生物分析化學(xué)作業(yè)

1、生物分析化學(xué)作業(yè)姓名：學(xué)號：培養(yǎng)單位:超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用同時檢測嬰兒奶粉中的牛-乳白蛋白和-球蛋白含量AnalyticaChimica Acta667 (2010) 96102摘要作者開發(fā)了一種能夠同時檢測出牛-乳白蛋白（-La）和-球蛋白(-Lg)含量的可靠超高效液相色譜法。與之前的方法相比，此法在選區(qū)監(jiān)測模式下與質(zhì)譜聯(lián)用，分析速度快，檢測限低。為了得到目標(biāo)分析最好的分辨率，此法采用包含0.1%三氟醋酸(TFA)水溶液（A）和0.1%三氟醋酸（TFA）的乙腈（B）的線性梯度移動相和UPLC BEH300 C18色譜柱（150mm×2.1mm,1.7m）。精確定量需要使用人體-

2、乳白蛋白作為內(nèi)標(biāo)。鑒于其線性度（R20.9991），靈敏度（定量限，0.150.19gmL1），恢復(fù)率（94.098.7%），精確度（相對標(biāo)準(zhǔn)差11.1%），可重復(fù)性（相對標(biāo)準(zhǔn)差5.7%），此方法普遍有效。研究顯示這是一種在生物藥品中同步檢測主要乳清蛋白的可行方法。目前有效的方法已被成功應(yīng)用于嬰兒奶粉中的蛋白質(zhì)檢測。前言由于其獨特的生物化學(xué)營養(yǎng)功能性質(zhì)，乳清蛋白是非常重要的食品蛋白質(zhì)，已經(jīng)被用作運動員的膳食補充和用于食品工業(yè)添加劑。嬰兒奶粉富含乳清蛋白，是非常重要的市場，在過去的二十年里被廣泛開發(fā)。因為它們的營養(yǎng)和生物活性，包括-白蛋白在內(nèi)的各種各樣的作料已經(jīng)或是提議作為添加劑加入到嬰兒奶粉中

3、，來更好地模擬人乳的成分。乳清蛋白作為嬰兒奶粉的主要成分的一個主要問題是，-球蛋白的存在。這種在母乳中存在的蛋白被報道會引起嬰兒的過敏反應(yīng)，從而限制了牛乳用作嬰兒牛奶的原材料。然而，一些商業(yè)嬰兒奶粉通常都含有大量-球蛋白。另一個問題產(chǎn)生自天然形式的乳清蛋白的質(zhì)量控制。盡管人們已經(jīng)知道奶制品的營養(yǎng)和功能直接與蛋白質(zhì)的自然態(tài)相關(guān)，但是很難控制奶制品中的成分。不同的加工過程會導(dǎo)致不同的蛋白質(zhì)改動，從而反過來影響原生態(tài)乳清蛋白的品質(zhì)。所以，不同廠家的相同產(chǎn)品的生物活性也不同。因此，為了保證嬰兒奶粉的營養(yǎng)價值，發(fā)展-La和-Lg定性定量分析的品質(zhì)控制方法是個十分重要的問題?；诿氹娪綜E，凝膠電泳GE

4、，液相色譜LC和免疫化學(xué)方法的各種各樣的分析技術(shù)被用作乳清蛋白分析。CE只在蛋白質(zhì)微量分析中有效，分析時間相對較短，但是重現(xiàn)性不好。盡管CE也能同時檢測多個樣品，但是比較耗時，精確度低，需要離線檢測，限制其應(yīng)用。免疫化學(xué)分析具有高靈敏度，但是制備新抗原的抗體是個冗長的過程。乳清蛋白分析最常用的方法是液相色譜與不同方法聯(lián)系技術(shù)。然而，傳統(tǒng)的HPLC法通常使用5m顆粒填充的色譜柱，會消耗很多時間分開目標(biāo)化合物。為了解決這個缺點，當(dāng)前人么開發(fā)了超高液相色譜UHPLC法。將粒徑5m（HPLC）降低到1.7m（UHPLC），從而提高了色譜的分辨率和靈敏度。質(zhì)譜檢測的引入大大提高了蛋白質(zhì)分析技術(shù)，因為其特

5、殊的選擇性和提供高度結(jié)構(gòu)特異性信息。越來越多的實驗方法證明LC-MS是種檢測蛋白質(zhì)的強大工具。盡管此種分析法在純?nèi)芤汉突|(zhì)中的的離子化效率差異會影響其精確度。這個問題可以通過以下兩種途徑解決：一、采用外部基質(zhì)校正；二、在樣品中加入內(nèi)標(biāo)來校正制樣和離子化效應(yīng)所產(chǎn)生的復(fù)蘇性損失。用LC-MS定量蛋白質(zhì)可以再核苷酸水平（經(jīng)過蛋白質(zhì)消化后的信號核苷酸分析）或蛋白質(zhì)水平（未經(jīng)接觸的蛋白質(zhì)分析）。描述了利用同位素標(biāo)記合成類似物作為IS通過分析胰蛋白酶信號核苷酸進行蛋白質(zhì)定量的方法。這種方法的優(yōu)勢是：檢測限低和同位素標(biāo)記核苷酸易于獲得。缺點是IS的表現(xiàn)也許會和在消化前過程中的未經(jīng)接觸的蛋白質(zhì)很不相同。這會導(dǎo)

6、致分析和IS的不同損失，并接著影響方法的精確度。蛋白質(zhì)水平分析直接進行分析，避免了潛在的會產(chǎn)生問題的消化步驟，但是合適的IS得獲得是是一個主要問題。理論上，理想的IS是同位素標(biāo)記的所分析蛋白質(zhì)的類似物，它在整個樣品制備過程中的表現(xiàn)和被分析蛋白質(zhì)相似。然而獲得這樣的IS需要復(fù)雜的制備過程。替代方法是采用與所分析蛋白質(zhì)序列相似的物種變體（例如，不同物種的同一蛋白質(zhì)）作為IS。此方法采用山羊-Lg和麋羚-Lg作為檢察奶制品中牛-Lg的IS。采用LC-MS在生物基體中定量分析蛋白質(zhì)的關(guān)鍵問題是不同嬰兒奶粉中的乳清蛋白含量顯著不同所產(chǎn)生的靈敏度問題。在以前的研究中，研究者采用完全掃描模式下的質(zhì)量分析來獲

7、得蛋白質(zhì)的完全電荷分布（CDs）。這種方法可以避免潛在的精確度或重現(xiàn)性問題。但是，靈敏度達不到同時檢測不同嬰兒奶粉中主要乳清蛋白質(zhì)的要求?；谶@些考慮，作者在實驗室中發(fā)展了一種可靠的UHPLC-MS聯(lián)用的方法用來同時檢測嬰兒奶粉中牛的-乳白蛋白和-球蛋白。這種方法檢測時間短、靈敏度良好、掃描模式可靠、IS合適以及結(jié)構(gòu)鑒定選擇性合適。作者還展示并評價了可靠性的細節(jié)參數(shù)，如線性、恢復(fù)性、靈敏度、精確度和重現(xiàn)性。文章中還應(yīng)用此法檢測了不同嬰兒奶粉中三種乳清蛋白的分布。2、實驗部分2.1 化學(xué)藥品（材料和試劑）乳清蛋白：牛-Lg（純度90）和-Lg(A和 B 純度90) 人乳中分離的人-Lg純化水、

8、HPLC級乙腈和甲醇、醋酸、甲酸、三氟醋酸（TFA）、其他溶劑為分析純、高品質(zhì)PDEF注射過濾器（孔徑0.22m，直徑13mm）。2.2 儀器超高液相色譜儀超高液相色譜BEH300 C18色譜柱（150mm×2.1mm,1.7m）流動相速率0.25ml/min流動相包含0.1%三氟醋酸(TFA)水溶液（A）和0.1%三氟醋酸（TFA）的乙腈（B），線性梯度洗脫過程如下（所有值都是體積比% v/v）:初始39%B，在2min內(nèi)從39%線性上升到42%；在2.3 min內(nèi)從42%線性上升到44%;在0.2min內(nèi)從44%線性上升到100%;100% B等度洗脫0.5min；在0.5min

9、內(nèi)色譜柱移動相恢復(fù)到初始成分；2.5min內(nèi)色譜柱恢復(fù)到初始（總持續(xù)時間：8min）。注入體積1L。質(zhì)譜儀采用正電模式電噴霧源。離子化器條件如下：管壓3.5kv；進樣錐電壓，45v；源溫度，120；脫溶劑氣溫度，350；錐孔反吹氣流，55Lh-1;去溶劑化氣流，580 Lh-1。定量分析在800-3200（m/z）全掃描模式下進行。采用Max-ENT進行多電荷離子解卷積。選區(qū)監(jiān)測模式進行定量。選區(qū)（m/z）：牛-La，23572367；人-La（IS），23392349;-Lg A，16651675；-LgB，16561666。2.3 空白基質(zhì)制備將0.2g嬰兒奶粉溶解在包含0.2%聚乙二醇辛

10、基苯基醚的0.3M的氯化鈉溶液中。然后，用TFA將其PH調(diào)節(jié)至4.6，用水將其體積調(diào)至10mL。室溫下用高速攪拌機混合10min，過濾，得到5mL濾液，在微波實驗室工作站中消化。試驗參數(shù)為：工作功率，250W;時間，10.5min。消化處理后，將溶液通過0.22m過濾器。2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備含有牛-La，-LgA，-LgB和人-La（IS）的存儲液（1 mg mL1）在水中制備。含有牛-La，-LgA，-LgB的混合溶液（100g mL1）在空白基質(zhì)中制備。所有溶液都在-20被放在黑暗中不超過1個月。工作標(biāo)準(zhǔn)溶液都是由這些存儲溶液制備而成，并在使用之前用空白基質(zhì)逐步快速稀釋。2.5 樣品制備

11、每個均勻樣品(0.2g)都用500L人-La（1 mg mL1）做內(nèi)標(biāo)。這些加標(biāo)樣品被溶解在9mL包含有0.2%（w/v）聚乙二醇辛基苯基醚的0.3M氯化鈉溶液中。然后，將溶液用TFA調(diào)節(jié)PH至4.6，接著加水至10mL。室溫下混合均勻10min后，用高速離心機離心在2.1×104g離心15min后。上層清液采用0.22m的過濾器過濾后，備用。2.6 蛋白質(zhì)鑒別根據(jù)在標(biāo)準(zhǔn)溶液中相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)的保留時間和質(zhì)譜（選取監(jiān)測模式），樣品中的三種蛋白質(zhì)可以清晰鑒別。3、結(jié)果與討論-LgA，-LgB是-Lg的兩個變體。這兩個變體的區(qū)別只在64和118位置的連個氨基酸取代，使得它們的質(zhì)量相差86Da，如

12、圖1所示。在以前的研究中，-LgA和-LgB無法完全分開，所以經(jīng)常以總稱-Lg表示。在此前的研究中，三種不同長度和粒徑的LC色譜柱被用作對比分離效果，例如，（1）Waters Symmetry 300 C18色譜柱（75 mm×4.6 mm, 3.5m）(2) Waters Symmetry 300 C18色譜柱 (100 mm×2.1 mm, 3.5m) 和(3) Waters Acquity UPLCBEH300 C18 色譜柱 (150 mm×2.1 mm, 1.7m)。結(jié)果表明，色譜柱3的分離效果明顯好于色譜柱1和2。這也許是因為其粒徑減小到1.7m的原因

13、，凈表面積的增加使得柱效提高。所以作者選擇了色譜柱3。這種條件下，在8min內(nèi)所用分析物都能被完全分離。3.2 蛋白質(zhì)表征與可靠定量的IS選擇當(dāng)在蛋白質(zhì)水平定量時，只有與分析物序列和物理化學(xué)性質(zhì)相似的蛋白質(zhì)才能符合IS的要求。由于牛-La的物種變體具有高度序列相似性，人-La被選作此研究的IS。人-La、牛-La、-LgA，-LgB序列如圖1所示。人-La與牛-La序列具有高度相似性（72%），其性質(zhì)如分子量PI也與牛-La的性質(zhì)很匹配。因此，在整個分析過程中人-La與牛-La顯示相同的行為，因此是非常合適的IS。此外，其色譜和質(zhì)譜行為也被評估了。圖2顯示了牛-La、-LgA、-LgB和人-L

14、a（IS）的混合物的色譜檢測量，每個樣品濃度都為50gmL1（也就是，牛-La，3.5×106mol L1；-LgA，2.7×106mol L1；-LgB，.7×106mol L1；人-La，3.6×106mol L1）。人-La在色譜時間軸上的位置表明其非常適合用來做IS。人-La、牛-La、-LgA和-LgB的原始質(zhì)譜和解卷積后的質(zhì)譜現(xiàn)在在圖3中。牛-La和人-La的CSDs是相等的，顯示荷電狀態(tài)在5+至13+，最大值為6+(圖3a和b)。解卷積后的質(zhì)譜顯示，存在的主要成分是：牛-La的分子量為14178碎片、人-La的分子量為14070碎片、牛-L

15、gA的分子量為18363碎片和牛-LgB的分子量為18276碎片。所有數(shù)據(jù)都與以前文獻高度吻合。因此，人-La具有良好的分析行為，可以被用作IS。3.3 基質(zhì)效應(yīng)評估盡管人-La的檢測表現(xiàn)行為和牛-La相似，但是與牛-LgA和-LgB之間存在顯著差異。因此，為了確保兩個-Lg變體的精確定量，必須考慮基質(zhì)效應(yīng)。采用兩種普通方法來評價基質(zhì)效應(yīng)：柱后注入法和抽出后加標(biāo)法。住后注入法主要適用于基質(zhì)效應(yīng)定性評價。相反，抽出后加標(biāo)法主要用來定量評估基質(zhì)效應(yīng)。存儲溶液被用空白基質(zhì)或水稀釋來獲得一系列分析物濃度。信號抑制/增強（SSE）效果采用公式（1）計算。結(jié)果顯示所有的蛋白質(zhì)都會受基質(zhì)影響：人-La和牛-

16、La顯示相似SSE程度（牛-La，97.1%；人-La，98.2%），而牛-LgA和-LgB的信號強大都被顯著增強了（-LgA,245.4%;-LgB, 254.1%）。這可能是因為-Lg與-La的蛋白質(zhì)序列、穩(wěn)定性和CSDs完全不同，所有被基質(zhì)影響的程度也不同。為了確保定量的可靠性，測試中IS和基質(zhì)校正同時被引入：IS用來校正樣品制備中的回收率損失，而基質(zhì)校正被用來消除離子化效應(yīng)。3.4 定量分析的掃描模式選擇在以前的研究中，一些采用全掃描模式LCESI-MS法被發(fā)展用來分析初始和單/二形式的-La和-Lg。當(dāng)嬰兒奶粉中的乳清蛋白濃度相當(dāng)?shù)蜁r，這些方法的靈敏度是個問題。為了提高靈敏度，作者在

17、測試張采用了基于選區(qū)監(jiān)測模式的定量方法。三個在質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)中相對豐富的質(zhì)量范圍被選作集中區(qū)域。這些集中區(qū)域被用來分析每種分析物。以牛-La為例，其初始和解卷積質(zhì)譜如圖3所示，5+ (m/z, 2836.6), 6+ (m/z, 2364.1) and 7+ (m/z, 2026.5)峰由于較高的強度被選來作定量分析。備選掃描區(qū)域為20202030 (m/z) 目標(biāo) 7+ 荷電態(tài)， 23572367 (m/z) 目標(biāo)6+ 荷電態(tài)，28302840 (m/z) 目標(biāo)為5+ 荷電態(tài)。然后，利用四個校正曲線計算三個嬰兒奶粉樣品的牛-La含量，四個曲線分別為20202030 (m/z),23572367 (

18、m/z), 28302840 (m/z) 和8003200 (m/z, 全掃描)。結(jié)果顯示選區(qū)檢測模式下計算出來的牛-La含量幾乎與全掃描模式下計算出的含量一樣，說明兩種模式都可以用來定量分析三種乳清蛋白。于是便得到了靈敏的分析方法。最低檢測限在23572367 (m/z)區(qū)域內(nèi)得到。因此，選擇23572367 (m/z)作為牛-La作為檢察范圍。通過這個方法，-Lg A 和-Lg B的檢測范圍被分為確定為16651675 (m/z) 和16561666 (m/z)。我們可以下結(jié)論說，我們選擇了初始質(zhì)譜中從初始點和結(jié)束點都是為最高峰的區(qū)域作為相關(guān)乳清蛋白的掃描分析區(qū)域。據(jù)此，人-La的掃描范圍

19、是23392349 (m/z)。相對于全掃描模式，選區(qū)檢測模式的利用大大提高了此法的靈敏度（至少在有三次是最高的），RSDs在1.994.36%，表明此法具有理想的靈敏度和重現(xiàn)性?；谝陨险撌?，建立選區(qū)檢測模式的質(zhì)譜分析方法適于用來分析嬰兒奶粉中的牛-La，-LgA和-Lg B。3.5 分析性能為了使同時檢測嬰兒奶粉中牛-La，-LgA和-Lg B的UHPLCMS法有效，此分析法的線性，靈敏度，回收率，精確度和重現(xiàn)性等分析性能必須理想。3.5.1 線性和靈敏度在空白基質(zhì)中制備包含50gmL1的人-La (IS) 每個蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為0.4, 1, 2, 4, 10, 20, 40,

20、60gmL1。注入(1L)每個標(biāo)準(zhǔn)溶液后，制作校正曲線，如表2所示。所有的校正曲線的線性范圍都是10.460gmL1，線性系數(shù)為(R2)0.999。檢測限(LOD) 和定量限(LOQ)指的是性噪比分別為3:1 和10:1的化合物濃度。它們是通過在UHPLCMS條件下連續(xù)稀釋樣品溶液來確定的。結(jié)果如表2所示。3.5.2 回收率和精確度采用標(biāo)準(zhǔn)加入法來檢測回收率。十五份嬰兒奶粉（每個濃度水平五份）被加入低、中、高含量的每種標(biāo)準(zhǔn)蛋白，額外的三份選作控制。樣品采用2.5部分的方法預(yù)處理，結(jié)果總結(jié)如表3所示。所有的回收率在94.098.7%范圍內(nèi)。每個化合物在低、中、高濃度水平的日內(nèi)和日間精確度如表4顯示。日內(nèi)RSDs在2.510.0%范圍內(nèi)，日間RSDs在3.311.1%范圍內(nèi)。3.5.3 重現(xiàn)性UHPLCMS的重現(xiàn)性研究采用通過分析11種內(nèi)標(biāo)嬰兒奶粉對MS響應(yīng)變化來確定。RSDs小于5.7%。3.6 方法應(yīng)用采用上面的分析方法，作者隨機分析了24家不同廠家的嬰兒奶粉。嬰兒奶粉的乳清蛋白提取物的UHPL