DNA文庫(kù)的構(gòu)建和目的基因

1、DNA文庫(kù)的構(gòu)建和目的基因第六講第六講 DNA DNA文庫(kù)的構(gòu)建和文庫(kù)的構(gòu)建和目的基因的篩選目的基因的篩選 1 1 基因組基因組DNADNA文庫(kù)的構(gòu)建文庫(kù)的構(gòu)建2 cDNA2 cDNA文庫(kù)的構(gòu)建文庫(kù)的構(gòu)建3 3 基因克隆的篩選策略基因克隆的篩選策略DNA文庫(kù)的構(gòu)建和目的基因 外源基因：插入到載體內(nèi)的那個(gè)特定外源基因：插入到載體內(nèi)的那個(gè)特定的片段基因。的片段基因。 目的基因：那些已被或者準(zhǔn)備要分離、目的基因：那些已被或者準(zhǔn)備要分離、改造、擴(kuò)增或表達(dá)的特定基因或改造、擴(kuò)增或表達(dá)的特定基因或DNADNA片片段。段。DNA文庫(kù)的構(gòu)建和目的基因 對(duì)于高等真核生物而言，基因組對(duì)于高等真核生物而言，基因組D

2、NADNA十分龐大十分龐大, ,基因可達(dá)數(shù)萬個(gè)，且基因組成基因可達(dá)數(shù)萬個(gè)，且基因組成結(jié)構(gòu)復(fù)雜，除編碼序列，還有非編碼序結(jié)構(gòu)復(fù)雜，除編碼序列，還有非編碼序列及調(diào)控序列，基因間還存在大量的間列及調(diào)控序列，基因間還存在大量的間隔序列和重復(fù)序列，因此，單個(gè)目的基隔序列和重復(fù)序列，因此，單個(gè)目的基因在整個(gè)基因組中所占的比例極其微小，因在整個(gè)基因組中所占的比例極其微小，除少數(shù)例外，絕大多數(shù)基因難以直接分除少數(shù)例外，絕大多數(shù)基因難以直接分離得到。離得到。DNA文庫(kù)的構(gòu)建和目的基因 為了解決這個(gè)難題，一種可行的方為了解決這個(gè)難題，一種可行的方法就是將這個(gè)基因擴(kuò)增，增加成功分離法就是將這個(gè)基因擴(kuò)增，增加成功分離

3、目的基因的可能性。但是由于要分離的目的基因的可能性。但是由于要分離的目的基因往往是未知基因，因此無法對(duì)目的基因往往是未知基因，因此無法對(duì)它進(jìn)行特異性擴(kuò)增，而只能對(duì)所有的基它進(jìn)行特異性擴(kuò)增，而只能對(duì)所有的基因進(jìn)行擴(kuò)增，也就是構(gòu)建該生物材料的因進(jìn)行擴(kuò)增，也就是構(gòu)建該生物材料的基因文庫(kù)，然后再根據(jù)不同的方法將所基因文庫(kù)，然后再根據(jù)不同的方法將所需的克隆篩選出來，最后分離得到目的需的克隆篩選出來，最后分離得到目的基因?；?。DNA文庫(kù)的構(gòu)建和目的基因1 1 基因文庫(kù)基因文庫(kù)(gene library)(gene library)概念概念 又稱又稱DNA文庫(kù)，是指某個(gè)生物的基因組文庫(kù)，是指某個(gè)生物的基因

4、組DNA或或cDNA片段與適當(dāng)?shù)妮d體在體外片段與適當(dāng)?shù)妮d體在體外重組后，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并通過一定的重組后，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并通過一定的選擇機(jī)制篩選后得到大量的陽(yáng)性菌落選擇機(jī)制篩選后得到大量的陽(yáng)性菌落(或或噬菌體噬菌體)，所有菌落或噬菌體的集合即為，所有菌落或噬菌體的集合即為該生物的基因文庫(kù)。該生物的基因文庫(kù)。 基因文庫(kù)由外源基因文庫(kù)由外源DNA片段、載體和宿主片段、載體和宿主組成。組成。DNA文庫(kù)的構(gòu)建和目的基因2 2 構(gòu)建基因文庫(kù)的基本程序構(gòu)建基因文庫(kù)的基本程序 1)提取研究對(duì)象基因組提取研究對(duì)象基因組DNA，制備合適，制備合適大小的大小的DNA片段，或提取組織或器官的片段，或提取組織或器官的

5、mRNA并反轉(zhuǎn)錄成并反轉(zhuǎn)錄成cDNA； 2) DNA片段或片段或cDNA片段與經(jīng)特殊處理片段與經(jīng)特殊處理的載體連接形成重組的載體連接形成重組DNA； 3)重組重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞或體外包裝后轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞或體外包裝后侵染受體菌；侵染受體菌； 4)陽(yáng)性重組菌落或噬菌斑的選擇。陽(yáng)性重組菌落或噬菌斑的選擇。DNA文庫(kù)的構(gòu)建和目的基因目的基因：目的基因： 已知基因：已知基因： 未知基因：構(gòu)建基因文庫(kù)未知基因：構(gòu)建基因文庫(kù) 特定探針的制備特定探針的制備 文庫(kù)的篩選（篩庫(kù)）文庫(kù)的篩選（篩庫(kù)） 含目的基因的克隆含目的基因的克隆DNA文庫(kù)的構(gòu)建和目的基因3 基因文庫(kù)的分類 按照外源按照外源DNA片段的來源：片

6、段的來源： 從特定組織提取的染色體基因組從特定組織提取的染色體基因組DNA-基因基因組組DNA文庫(kù)文庫(kù) mRNA反轉(zhuǎn)錄成的反轉(zhuǎn)錄成的cDNA拷貝拷貝-cDNA文庫(kù)文庫(kù) DNA文庫(kù)的構(gòu)建和目的基因限制性限制性內(nèi)切酶內(nèi)切酶克隆、轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)、鑒定克隆、轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)、鑒定基因組基因組DNA基因文庫(kù)基因文庫(kù)DNA文庫(kù)的構(gòu)建和目的基因1)基因組文庫(kù)基因組文庫(kù) (Genomic library) ： 是指將某種生物體的全部基因組是指將某種生物體的全部基因組DNA用限用限制性內(nèi)切酶或機(jī)械力量切割成一定長(zhǎng)度范圍的制性內(nèi)切酶或機(jī)械力量切割成一定長(zhǎng)度范圍的DNA片段，再與合適的載體在體外重組并轉(zhuǎn)化片段，再與合適的載體

7、在體外重組并轉(zhuǎn)化相應(yīng)的宿主細(xì)胞獲得的所有陽(yáng)性菌落，這個(gè)群相應(yīng)的宿主細(xì)胞獲得的所有陽(yáng)性菌落，這個(gè)群體就稱為該生物基因組文庫(kù)。其目體就稱為該生物基因組文庫(kù)。其目 的是分離有的是分離有用的目的基因用的目的基因 和保存某種生物的全部基因。和保存某種生物的全部基因。2)cDNA文庫(kù) (cDNA library) ： 是指將某種生物體基因組轉(zhuǎn)錄的全部是指將某種生物體基因組轉(zhuǎn)錄的全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA片段分別與片段分別與克隆載體重組，儲(chǔ)存于某種受體菌中，克隆載體重組，儲(chǔ)存于某種受體菌中，該群體就稱該生物基因組的該群體就稱該生物基因組的cDNA文庫(kù)。文庫(kù)。 cDNA(compleme

8、ntary DNAcDNA(complementary DNA，互補(bǔ)，互補(bǔ)DNA)DNA)：是由生物的某一特定器官或特定發(fā)育時(shí)是由生物的某一特定器官或特定發(fā)育時(shí)期細(xì)胞內(nèi)的期細(xì)胞內(nèi)的mRNAmRNA經(jīng)體外反轉(zhuǎn)錄后形成的經(jīng)體外反轉(zhuǎn)錄后形成的互補(bǔ)互補(bǔ)DNADNA。DNA文庫(kù)的構(gòu)建和目的基因第一節(jié) 基因組基因組DNADNA文庫(kù)的構(gòu)建文庫(kù)的構(gòu)建一、基因組一、基因組DNA文庫(kù)的類型文庫(kù)的類型 根據(jù)所選用的載體可以分為：根據(jù)所選用的載體可以分為： 質(zhì)粒文庫(kù)、噬菌體文庫(kù)、粘粒文庫(kù)、質(zhì)粒文庫(kù)、噬菌體文庫(kù)、粘粒文庫(kù)、人工染色體文庫(kù)（細(xì)菌人工染色體文庫(kù)、人工染色體文庫(kù)（細(xì)菌人工染色體文庫(kù)、酵母人工染色體文庫(kù)）。酵母

9、人工染色體文庫(kù)）。DNA文庫(kù)的構(gòu)建和目的基因二、基因組二、基因組DNADNA文庫(kù)構(gòu)建的程序文庫(kù)構(gòu)建的程序 載體載體DNADNA的制備；的制備；高純度大相對(duì)分子質(zhì)量基因組高純度大相對(duì)分子質(zhì)量基因組DNADNA的提的提取和大片段的制備；取和大片段的制備；高純度大相對(duì)分子質(zhì)量基因組高純度大相對(duì)分子質(zhì)量基因組DNADNA的部的部分酶切與脈沖電泳分級(jí)分離；分酶切與脈沖電泳分級(jí)分離；載體與外源片段的連接與轉(zhuǎn)化或侵染載體與外源片段的連接與轉(zhuǎn)化或侵染宿主細(xì)胞；宿主細(xì)胞；重組克隆的挑選和保存。重組克隆的挑選和保存。DNA文庫(kù)的構(gòu)建和目的基因基因組DNA文庫(kù)限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶基因組DNA基因重組轉(zhuǎn)化細(xì)菌體外

10、包裝DNA文庫(kù)的構(gòu)建和目的基因三、原核生物基因組DNA文庫(kù)的構(gòu)建（一）原核生物基因組（一）原核生物基因組DNA的提取的提取 染色體染色體DNA 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA 要求：制備的要求：制備的DNA的長(zhǎng)度為的長(zhǎng)度為100-200kb， 防止在制備過程中的機(jī)械斷裂防止在制備過程中的機(jī)械斷裂DNA文庫(kù)的構(gòu)建和目的基因（二）基因組（二）基因組DNA的不完全酶切的不完全酶切1、根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇合適的限制性內(nèi)切酶、根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇合適的限制性內(nèi)切酶2、分離目的酶切片段大小的確定、分離目的酶切片段大小的確定 a) 克隆單個(gè)基因：克隆單個(gè)基因： 10 kb b) 克隆基因族：克隆基因族： 20kb3、DNA不完全酶

11、切條件的確定不完全酶切條件的確定 a) 確定限制酶用量，改變酶切時(shí)間確定限制酶用量，改變酶切時(shí)間 b) 固定酶切時(shí)間，改變限制酶的用量固定酶切時(shí)間，改變限制酶的用量DNA文庫(kù)的構(gòu)建和目的基因（三）酶切片段與克隆載體連接（三）酶切片段與克隆載體連接、酶切片段的分離與純化、酶切片段的分離與純化）透析袋電洗脫法透析袋電洗脫法 ）試劑盒回收目的片段）試劑盒回收目的片段DNA文庫(kù)的構(gòu)建和目的基因2、酶切片段與克隆載體連接克隆載體的選擇、酶切片段與克隆載體連接克隆載體的選擇 a）質(zhì)粒載體可承載）質(zhì)粒載體可承載15kb DNA左右片段左右片段 (有效有效的范圍為的范圍為10kb) b） 載體可承載載體可承載

12、25kb DNA左右片段左右片段(有效的有效的范圍為范圍為15 kb) c）Cosmid 載體可承載載體可承載45kb DNA左右片段左右片段(有有效的范圍為效的范圍為1平頭末端直接與載體連接，但插入的片段無平頭末端直接與載體連接，但插入的片段無法回收法回收22平頭兩端分別接同聚物尾，最好是平頭兩端分別接同聚物尾，最好是ATAT同聚物同聚物尾，這樣重組分子可通過加熱局部變性和尾，這樣重組分子可通過加熱局部變性和S1S1核酸酶處理回收插入片段核酸酶處理回收插入片段33加裝人工接頭引入酶切口，以便插入片段回加裝人工接頭引入酶切口，以便插入片段回收收DNA文庫(kù)的構(gòu)建和目的基因DNA文庫(kù)的構(gòu)建和目的基

13、因DNA文庫(kù)的構(gòu)建和目的基因DNA文庫(kù)的構(gòu)建和目的基因基因組基因組DNADNA文庫(kù)文庫(kù)cDNAcDNA文庫(kù)文庫(kù)二、基因組DNA文庫(kù)與cDNA文庫(kù)的比較DNA文庫(kù)的構(gòu)建和目的基因基因組基因組DNA文庫(kù)文庫(kù)c cDNA文庫(kù)文庫(kù)DNA文庫(kù)的構(gòu)建和目的基因1 基因組DNA文庫(kù)的優(yōu)點(diǎn) 相對(duì)于相對(duì)于cDNAcDNA文庫(kù)，基因組文庫(kù)的優(yōu)點(diǎn)：文庫(kù)，基因組文庫(kù)的優(yōu)點(diǎn)： cDNA克隆只能反映著克隆只能反映著mRNA的分子結(jié)構(gòu)，沒有包括的分子結(jié)構(gòu)，沒有包括基因組的間隔序列?；蚪M的間隔序列。 cDNA文庫(kù)中，不同克隆的分布狀態(tài)總是反映著文庫(kù)中，不同克隆的分布狀態(tài)總是反映著mRNA的分布狀態(tài)。的分布狀態(tài)。 從從cDN

14、A克隆中，不能克隆到非轉(zhuǎn)錄區(qū)段序列，不克隆中，不能克隆到非轉(zhuǎn)錄區(qū)段序列，不能用于研究基因編碼區(qū)外側(cè)調(diào)控序列的結(jié)構(gòu)與功能。能用于研究基因編碼區(qū)外側(cè)調(diào)控序列的結(jié)構(gòu)與功能。DNA文庫(kù)的構(gòu)建和目的基因2 cDNA2 cDNA文庫(kù)的主要優(yōu)點(diǎn)文庫(kù)的主要優(yōu)點(diǎn)cDNAcDNA文庫(kù)以文庫(kù)以mRNAmRNA為材料，特別適用于某些為材料，特別適用于某些RNARNA病毒等的基因組結(jié)構(gòu)研究及有關(guān)基因的病毒等的基因組結(jié)構(gòu)研究及有關(guān)基因的克隆分離?？寺》蛛x。cDNAcDNA文庫(kù)的篩選比較簡(jiǎn)單易行。文庫(kù)的篩選比較簡(jiǎn)單易行。每一個(gè)每一個(gè)cDNAcDNA文庫(kù)都含有一種文庫(kù)都含有一種mRNAmRNA序列，這序列，這樣在目的基因的選

15、擇中出現(xiàn)假陽(yáng)性的概率就樣在目的基因的選擇中出現(xiàn)假陽(yáng)性的概率就會(huì)比較低，由此選擇出來的陽(yáng)性克隆將會(huì)含會(huì)比較低，由此選擇出來的陽(yáng)性克隆將會(huì)含有目的基因。有目的基因。DNA文庫(kù)的構(gòu)建和目的基因cDNAcDNA文庫(kù)可用于在細(xì)菌中能進(jìn)行表達(dá)的文庫(kù)可用于在細(xì)菌中能進(jìn)行表達(dá)的基因的克隆，直接應(yīng)用于基因工程操作?；虻目寺?，直接應(yīng)用于基因工程操作。cDNAcDNA克隆還可用于真核細(xì)胞克隆還可用于真核細(xì)胞mRNAmRNA的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)和功能研究和功能研究。DNA文庫(kù)的構(gòu)建和目的基因第三節(jié) 基因文庫(kù)的篩選與鑒定 重組體重組體(recombinant(recombinant，轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子transformant)t

16、ransformant)：就是摻入或?qū)胪猓壕褪菗饺牖驅(qū)胪庠丛碊NADNA后獲得了新遺傳標(biāo)志的細(xì)菌細(xì)后獲得了新遺傳標(biāo)志的細(xì)菌細(xì)胞或其他受體細(xì)胞。胞或其他受體細(xì)胞。DNA文庫(kù)的構(gòu)建和目的基因1 表型篩選法表型篩選法(1)(1)抗藥性篩選抗藥性篩選: :這是利用載體這是利用載體DNADNA分子上分子上的抗藥性選擇標(biāo)記進(jìn)行的篩選方法。的抗藥性選擇標(biāo)記進(jìn)行的篩選方法。一、基因文庫(kù)的篩選DNA文庫(kù)的構(gòu)建和目的基因 (2)(2)插入失活篩選法插入失活篩選法 經(jīng)過上述抗藥性篩選獲得的大量轉(zhuǎn)經(jīng)過上述抗藥性篩選獲得的大量轉(zhuǎn)化子中既包括需要的重組子，也含有不化子中既包括需要的重組子，也含有不需要的非重組子。為了

17、進(jìn)一步篩選出重需要的非重組子。為了進(jìn)一步篩選出重組子，可利用質(zhì)粒載體的雙抗藥性進(jìn)行組子，可利用質(zhì)粒載體的雙抗藥性進(jìn)行再次篩選。再次篩選。 DNA文庫(kù)的構(gòu)建和目的基因抗藥性標(biāo)記選擇抗藥性標(biāo)記選擇( (插入失活法插入失活法) ) DNA文庫(kù)的構(gòu)建和目的基因(3)(3)顯色反應(yīng)選擇法顯色反應(yīng)選擇法(-(-互補(bǔ)法互補(bǔ)法) ) 將含有將含有-半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（LacZLacZ）的調(diào)控序列）的調(diào)控序列和氨基端（和氨基端（N N端）端）146146個(gè)氨基酸編碼序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化個(gè)氨基酸編碼序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至可編碼至可編碼-半乳糖苷酶羧基端（半乳糖苷酶羧基端（C C端）部分序列的端）部分序列的宿主細(xì)胞

18、中，可使各自無活性的片段實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)，融宿主細(xì)胞中，可使各自無活性的片段實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)，融為一體，產(chǎn)生具有酶學(xué)活性的蛋白，從而使轉(zhuǎn)化的為一體，產(chǎn)生具有酶學(xué)活性的蛋白，從而使轉(zhuǎn)化的宿主菌在含有宿主菌在含有IPTG/X-gal(IPTG/X-gal(異丙基異丙基-D-D-硫代半乳硫代半乳糖苷糖苷/5-/5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚吲哚-D-D-硫代半乳糖苷硫代半乳糖苷) )的培的培養(yǎng)基上產(chǎn)生藍(lán)色菌落，這種現(xiàn)象就稱為養(yǎng)基上產(chǎn)生藍(lán)色菌落，這種現(xiàn)象就稱為-互補(bǔ)?；パa(bǔ)。DNA文庫(kù)的構(gòu)建和目的基因 互互補(bǔ)補(bǔ)的的檢檢測(cè)測(cè)或或- -半半乳乳糖糖苷苷酶酶法法DNA文庫(kù)的構(gòu)建和目的基因DNA文庫(kù)的構(gòu)建和目的基因3 3

19、 菌落原位雜交法菌落原位雜交法 （colony in situ hybridizationcolony in situ hybridization）19751975年，年，M.GrunsteinM.Grunstein和和D.HosneseD.Hosnese根據(jù)檢根據(jù)檢測(cè)重組子測(cè)重組子DNADNA分子的核酸雜交技術(shù)原理，分子的核酸雜交技術(shù)原理，對(duì)對(duì)SouthernSouthern印跡技術(shù)作了一些修改，提出印跡技術(shù)作了一些修改，提出了菌落原位雜交技術(shù)。了菌落原位雜交技術(shù)。DNA文庫(kù)的構(gòu)建和目的基因DNA文庫(kù)的構(gòu)建和目的基因二、基因文庫(kù)的鑒定限制性核酸內(nèi)切酶分析限制性核酸內(nèi)切酶分析 當(dāng)載體與外源基因進(jìn)行連接時(shí)，都需當(dāng)載體與外源基因進(jìn)行連接時(shí)，都需要對(duì)其進(jìn)行酶切，而且這些內(nèi)切酶都是已要對(duì)其進(jìn)行酶切，而且這些內(nèi)切酶都是已知的，因此可以從初步篩選出來的陽(yáng)性重知的，因此可以從初步篩選出來的陽(yáng)