧哐t蛋白，血細(xì)胞比容以及紅細(xì)胞的丙酮酸激酶與磷酸果糖激酶的活性，三倍體也略高與二倍體，其比率分別為1·26和1·35（4）形態(tài)學(xué)分析總的來說，三倍體與二倍體魚類在形態(tài)上并沒有什么差別，即使有差別也是不甚明顯。例如，三倍體棘刺魚與二倍體比較，僅軀干較短和尾部較長而已，可是在某些情況下，由于雙親基因劑量的差別，三倍體雜種可此較容易的與二倍體雜種相區(qū)別。Beck（貝克）等用形態(tài)學(xué)分析方法測定了二倍體和三倍體草魚與鳙雜種的26個形態(tài)與數(shù)量性狀，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中的12個性狀可以用來鑒別二倍體和三倍體，可靠程度為97%，但單個性狀不能作為鑒別染色體倍性的指標(biāo)。

17、總之，到目前為止，還沒有憑一兩個形狀就可以簡單而又準(zhǔn)確地用來鑒別多倍體魚類。（5）染色體計(jì)數(shù)染色體計(jì)數(shù)是鑒定魚類多倍體的最準(zhǔn)確的方法，但比較費(fèi)時(shí)。目前染色、體標(biāo)本的制備主要有細(xì)胞培養(yǎng)法，包括血液培養(yǎng)，腎細(xì)胞培養(yǎng)，鱗片培養(yǎng)，鰭培養(yǎng)以及胚胎培養(yǎng)等。（6）DNA含量測定細(xì)胞核內(nèi)DNA含量是相當(dāng)恒定的，即不同種類生物的細(xì)胞核內(nèi)DNA含量盡管相差很大，但在同一種生物內(nèi)，各種不同組織的細(xì)胞，不論他們的結(jié)構(gòu)與功能有多大的差異，其細(xì)胞內(nèi)的DNA含量基本是相同的，而且生殖細(xì)胞DNA含量恰是體細(xì)胞的1|2。可以通過細(xì)胞核內(nèi)的DNA含量準(zhǔn)確的確定其染色體倍性。在魚類目前有兩種測定細(xì)胞內(nèi)DNA含量的方法：顯微光密度測

18、定法，流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法。9、雄核發(fā)育的應(yīng)用（1）性別決定機(jī)制的判定a) 雄核發(fā)育的后代其性別決定完全由精子的性染色體控制。b) 雄配子異型的魚類: X、Y兩種精子的雄核發(fā)育后代，雌魚(XX) 和超雄魚(YY) 的比例應(yīng)為11。c) 雄配子同型的魚類:其雄核發(fā)育后代只有單一的雄魚(ZZ) 存在。這樣可通過后代的雌雄個體出現(xiàn)率來判別該種魚類的性別決定機(jī)制。（2）建立純系人工雄核發(fā)育后代的遺傳物質(zhì)完全來源于父本，各基因座均處于純合狀態(tài)，一次即達(dá)到建立純系的目的。（3）保種、選種和育種由于冷藏精子是一項(xiàng)十分成熟的技術(shù), 對諸如中華鱘、長江鱘等瀕危動物, 通過冷藏精子與滅活的親緣關(guān)系較近的卵子“授精”，可

19、以在若干年后獲得該物種的恢復(fù)。雄核發(fā)育可用于遺傳分析，檢測隱性基因，可以研究外界因素對遺傳型或表型的影響等。因此雄核發(fā)育將成為未來研究單性發(fā)育的重要技術(shù)之一。（4）提供優(yōu)良品種人工雄核發(fā)育目前還沒有在商業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用，只有生產(chǎn)上初步利用的例子（雄核發(fā)育異核銀鯽）。10、魚類性別的人工控制方法（1）人工挑選法在魚苗生長到出現(xiàn)明顯的性別特征時(shí)用肉眼鑒定性別，人工選出所需魚苗進(jìn)行養(yǎng)殖。此方法的勞動強(qiáng)度大，對工作人員的熟練程度高，但準(zhǔn)確率極高。（2）人工控制發(fā)育溫度通過人為控制溫度，實(shí)現(xiàn)性逆轉(zhuǎn)。（3）種間雜交通過種間雜交以獲得單一性別的群體進(jìn)行單性養(yǎng)殖，這種方法主要集中在羅非魚屬內(nèi)，是目前國內(nèi)外產(chǎn)生雄性

20、或大部分雌性羅非魚的最廣泛采用的一種方法。（4）性激素人工誘導(dǎo)處理魚類的性別可以用類固醇激素加以控制。類固醇激素是各種生殖現(xiàn)象的誘導(dǎo)者，首先被誘導(dǎo)的是性腺分化，然后通過性腺的活動使魚體的外部形態(tài)、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、生理性狀和生態(tài)行為等才能得到表達(dá)。但類固醇激素只能改變魚類的生理性別，而不能改變魚類的遺傳性別，即它所能改變的只是生理表型，而不是基因型。（5）三系配套技術(shù)三系配套技術(shù)是應(yīng)用性逆轉(zhuǎn)與雜交相結(jié)合的方法發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù)?；驹恚呼~類的性別由性染色體決定，性逆轉(zhuǎn)f的魚其生理性別與性染色體（遺傳性別）決定是相反的，就是說性反轉(zhuǎn)的魚，其性別的生理功能改變了，但遺傳基礎(chǔ)并不改變，這種魚所產(chǎn)生的后代

21、仍由染色體組成來決定。三系：原系：自然群體中未經(jīng)性反轉(zhuǎn)的雌雄魚，XX、XY；轉(zhuǎn)化系：遺傳型雄魚用雌激素誘導(dǎo)性轉(zhuǎn)化后的表型雌魚，即雌性化雄魚，以XY表示；雄性純合系：通過原系XY與轉(zhuǎn)化系XY交配所獲得的YY型雄魚，或稱超雄魚，用YY表示。（6）人工雌核發(fā)育人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育，就是用經(jīng)!射線或紫外線照射的遺傳上失活的精子進(jìn)入未受精的卵內(nèi)，從而激活卵子在雌核控制下進(jìn)行發(fā)育。對于#$#%型性染色體的魚類來說，產(chǎn)生全部雌性的后代。這些后代的性狀純屬母系遺傳，基因型是高度純合的。（7）人工誘導(dǎo)雄核發(fā)育人工誘導(dǎo)雄核發(fā)育可以通過使用紫外線、X射線、伽馬射線等物理方法處理的卵子，使其失活后參與受精，再在適當(dāng)時(shí)間通

22、過冷、熱、高壓等處理使精核的染色體加倍，進(jìn)而發(fā)育成為完全是父本性狀的個體。（8）人工誘導(dǎo)三倍體人工誘導(dǎo)的三倍體方法很多，一般有種間雜交、物理、化學(xué)第三大類，其中最常用有效而方便的方法是溫度休克和靜水壓處理。其個體具有正常的生活力，但功能上是不育的。因?yàn)槠鏀?shù)染色體組將導(dǎo)致減數(shù)分裂的瓦解及性腺發(fā)育的衰退，或非整倍數(shù)配子的產(chǎn)生。（9）自身免疫閹割用某種魚的精卵巢組織液作抗原物質(zhì)，注射到同種異體幼魚體內(nèi)，使幼體內(nèi)產(chǎn)生抗體，抑制其性腺發(fā)育，產(chǎn)生自身免疫閹割現(xiàn)象，從而產(chǎn)生中性不育魚。這一技術(shù)已在鮭鱒魚類獲得初步成功。（10）外科手術(shù)閹割采取外科手術(shù)，摘除性腺，終止原來的生理性別，產(chǎn)生中性不育魚，并誘導(dǎo)產(chǎn)生

23、性逆轉(zhuǎn)。由于這種方法既費(fèi)時(shí)又費(fèi)錢，又不易掌握。因而也就很難應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐了。（11）其它方法除了上述方法外，還可用電離輻射和化學(xué)絕育等方法產(chǎn)生中性不育魚。轉(zhuǎn)基因技術(shù)用于魚類性別控制的研究也已開始起步，但離應(yīng)用于生產(chǎn)尚有一定的距離。11、轉(zhuǎn)基因魚的構(gòu)建（1）目的基因的獲取目的基因指編碼特定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因，它的表達(dá)能使轉(zhuǎn)基因水產(chǎn)動物產(chǎn)生新的表型。選擇目的基因的原則：改變受體的代謝特征和改變受體對環(huán)境適應(yīng)能力。常用目的基因有：生長激素基因(GH)，增強(qiáng)抗逆性的基因和報(bào)告基因。目的基因獲取方法：a) 從基因文庫中獲取目的基因；b) 利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因；c) 通過DNA合成儀用化學(xué)方法直接合成

24、。（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建獲得的基因必須克隆到質(zhì)?；蚴删w中，并在合適的菌株中擴(kuò)增。提取這種重組質(zhì)粒或噬菌體DNA，用合適的限制性內(nèi)切酶酶切，分離出插入載體的外源基因。（3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞在魚類繁殖季節(jié)，選取成熟的雌、雄魚，注射垂體或激素催產(chǎn)，分別收集精液和卵子，干法授精。受精卵去膜，將裸卵移至Holtfreter溶液中，選取質(zhì)好的裸卵移至手術(shù)杯中進(jìn)行基因?qū)搿ｏ@微注射法是目前最常用和比較有效的基因?qū)?方法，在顯微鏡下，借助顯微操作器，將幾微米玻璃注射針插入受精卵原核或核附近的細(xì)胞質(zhì)中，注入一定量的外源基因。此外，還有電穿孔法、精子載體法、基因槍法和脂質(zhì)體融合法等。注射后魚卵的處理：必須保留與注射DNA的魚卵同一批次的魚卵作為對照，觀察魚卵的受精率、孵化率及幼魚的成活率。幼魚孵出后，提取部分幼魚DNA作基因整合率的檢測，同時(shí)留大部分幼魚繼續(xù)培養(yǎng)。區(qū)別完全