結(jié)直腸癌變各階段的全基因組外顯子測序結(jié)合數(shù)字化表達

1、結(jié)直腸癌變各階段的全基因組外顯子結(jié)直腸癌變各階段的全基因組外顯子測序結(jié)合數(shù)字化表達譜研究測序結(jié)合數(shù)字化表達譜研究楊柳浙江大學腫瘤研究所浙江大學教育部腫瘤預(yù)警與干預(yù)重點實驗室 腫瘤的形成過程腫瘤的形成過程發(fā)生了一系列基發(fā)生了一系列基因組遺傳變異，因組遺傳變異，包括體細胞突變、包括體細胞突變、基因組結(jié)構(gòu)變異基因組結(jié)構(gòu)變異和拷貝數(shù)改變等。和拷貝數(shù)改變等。研究背景NATURE|Vol 458|9 April 2009 結(jié)直腸獨特的病理過程（結(jié)直腸獨特的病理過程（正常粘膜腺瘤腺癌正常粘膜腺瘤腺癌）為腫瘤癌變過程研究提供了一個非常好的模型。為腫瘤癌變過程研究提供了一個非常好的模型。 新一代測序技術(shù)的發(fā)展，

2、從全基因組水平來分析新一代測序技術(shù)的發(fā)展，從全基因組水平來分析結(jié)腸腫瘤癌變各階段的基因譜圖成為可能。結(jié)腸腫瘤癌變各階段的基因譜圖成為可能。PNAS March 18, 2008 vol. 105 no. 11 42834288研究方法：正常腸粘膜組織腺瘤腺癌提取DNA、RNANimbleGen 2.1M Human Exome Array芯片捕獲全基因組外顯子 Illumina GA II 測序儀高通量測序 數(shù)字表達譜分析數(shù)據(jù)分析：單核苷酸變異，小片斷插入、缺失 ，突變基因GO/PATHWAY，差異基因Exome Capture SequencingN: 正常上皮A: 腺瘤T: 腺癌Male,

3、 66y Grading IIB, AdenocarcinomaNegative family cancer history研究材料：Summary of Exome-capture Data Normal mucosaAdenomaCarcinomaAverage sequencing depth on target23.00 60.48 58.20 Raw Data (Gb)2.76 6.94 6.93 Effective sequence on or near target (Gb)1.65 4.27 4.19 Total effective reads (Gb)29.65 74.03

4、75.40 Effective sequence on target (Gb)0.77 2.01 1.94 Coverage of target region98.00%99.00%98.90%Summary of SNV (directions) identified in adenoma and carcinoma of one CRC patientAdenoma versus normal mucosa Carcinoma versus normal mucosaTotalTotal SNVs445 720 1073Synonymous117301 384Missense320 410

5、 673 Nonsense358Readthrough548SNVs-Genes277321533Summary of Indels identified in adenoma and carcinoma of one CRC patientAdenoma versus normal mucosa Carcinoma versus normal mucosaTotalIndels10438431452CDS352298 483Intron576 451 796 3-UTR2020345-UTR16921Others7970118Summary of Digital Expression Pro

6、filing DataNormal mucosaAdenomaCarcinomaClean Tags (Gb)3.17 5.05 7.15 Unambiguous Tags Mapping to Gene (Gb)1.47 2.25 3.23 Unambiguous Tag-mapped Genes105831094811506Differential Expressed Genes/28653678Mutation - Differential Expressed Genes /2133The catalogue of SNVs and indels in adenoma and carci

7、noma of one CRC patientChromosomeSynonymous-coding SNV (green)Missense SNV (red)Nonsense SNV (mauve)Readthrough SNV (orchid)Insertion (violet)Deletion (yellow)AdenomaCarcinomaATA&TMutation spectrum of somatic substitution Mutation tendency of SNV in the sequential process of normal mucosa-adenom

8、a-carcinoma (N-A-C)Non-synonymous mutation-Genes in adenoma and carcinoma.Go analysis of common mutations genes in adenoma and carcinoma. Pathway analysis of common mutations genes in adenoma and carcinoma. KEGG pathway distributionl 外顯子編碼區(qū)大約占全基因組的外顯子編碼區(qū)大約占全基因組的1%左右，全外顯子組測序左右，全外顯子組測序可以更為有效地獲得腫瘤相關(guān)的功能

9、性突變信息?？梢愿鼮橛行У孬@得腫瘤相關(guān)的功能性突變信息。l 腫瘤組織具有高度異質(zhì)性特點，使用傳統(tǒng)的腫瘤組織具有高度異質(zhì)性特點，使用傳統(tǒng)的Sanger測序法所測序法所能檢測到的往往是高頻突變，因而采用能檢測到的往往是高頻突變，因而采用illumina GA 對腺瘤對腺瘤和腺癌進行和腺癌進行50以上的深度測序，從而可以檢測出在腫瘤發(fā)以上的深度測序，從而可以檢測出在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用的一些低頻突變。生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用的一些低頻突變。l 大多數(shù)結(jié)直腸癌的發(fā)生經(jīng)歷了一個特定的正常粘膜腺瘤大多數(shù)結(jié)直腸癌的發(fā)生經(jīng)歷了一個特定的正常粘膜腺瘤腺癌的病理過程，外顯子測序結(jié)果表明大部分位點的核苷酸腺癌的病

10、理過程，外顯子測序結(jié)果表明大部分位點的核苷酸變異呈累積性上升或下降，其變異頻率在腺癌中最為顯著。變異呈累積性上升或下降，其變異頻率在腺癌中最為顯著。l 在所有的突變類型中，在所有的突變類型中，C:GT:A突變無論在腺瘤還是癌組突變無論在腺瘤還是癌組織中的比例都居最高，其次是織中的比例都居最高，其次是T:AC:G突變類型，該現(xiàn)象突變類型，該現(xiàn)象在腺癌中尤為突出。在腺癌中尤為突出。總總 結(jié)結(jié)l 腺瘤和腺癌共有的腺瘤和腺癌共有的36個個SNV分布于分布于36個基因，其中個基因，其中11個基個基因與因與Cosmic發(fā)布的腫瘤相關(guān)突變基因有重合；同時僅有一發(fā)布的腫瘤相關(guān)突變基因有重合；同時僅有一個基因與

11、個基因與Vogelstein報道的腸癌相關(guān)的候選突變基因重合；報道的腸癌相關(guān)的候選突變基因重合；因而，我們既檢測到了以往研究中所報道的突變基因，也因而，我們既檢測到了以往研究中所報道的突變基因，也發(fā)現(xiàn)了許多新的突變基因及位點。發(fā)現(xiàn)了許多新的突變基因及位點。l 本研究包含了對癌前期病變腺瘤的分析，從而獲得癌前本研究包含了對癌前期病變腺瘤的分析，從而獲得癌前期病變中的獨特基因突變，以及在癌變中起主導(dǎo)作用的關(guān)期病變中的獨特基因突變，以及在癌變中起主導(dǎo)作用的關(guān)鍵基因突變。鍵基因突變。l 通過全基因組外顯子深度測序及數(shù)字化表達譜分析獲得的通過全基因組外顯子深度測序及數(shù)字化表達譜分析獲得的大量參與正常粘膜腺瘤腺癌病理過程的基因突變，產(chǎn)大量參與正常粘膜腺瘤腺癌病理