長(zhǎng)春堿的提純及其衍生物合成研究進(jìn)展

1、上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院研究生課程（論文類(lèi)）試卷2 015 /2 016 學(xué)年第 一 學(xué)期課程名稱： 高等天然產(chǎn)物化學(xué) 課程代碼： NX0702013 論文題目： 長(zhǎng)春堿的提純及其衍生物合成研究進(jìn)展 學(xué)生姓名： 孫貴救 專業(yè)學(xué)號(hào)： 制藥工程 156061423 學(xué)院： 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院 課程（論文）成績(jī)：課程（論文）評(píng)分依據(jù)（必填）：1. 論文結(jié)構(gòu)規(guī)范，檢索的文獻(xiàn)資料經(jīng)認(rèn)真的綜合分析整理，選材精簡(jiǎn)得當(dāng)，條理清晰，語(yǔ)言流暢，版面整潔美觀。得分為90-100分。2. 論文結(jié)構(gòu)較規(guī)范，檢索的文獻(xiàn)資料經(jīng)分析整理，材料組織得當(dāng)，條理清晰，語(yǔ)言流暢。得分為80-89分。3. 論文結(jié)構(gòu)基本規(guī)范，內(nèi)容有小問(wèn)題，檢索

2、的文獻(xiàn)資料經(jīng)一般性分類(lèi)整理，條理較清晰，得分為70-79分。4. 論文結(jié)構(gòu)基本規(guī)范，內(nèi)容未經(jīng)認(rèn)真整理，一般性羅列所檢索的文獻(xiàn)資料。得分為60-69分。5. 達(dá)不到上述第4點(diǎn)要求的論文，得分為0-59分。任課教師簽字： 日期： 年 月 日長(zhǎng)春堿的提純及其衍生物合成研究進(jìn)展學(xué)生：孫貴救 （教師：肖繁花）（上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院）摘 要：利用溶劑法提取長(zhǎng)春堿,并通過(guò)柱色譜法進(jìn)一步純化長(zhǎng)春堿,采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化其工藝,通過(guò)紫外分光光度法檢測(cè)其相對(duì)含量,結(jié)果顯示利用溶劑法提取的長(zhǎng)春花生物堿含量高,效果好。關(guān)鍵詞：長(zhǎng)春堿；提取；純化；柱色譜法Studies on the extraction

3、purification and derivatives synthesis of VinblastineStudent: Sun GuiJiu（Faculty Adviser: Xiao FanHua）（Department of Chemistry and Chemical Engineering ,Shanghai institude of Technology University）Abstract : Clethodim is a kind of new dry postemergence herbicides, Vinblastine was extracted from atha

4、ranthus roseus and further purified by olumnhrom atography.Orthogonal test was employed to optimize the extraction process.The content of vinblastine in the extraction was determined with ultraviolet spectrophotometry,The results show that solvent method is efficient,the content of extracting vinbla

5、stine from atharanthus roseus is high and the effect is good.Keywords : vinblastine;extraction;purification;olumnhromatography1前言長(zhǎng)春花又名雁來(lái)紅、日日新、四時(shí)春、三萬(wàn)花，是夾竹桃科植物長(zhǎng)春花的全草，長(zhǎng)春堿(vinblastine)是從長(zhǎng)春花中提取的一種二聚吲哚類(lèi)生物堿。長(zhǎng)春堿,可用于抗癌、降壓,尤其是其抗癌作用受到人們的重視并應(yīng)用于臨床。長(zhǎng)春堿與醛基長(zhǎng)春堿等,能夠降低脫氧核糖核酸(DNA)與核糖核酸(RNA)及蛋白質(zhì)的合成,抑制癌細(xì)胞的有絲分裂,使細(xì)胞分裂停止在中期

6、,因而腫瘤細(xì)胞不能增值。長(zhǎng)春堿在長(zhǎng)春花中的含量約為萬(wàn)分之四,可用于治療白血病、何杰金氏病、淋巴肉瘤,對(duì)乳腺癌、卵巢癌、睪丸癌、單核細(xì)胞白血病均有一定療效。對(duì)網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤、腎母細(xì)胞瘤、惡性黑色素瘤也有效,并被若干國(guó)家藥典所收載。長(zhǎng)春堿類(lèi)抗腫瘤藥物屬于雙吲哚類(lèi)生物堿,即由吲哚(上半部分的長(zhǎng)春質(zhì)堿環(huán))和雙氫吲哚(下半部分的文多靈環(huán))通過(guò)C15-C18連接構(gòu)成。均含有3個(gè)叔胺基、1個(gè)仲胺基,呈弱堿性。它們都易溶于氯仿、乙醇等有機(jī)溶劑,不溶于水;藥用為水溶性硫酸鹽。本文利用溶劑法提取長(zhǎng)春堿,并通過(guò)柱色譜法進(jìn)一步純化長(zhǎng)春堿。除此之外，自證實(shí)此類(lèi)化合物具有抗腫瘤活性1以來(lái)，現(xiàn)已正式用于臨床的有長(zhǎng)春堿（vin

7、blastine）、長(zhǎng)春新堿（vincristine）、長(zhǎng)春地辛（vindesine）及長(zhǎng)春瑞賓（vinorelbine）。處于臨床研究的還有長(zhǎng)春氟寧（vinflunine）、長(zhǎng)春甘酯（vinglycinate）及脫水長(zhǎng)春堿（anhy-drovinblastine）。2 抗腫瘤機(jī)制長(zhǎng)春堿具有抗腫瘤作用,主要用于何杰金氏病、絨毛膜癌(對(duì)氨甲蝶呤已產(chǎn)生抗藥者,則需用較大劑量);此外,對(duì)淋巴肉瘤、蕈樣霉菌病(Mycosis fungoides)、白血病、橫紋肌軟骨瘤、黑色素瘤、精母細(xì)胞瘤、畸胎瘤、星形細(xì)胞瘤、肉織細(xì)胞肉瘤、癌(胸、肺、口腔、胃、結(jié)腸、直腸、卵巢、頸部、子宮、膀胱、腎等部位)等的抗腫瘤

8、作用還需進(jìn)一步肯定。療效出現(xiàn)較快,用藥后3d內(nèi)腫瘤明顯縮小或發(fā)熱消退,但緩解期較短,有的在用維持量或停藥后23周又趨復(fù)發(fā)。對(duì)實(shí)驗(yàn)性腫瘤的作用如下:對(duì)DBA/2小鼠的移植性淋巴細(xì)胞白血病P-1534有顯著治療效果,可以延長(zhǎng)小鼠的生存時(shí)間,但很少獲“治愈”。對(duì)DBA/1小鼠乳房腫瘤有明顯抑制作用。在臨床上對(duì)乳腺癌有一定的治療效果。長(zhǎng)春堿對(duì)小鼠白血病L1210、小鼠移植性淋巴細(xì)胞白血病P-1534、AKP-白血病、大鼠W258、IRC741/1398白血病、小鼠肉瘤S180、艾氏腹水癌和移植性及自發(fā)性乳腺癌都有實(shí)驗(yàn)治療作用,并可防止AKP小鼠的自發(fā)性白血病,能使患IRC741白血病的Fisher大鼠

9、血流中存在的瘤細(xì)胞迅速消失。長(zhǎng)春堿的作用機(jī)制與秋水仙堿相似,能抑制腫瘤細(xì)胞如艾氏腹水癌、腹水癌L1210和人的單核細(xì)胞性白血病以及正常動(dòng)物骨髓細(xì)胞的有絲分裂,使停止于中期。長(zhǎng)春堿能干擾微管蛋白的合成,從而阻止微管蛋白裝配成有功能的紡錘絲。與秋水仙堿不同之處為該抑制作用較強(qiáng),且可被谷氨酸和色氨酸所對(duì)抗。早期的體外實(shí)驗(yàn)未能證明長(zhǎng)春堿于治療濃度下對(duì)DNA和RNA的合成有明顯影響,但后來(lái)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)艾氏腹水癌小鼠給長(zhǎng)春堿(2mg/kg)一劑,即能減少3H-尿嘧啶核苷摻入癌細(xì)胞的RNA。體外實(shí)驗(yàn)如果藥物與艾氏腹水癌細(xì)胞一起較長(zhǎng)時(shí)間(1h)溫育后,3H-尿嘧啶核苷摻入RNA亦顯著被抑制,于2×

10、10-4M 即產(chǎn)生明顯抑制,且被大劑量谷氨酸所對(duì)抗。對(duì)大鼠瓦克肉瘤,長(zhǎng)春堿能明顯抑制3H-胸腺嘧啶脫氧核苷摻入DNA,對(duì)瘤細(xì)胞核仁的DNA合成的抑制作用比非核仁的DNA要強(qiáng)。近有報(bào)道長(zhǎng)春堿能抑制艾氏腹水癌細(xì)胞的DNA依賴性RNA聚合酶，總的來(lái)說(shuō)，研究表明長(zhǎng)春堿類(lèi)藥物可干擾細(xì)胞周期的有絲分裂階段（M期），從而抑制細(xì)胞的分裂和增殖。其細(xì)胞毒性是通過(guò)與微管蛋白的結(jié)合實(shí)現(xiàn)的，它們?cè)谖⒐艿鞍锥垠w上有共同的結(jié)合位點(diǎn)，可抑制微管聚合，妨礙紡錘體微管的形成，從而使分裂于中期停止，阻止癌細(xì)胞分裂增殖23 長(zhǎng)春堿的提取及純化3.1 長(zhǎng)春堿的提取法長(zhǎng)春堿的提取方法主要有生物技術(shù)提取法，超臨界流體萃取法，溶劑提取法

11、這三種，提取方式的優(yōu)劣各有不同。3.1.1生物技術(shù)提取法目前主要從天然植物中提取長(zhǎng)春堿，但它們?cè)谥参镏械暮繕O低，而化學(xué)合成法和半合成法的制備效果也不太理想。為了更有效地生產(chǎn)長(zhǎng)春花生物堿，科學(xué)工作者正致力于將生物技術(shù)應(yīng)用于長(zhǎng)春花的研究與開(kāi)發(fā)。組織培養(yǎng)：張秀省等3以長(zhǎng)春花葉和子房誘導(dǎo)的愈傷組織為材料，進(jìn)一步通過(guò)化學(xué)誘變得到2種變異細(xì)胞株，并對(duì)4種不同愈傷組織的生長(zhǎng)以及吲哚生物總堿、阿瑪堿、長(zhǎng)春質(zhì)堿的生物含量進(jìn)行了分析比較，期望為今后長(zhǎng)春花細(xì)胞工業(yè)化生產(chǎn)藥物的開(kāi)發(fā)提供比較理想的細(xì)胞株。細(xì)胞工程：用不同質(zhì)量濃度的乙烯利、乙酰水楊酸、色氨酸溶液分別處理溫室盆栽長(zhǎng)春花植株，于2d后測(cè)定葉片中的總吲哚生物

12、堿含量，并采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法測(cè)定長(zhǎng)春質(zhì)堿的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)處理后植株中成分的含量有明顯提高，并確定了最合適的處理質(zhì)量濃度4。發(fā)酵工程：通過(guò)對(duì)長(zhǎng)春花葉內(nèi)生真菌進(jìn)行分離，篩選出1株無(wú)孢菌群菌株，并對(duì)其發(fā)酵提取物進(jìn)行薄層色譜法（TLC）和高效液相色譜（HPLC）法分析，結(jié)果表明此菌株能夠產(chǎn)生VCR5真菌易于培養(yǎng)，可以通過(guò)育種手段和控制培養(yǎng)條件等措施來(lái)大幅度提高其有效成分的含量，便于組織工業(yè)化生產(chǎn)。遺傳轉(zhuǎn)化工程：遺傳轉(zhuǎn)化系指利用重組DNA、組織培養(yǎng)或種質(zhì)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化等技術(shù)將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞或組織中獲得轉(zhuǎn)基因植物的技術(shù)。孫敏等6用發(fā)根農(nóng)桿菌感染長(zhǎng)春花，誘導(dǎo)出毛狀根，通過(guò)離體培養(yǎng)、株

13、系篩選，提取出了長(zhǎng)春堿，為長(zhǎng)春花生物堿的工業(yè)化生產(chǎn)和產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為應(yīng)用轉(zhuǎn)化毛狀根技術(shù)獲得藥用植物次生代謝產(chǎn)物開(kāi)辟了一條新的有效途徑。隨著培養(yǎng)技術(shù)的改進(jìn)和合理反應(yīng)器的設(shè)計(jì)，以及控制 長(zhǎng)春堿、文多靈合成的關(guān)鍵酶基因克隆出來(lái)并轉(zhuǎn)化成功，尋求高產(chǎn)的長(zhǎng)春花植株或細(xì)胞株一定會(huì)成為現(xiàn)實(shí)?；瘜W(xué)誘變：用不同質(zhì)量濃度的甲基磺酸乙酯（EMS）處理長(zhǎng)春花愈傷組織， 挑選成活愈傷組織塊繼代擴(kuò)大培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用EMS處理的長(zhǎng)春花愈傷組織發(fā)生了突變，與對(duì)照組相比，不僅生長(zhǎng)快，而且總吲哚生物堿含量高7化學(xué)誘變是人工獲取突變體常用的手段之一，EMS又是較常用的化學(xué)誘變劑，可篩選高產(chǎn)吲哚生物堿的穩(wěn)定細(xì)胞系， 并

14、利用細(xì)胞工程技術(shù)獲取藥用成分。 它有可能成為一種理想的方法。3.1.2 超臨界流體萃取法這方面的研究較少。Stahl等8初步研究了長(zhǎng)春堿的超臨界流體萃取，結(jié)果表明在壓力為80-200bar（8-20Mpa）、提取溫度40下的萃取效果不佳，N2O萃取效果比CO2稍好。Choi等9研究表明，CO2-甲醇-三乙胺（80:18:2）超臨界萃取能有效地提取長(zhǎng)春花草中的長(zhǎng)春堿。在80、34Mpa下的萃取率是甲醇萃取的76.4%，而不加夾帶劑或改變其它夾帶劑的條件下萃取率不及甲醇萃取的25%。超臨界萃取無(wú)毒、無(wú)污染，萃取時(shí)間短、能耗低，但需要高壓設(shè)備，成本較高，進(jìn)行大規(guī)模原料萃取的生產(chǎn)條件還不成熟。3.1.

15、3 溶劑提取法醇類(lèi)溶劑提取法：Kalman10等和Javanovics11將全草用氨水浸潤(rùn)后再用甲苯提取，但此法會(huì)使生藥中的一些中、強(qiáng)生物堿以游離形式被提取出來(lái)，導(dǎo)致純化難度加大。隨后改為含水甲醇浸提，再用硫酸酸化，所得生物堿含量比堿水浸取高30-40倍。利用甲醇使得成本降低，也減少了提取步驟，但甲醇極性較大，因此其選擇性不夠理想。醇提取液中含有生物堿及其鹽，尚含大量脂溶性雜質(zhì)，且稀醇提取液含水溶性雜質(zhì)，尚需進(jìn)一步處理。親脂性有機(jī)溶劑提取法：由于大多數(shù)游離生物堿極性低，可用氯仿、二氯甲烷苯等提取。為了只提取藥材中的弱堿性生物堿，可采用水甚至稀有機(jī)酸水代替堿水潤(rùn)濕藥材，再用有機(jī)溶劑提取。長(zhǎng)春堿在

16、總生物堿中含量極微，若提出總生物堿后再行分離，不僅操作煩瑣，而且得率極低，故生產(chǎn)上采用藥粉用水濕潤(rùn)后用苯提取，使大部分堿性較強(qiáng)的生物堿未被提出，這樣有利于進(jìn)一步純化12。酸水提取法：常用0.5%-1%的乙酸、硫酸、酒石酸等為溶劑。此法提取所得溶液體積較大，濃縮困難，故可配合離子交換樹(shù)脂法或有機(jī)溶劑萃取法進(jìn)行處理。Gedeon13等用含少量硫酸的90%的甲醇提取全草，因其等成分可轉(zhuǎn)化為鹽，更易被甲醇提出，提取率也有所增加。Gunasekera14等將甲醇改為乙酸水溶液提取，再用氨水堿化，最后用二氯甲烷萃取。該法提取率高、步驟簡(jiǎn)單、有機(jī)溶劑用量少，增加了操作安全性，利于環(huán)保，但提取物中雜質(zhì)較多，需

17、有成熟的柱色譜方法配合，方可得到高純度產(chǎn)品。酸提液中含有樹(shù)脂、 葉綠素等雜質(zhì)，若堿化后直接用氯仿、二氯甲烷等萃取，易形成乳化層，使VLB(不易被萃取完全；若先用石油醚脫脂，然后堿化再萃取，則乳化現(xiàn)象將大為改觀。長(zhǎng)春生物堿對(duì)光和熱不穩(wěn)定， 在提取和儲(chǔ)存過(guò)程中注意避光與避熱。3.2 長(zhǎng)春堿的純化長(zhǎng)春堿的主要純化方法為柱色譜法。3.2.1柱色譜法純化法一次過(guò)柱：長(zhǎng)春堿的柱色譜純化一般是過(guò)一次堿性氧化柱，除去極性較低的碳?xì)浠衔锛安糠种行?、酸性物質(zhì)。氧化鋁用前要經(jīng)過(guò)100-150活化處理，降低含水量，提高活性；但活性也不宜太高，否則產(chǎn)品不易洗脫。所以一般選擇的氧化鋁活性為IV級(jí)，含水量為6%-10%。

18、由于長(zhǎng)春堿是中極性物質(zhì)，流動(dòng)相的極性不宜太高，一般用苯-石油醚15苯-氯仿16、苯-二氯甲烷、二氯甲烷-氯仿、乙酸乙酯-石油醚等以不同的比例梯度洗脫。洗脫液中依序主要含有長(zhǎng)春堿，長(zhǎng)春次堿和2的混合物，2。利用堿性氧化鋁柱一般可以從碳?xì)浠衔镏谐ズ趸衔?，能完全將僅相差一個(gè)基團(tuán)的長(zhǎng)春堿和2分開(kāi)，但是長(zhǎng)春堿難以和異常春堿等一些雜質(zhì)分離17，此方法目前大規(guī)模生產(chǎn)，缺點(diǎn)是產(chǎn)品的純度不夠。兩次過(guò)柱：一次氧化鋁柱色譜往往不能得到較高純度的長(zhǎng)春堿，如作為注射劑或者用以制備近年來(lái)開(kāi)發(fā)成功的抗癌作用更強(qiáng)的藥品-長(zhǎng)春瑞濱的原料，則均需純度95%的長(zhǎng)春堿硫酸鹽。Gunasekera14等采用兩次過(guò)柱的方法，將粗

19、提的總生物堿粗品4.6g先經(jīng)過(guò)羥丙基交聯(lián)葡聚糖凝膠Sephadex LH20柱，二氯甲烷-甲醇或氯仿-甲醇作流動(dòng)相，分段收集餾分，含長(zhǎng)春堿部分合并濃縮，然后過(guò)二次硅膠柱進(jìn)一步純化，硅膠需經(jīng)去活處理，用1%-10%甲醇-氯仿梯度洗脫，含長(zhǎng)春堿部分蒸除溶劑，在無(wú)水乙醇中結(jié)晶，得到含量較高的長(zhǎng)春堿硫酸鹽。這種方法第一次過(guò)柱時(shí)所用的固定相價(jià)格較貴，且多次使用會(huì)造成不可逆吸附，分離效果變差。所以盡量減少污染凝膠。如果能處理好凝膠的再生和保護(hù)問(wèn)題，經(jīng)濟(jì)上也可以，將是一個(gè)很好的獲得高純度的長(zhǎng)春堿的活化方法。多次過(guò)柱：Atta-ur-rahman18等經(jīng)過(guò)3次過(guò)柱純化得到高純度長(zhǎng)春堿，粗提取的總生物堿先過(guò)氧化

20、鋁柱，再過(guò)硅膠柱，用制備型HPLC分離，軍用乙酸乙酯-石油醚梯度洗脫，得到最終產(chǎn)物。4 長(zhǎng)春堿衍生物的合成研究自1958年加拿大人Noble和Beer19，20等首次分離得到了長(zhǎng)春堿至今，由于長(zhǎng)春堿類(lèi)化合物具有的光譜抗癌活性，使得世界各國(guó)都熱衷于研究該類(lèi)化合物的合成和其各種衍生物的合成，以從中篩選到療效更好、毒副作用更低的新型藥物。到目前為止，據(jù)已公開(kāi)的資料統(tǒng)計(jì)，人們合成的長(zhǎng)春堿類(lèi)衍生物有數(shù)百個(gè)之多。而在這其中，已經(jīng)成為臨床抗癌藥物的有：長(zhǎng)春地辛（vindesine）、長(zhǎng)春瑞濱（vinorelbine）和長(zhǎng)春氟寧（vinflunine）4.1 長(zhǎng)春地辛的合成1978年，美國(guó)Eli Lilly

21、and Company的Gerzon等人對(duì)長(zhǎng)春堿的C-3位處的甲酯基進(jìn)行了修飾，通過(guò)氨解或肼解、還原的方法，得到了長(zhǎng)春地辛，并對(duì)其藥理活性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其對(duì)急性淋巴細(xì)胞性白血病、慢性粒細(xì)胞性白血病有顯著療效。對(duì)小細(xì)胞及非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌也有較好療效。長(zhǎng)春地辛合成步驟如下圖所示：NH.3.MeOH Vinblastine VindesineN2H4 MeOH Raney Ni Vindesine124.2 長(zhǎng)春瑞濱的合成1979年，法國(guó)的Potier等人在其已有的研究基礎(chǔ)上，又進(jìn)一步合成了7-nor-anhydrovinblastine，至1989年，法國(guó)Pierre Fabre公司研制成了

22、它的酒石酸鹽，取名長(zhǎng)春瑞濱。目前主要用于治療非小細(xì)胞肺癌（Non-Small-cell Lung Cancer,NSCLC）。長(zhǎng)春瑞濱合成步驟如下圖所示：m-CPBA (CF3CO)2O ,CHCl2THF,H2O Vinorelbine 13 4.3長(zhǎng)春氟寧的合成研究繼1989年法國(guó)的Pierre Fabre公司將長(zhǎng)春瑞濱上市以后，至1997年，法國(guó)的Fahy等人又合成了anhydrovinblastine和長(zhǎng)春瑞濱的C20位的亞甲基雙氟帶衍生物，其中后者的衍生物就是長(zhǎng)春氟寧。目前還在進(jìn)行后期的臨床實(shí)驗(yàn)，主要用于治療乳腺癌和除罕見(jiàn)的間皮瘤外的非小細(xì)胞癌。5 結(jié)論 總之利用長(zhǎng)春堿制成的藥物已經(jīng)

23、廣泛用于癌癥的治療，但由于神經(jīng)系統(tǒng)的毒性和局部刺激性較大的限制了其使用，科學(xué)工作者應(yīng)該加快對(duì)長(zhǎng)春堿進(jìn)行更深層次的研究、開(kāi)發(fā)和利用，以便制成高效低毒的新劑型，并結(jié)合臨床實(shí)際開(kāi)發(fā)出更好的藥劑，更好的服務(wù)于皇者。參考文獻(xiàn) Uffelie, O. F. Alkaloids with tumor inhibiting action from catharanthus roscusJ. Pharm weekbl, 1969, 104(16): 321-3302 Zhou, X. J.; Ranmani, R. Prcclinecal pharmacology of vinca alkaloidsJ. Dr

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