實(shí)驗(yàn)二培養(yǎng)細(xì)胞的觀察和檢測(cè)方法

1、實(shí)驗(yàn)二 培養(yǎng)細(xì)胞的觀察和檢測(cè)方法一、 細(xì)胞計(jì)數(shù)法 細(xì)胞計(jì)數(shù)法（cell counting）是用來(lái)計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液中細(xì)胞數(shù)量的一種方法。一般利用細(xì)胞計(jì)數(shù)板(即血細(xì)胞計(jì)數(shù)板)進(jìn)行。既可用于分散)細(xì)胞培養(yǎng)接種前計(jì)數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，也可用于對(duì)培養(yǎng)物的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。不論計(jì)數(shù)的對(duì)象如何，均須制備分散的細(xì)胞懸液。（一）制備細(xì)胞懸液 原代培養(yǎng)前用機(jī)械或化學(xué)方法分散組織成為單個(gè)細(xì)胞懸液。對(duì)于懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，可直接進(jìn)行下面的步驟進(jìn)行計(jì)數(shù)。如果計(jì)數(shù)對(duì)象為貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，首先需將培養(yǎng)物制備成細(xì)胞懸液。步驟如下：1) 終止培養(yǎng)，將培養(yǎng)液吸出，用PBS洗培養(yǎng)物一次。2) 給培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入1m1 0.25胰蛋白

2、酶溶液，于37消化35 min，期間不斷在鏡下觀察。當(dāng)細(xì)胞變圓接近脫壁時(shí)，棄消化液。3) 加人一定量的培養(yǎng)液(如果這些培養(yǎng)細(xì)胞不再有用，可加PBS)，用吸管吹打，使細(xì)胞脫壁而制成細(xì)胞懸液。(二) 計(jì)數(shù)與計(jì)算過(guò)程1) 在細(xì)胞計(jì)數(shù)板中央放置計(jì)數(shù)專用的蓋玻片。2) 用玻璃虹吸管吸取細(xì)胞，讓虹吸管在蓋玻片上或下側(cè)的計(jì)數(shù)板凹槽處流出懸液，至蓋玻片下被液體充滿為止。3) 置顯微鏡下計(jì)數(shù)四角大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)。對(duì)于壓線的細(xì)胞只計(jì)數(shù)在上線和左線者，對(duì)于細(xì)胞團(tuán)按實(shí)際或估計(jì)細(xì)胞計(jì)數(shù)。4) 按下式計(jì)算細(xì)胞懸液的密度：細(xì)胞密度(4大格細(xì)胞總數(shù)4)x 10000(個(gè)ml)二、活細(xì)胞的染料排除檢測(cè)法由于死細(xì)胞的細(xì)胞膜通透

3、性發(fā)生改變，某些染料可大量進(jìn)入?yún)s不被排出，因而細(xì)胞呈色。而活細(xì)胞反之，能排出進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的染料，因而不易著色。此法的原理即是利用死、活細(xì)胞對(duì)染料的不同反應(yīng)而區(qū)分開(kāi)兩種細(xì)胞，可進(jìn)一步分別計(jì)數(shù)。（一） 臺(tái)盼藍(lán)排除檢測(cè)法1. 2臺(tái)盼藍(lán)溶液的配制：稱取2g臺(tái)盼藍(lán)(trypan blue)，加少量雙蒸水研磨粉碎后，再加水至50m1，離心后取上清液，再加入1.8NaCl溶液至100 m1，即成工作液。2. 活體染色與細(xì)胞計(jì)數(shù)：l 將1滴細(xì)胞懸液(貼壁細(xì)胞可經(jīng)0.25胰蛋白酶溶液消化后，吹打制成細(xì)胞懸液)與2滴臺(tái)盼藍(lán)液混合后，滴入細(xì)胞計(jì)數(shù)板。l 2 min后，在顯微鏡下計(jì)數(shù)至少200個(gè)細(xì)胞。未著色的為活細(xì)胞，

4、呈藍(lán)色的為死細(xì)胞。計(jì)算活細(xì)胞百分比。（二） 溴比乙錠和碘化丙錠排除檢測(cè)法溴比乙錠（ethidiumbromide，EB）和碘化丙錠（propidium iodine，PI）均為熒光染料，可與DNA特異性結(jié)合。1. 染液配制：取EB或P1 5 mg，枸櫞酸鈉0.1g，NP-40 0.3 ml，共溶于100ml蒸餾水中。避光保存。2. 熒光染色與計(jì)數(shù)：取細(xì)胞懸液和EB或PI染液各0.5ml，混勻。靜置10-30min后于熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)。發(fā)橙紅色熒光者為死細(xì)胞。也可用流式細(xì)胞儀測(cè)定，激發(fā)光波長(zhǎng)為488 nm。2h內(nèi)熒光保持穩(wěn)定。三、細(xì)胞活力測(cè)定的MTT比色法此法的原理是活細(xì)胞的線粒體脫氫酶能將染料

5、MTT（二甲基噻唑二苯基四唑溴鹽）轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢扇苄缘淖仙篆仯╢ormazan）顆粒，后者被二甲基亞砜（dimethylsulfoxide, DMSO）或酸性異丙醇溶解后所呈現(xiàn)的色度（用OD值表示）反映出生活細(xì)胞的代謝水平。死亡細(xì)胞則無(wú)此酶活性。1. MTT溶液的配制：將5 mg MTT溶于1 m1培養(yǎng)液(與所培養(yǎng)細(xì)胞用液相同，不含酚紅)、0.01 molL PBS （pH 7.2）或生理鹽水中。用0.2 m濾膜過(guò)濾。于4避光保存?？捎?周。若暫不用，可凍存。2. 實(shí)驗(yàn)過(guò)程：1) 將細(xì)胞培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板。實(shí)驗(yàn)時(shí)每孔含180 l培養(yǎng)液。2) 加入20 l MTT液，繼續(xù)培養(yǎng)34h。3) 吸去培養(yǎng)

6、液，加入200 l含0.040.1 molL鹽酸的異丙醇溶液二甲基亞砜（DMSO）。在微型振蕩器振蕩5 min。4) 在酶標(biāo)儀上測(cè)定光吸收。測(cè)定波長(zhǎng)為490或570 nm。四、普通染色觀察蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色和Giemsa染色是觀察培養(yǎng)細(xì)胞一般形態(tài)的最常用方法，也是把細(xì)胞作為標(biāo)本保存的主要方法。對(duì)于貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞，以生長(zhǎng)于蓋玻片和塑料培養(yǎng)瓶壁者便于操作。固定前先用Hanks液、PBS、BSS或生理鹽水清洗培養(yǎng)物2次，去除妨礙染色的血清。固定后可將蓋玻片用樹(shù)膠貼于載玻片上，以利操作。對(duì)于懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，須先經(jīng)離心沉淀(1000 rpm，10 min)，棄上清

7、液后(留少量液體)，將細(xì)胞懸液滴于玻片上做成涂片，冷風(fēng)吹干。（一）HE染色1. 染液配制：1) 蘇木精染液：稱取0.5 g 蘇木精，5.0 g鉀礬，0.1 g碘酸鈉加溫溶于70 ml蒸餾水。再加入30 m1甘油，2 ml冰醋酸。混勻。過(guò)濾后即成母液, 可長(zhǎng)久保存。用蒸餾水以1:20稀釋即成工作液。每次染色前宜過(guò)濾，去除氧化膜。2) 伊紅染液：伊紅有醇溶性與水溶性之分。將0.5 g伊紅溶于100 ml 70乙醇或蒸餾水即成工作液。2. 染色程序:1) 用10甲醛(福爾馬林)固定培養(yǎng)物30 mim，或以丙酮固定15 mim。2) 蒸餾水洗1次后，入蘇木精染液510 min染細(xì)胞核。3) 入0.5鹽

8、酸70乙醇溶液1 min，脫去胞質(zhì)的著色。此時(shí)核呈紫紅色。4) 入堿性溶液堿化，使細(xì)胞核變成藍(lán)色。如果時(shí)間允許，最好用自來(lái)水(呈弱堿性)長(zhǎng)時(shí)間浸泡。也可1NaHCO3溶液。此過(guò)程須不斷用顯微鏡監(jiān)視，以掌握堿化時(shí)間。5) 蒸餾水洗1 min，去除殘留的堿性溶液，否則影響伊紅著色。6) 入伊紅染液30s1 min。7) 用梯度乙醇溶液脫水：70、90、95乙醇各30 s1 min；100(2次)各2 min。如伊紅為乙醇溶液，則略去70%乙醇。8) 用二甲苯透明2次，各5 min。9) 樹(shù)膠封固。3. 染色結(jié)果：細(xì)胞核呈紫藍(lán)色或深藍(lán)色，大部分細(xì)胞的胞質(zhì)呈粉紅色。如果胞質(zhì)內(nèi)含較多核糖體(例如淋巴細(xì)胞

9、)則亦呈藍(lán)色。（二）吉姆薩 (Giemsa) 染色法此法可將細(xì)胞核與胞質(zhì)同時(shí)染色，故便捷快速；但染液配制技術(shù)不易準(zhǔn)確掌握，效果常不如HE染色穩(wěn)定。1. 吉姆薩染液的配制：1) 取1.5g吉姆薩粉末放入50 ml甘油，置于60溫箱，約3h后溶解。2) 取出后倒人50 ml中性甲醇，即為母液。于棕色瓶可長(zhǎng)久保存。需要注意的是，有的甲醇內(nèi)含醋酸，會(huì)使染液中的伊紅沉淀出來(lái)，不利染色。3) 將母液與0.1mol/L PBS(pH6.9-7.2)按1:9混合即成工作液。吉姆薩染液對(duì)pH極敏感，偏酸時(shí)染色過(guò)紅，偏堿時(shí)則過(guò)藍(lán)。所以，工作液宜現(xiàn)用現(xiàn)配，保存時(shí)間不超過(guò)48h以免被CO2酸化。2染色程序：1) 將標(biāo)

10、本用甲醇固定510 min。2) 入吉姆薩液染色1015 min。可用染色缸，或?qū)⑷疽旱胃灿跇?biāo)本。3) 蒸餾水清洗，空氣干燥，二甲苯透明，樹(shù)膠封固。3染色結(jié)果：細(xì)胞核呈藍(lán)或藍(lán)紫色，胞質(zhì)呈色與HE染色相仿。五、免疫細(xì)胞化學(xué)1. 培養(yǎng)的細(xì)胞用0.1 mol/L的PBS緩沖液（pH 7.27.4）洗15 min（5 min 3次）；2. 用4多聚甲醛固定液固定20 min，晾干；3. 3%H2O2孵育20 min滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，蒸餾水沖洗，0.1 mol/L的PBS緩沖液浸泡10 min；4. 滴加山羊血清封閉液，室溫20 min，吸去多余液體，不洗；5. 滴加第一抗體，4過(guò)夜后用PBS緩沖液洗5