動物性食品中禽流感病毒檢驗

1、動物檢疫檢驗技術專業(yè)教學資源庫動物性食品中禽流感病毒檢驗動物性食品中禽流感病毒檢驗 知識目標：知識目標： 了解禽流感病毒的生物學特性了解禽流感病毒的生物學特性 掌握禽流感病毒檢驗方法掌握禽流感病毒檢驗方法 掌握禽流感病毒的衛(wèi)生評價與處理掌握禽流感病毒的衛(wèi)生評價與處理 能力目標：能力目標： 能對可疑病料進行采集及處理能對可疑病料進行采集及處理 能對禽流感病毒教學分離與鑒定能對禽流感病毒教學分離與鑒定動物檢疫檢驗技術專業(yè)教學資源庫動物性食品中禽流感病毒檢驗動物性食品中禽流感病毒檢驗禽流感病毒禽流感病毒n 禽流感（禽流感（AIAI）是由）是由A A型流感病毒引起的禽類的一種嚴重疾病。感染后型流感病毒

2、引起的禽類的一種嚴重疾病。感染后的家禽可表現(xiàn)亞臨診癥狀、輕度呼吸系統(tǒng)疾病、產蛋量降低或急性全的家禽可表現(xiàn)亞臨診癥狀、輕度呼吸系統(tǒng)疾病、產蛋量降低或急性全身致死性疾病。身致死性疾病。n 病毒廣泛分布于各種家禽和野禽。從遷徙水禽，尤其鴨中分離的病毒病毒廣泛分布于各種家禽和野禽。從遷徙水禽，尤其鴨中分離的病毒最多；流感在家禽中對火雞和雞的危害最嚴重。最多；流感在家禽中對火雞和雞的危害最嚴重。n 美國為撲滅美國為撲滅19831983年秋至年秋至19841984年暴發(fā)的禽流感（年暴發(fā)的禽流感（H H5 5N N2 2），花費高達），花費高達6 6千千萬美元。香港地區(qū)為撲滅萬美元。香港地區(qū)為撲滅19971

3、997年的禽流感（年的禽流感（H H5 5N N1 1）也付出了巨大代價）也付出了巨大代價，不僅使大批雞死亡，而且造成，不僅使大批雞死亡，而且造成1313人感染禽流感病毒并發(fā)病，其中人感染禽流感病毒并發(fā)病，其中4 4人死亡。我國人死亡。我國20052005年冬在很多地方也發(fā)生了禽流感疫情，嚴重影響了年冬在很多地方也發(fā)生了禽流感疫情，嚴重影響了禽肉產品的出口，給養(yǎng)殖業(yè)帶來很大損失。禽肉產品的出口，給養(yǎng)殖業(yè)帶來很大損失。動物檢疫檢驗技術專業(yè)教學資源庫動物性食品中禽流感病毒檢驗動物性食品中禽流感病毒檢驗n 禽流感（禽流感（AIAI）的潛伏期從幾個小時到幾天不等，其長短與病毒的致病）的潛伏期從幾個小時

4、到幾天不等，其長短與病毒的致病力高低，感染強度，傳播途徑和易感禽的種類有關。力高低，感染強度，傳播途徑和易感禽的種類有關。n 由由A A型禽流感病毒所引起的禽流感，因感染禽的種類、年齡、性別、并型禽流感病毒所引起的禽流感，因感染禽的種類、年齡、性別、并發(fā)感染情況及所感染毒株的毒力和其它環(huán)境因素等不同而表現(xiàn)出的癥發(fā)感染情況及所感染毒株的毒力和其它環(huán)境因素等不同而表現(xiàn)出的癥狀很不一致，癥狀可涉及呼吸道、消化道、生殖道及神經(jīng)系統(tǒng)。通常狀很不一致，癥狀可涉及呼吸道、消化道、生殖道及神經(jīng)系統(tǒng)。通常呈現(xiàn)體溫升高，精神沉郁，飲食欲減少，消瘦，母雞產蛋量下降。呼呈現(xiàn)體溫升高，精神沉郁，飲食欲減少，消瘦，母雞產

5、蛋量下降。呼吸道癥狀表現(xiàn)不一，如咳嗽、噴嚏、羅音、甚至呼吸困難。病雞流淚吸道癥狀表現(xiàn)不一，如咳嗽、噴嚏、羅音、甚至呼吸困難。病雞流淚，羽毛松亂，身體卷縮，頭和顏面部水腫、皮膚發(fā)紺（冠和肉垂），羽毛松亂，身體卷縮，頭和顏面部水腫、皮膚發(fā)紺（冠和肉垂），有神經(jīng)癥狀及下痢。以上這些癥狀可能單獨出現(xiàn)，或幾種同時出現(xiàn)。有神經(jīng)癥狀及下痢。以上這些癥狀可能單獨出現(xiàn)，或幾種同時出現(xiàn)。動物檢疫檢驗技術專業(yè)教學資源庫動物性食品中禽流感病毒檢驗動物性食品中禽流感病毒檢驗n 禽流感特征性病理變化為水腫、充血、出血。急性型典型禽流感特征性病理變化為水腫、充血、出血。急性型典型癥狀為心肌炎、心包炎，腺胃乳頭水腫、出血，肌

6、胃角質癥狀為心肌炎、心包炎，腺胃乳頭水腫、出血，肌胃角質層下出血，肌胃與腺胃交界處呈帶狀或環(huán)狀出血，呼吸道層下出血，肌胃與腺胃交界處呈帶狀或環(huán)狀出血，呼吸道有大量炎性分泌物或黃白色干酪樣壞死，氣管粘膜出血。有大量炎性分泌物或黃白色干酪樣壞死，氣管粘膜出血。 動物檢疫檢驗技術專業(yè)教學資源庫動物性食品中禽流感病毒檢驗動物性食品中禽流感病毒檢驗 一、生物學特性一、生物學特性n 流感病毒為正粘病毒科流感病毒屬的成流感病毒為正粘病毒科流感病毒屬的成員，根據(jù)核蛋白（員，根據(jù)核蛋白（NPNP）和基質蛋白（）和基質蛋白（MPMP）的不同可分為）的不同可分為A A、B B、和、和C C三個血清型三個血清型。A

7、A 型流感病毒能感染多種動物，包括型流感病毒能感染多種動物，包括人、禽、豬、馬、海豹等，人、禽、豬、馬、海豹等，B B型和型和C C型則型則主要感染人。而且主要感染人。而且A A型流感病毒的表面型流感病毒的表面糖蛋白比糖蛋白比B B型和型和C C型的變異性高。型的變異性高。n A A型禽流感病毒的型禽流感病毒的HAHA已發(fā)現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)1616種，種，NANA有有1010種，分別有種，分別有H1H11616，N1N11010命名。命名。動物檢疫檢驗技術專業(yè)教學資源庫動物性食品中禽流感病毒檢驗動物性食品中禽流感病毒檢驗將無菌有感染性雞胚囊液將無菌有感染性雞胚囊液1 1：1010稀釋后，靜脈接種稀釋后，

8、靜脈接種8 8只只4 48 8周齡易感雞周齡易感雞，每只，每只0.2mL0.2mL。接種后。接種后1010天內死亡率天內死亡率75%75%，為高致病性禽流感病毒。，為高致病性禽流感病毒。分離物符合上述標準后，其它雞群可依據(jù)流行病學、臨床癥狀及相同分離物符合上述標準后，其它雞群可依據(jù)流行病學、臨床癥狀及相同亞型血凝素抗體測定來確定是否為感染高致病性的禽流感病毒。亞型血凝素抗體測定來確定是否為感染高致病性的禽流感病毒。如果致病力試驗中致死率不足如果致病力試驗中致死率不足75%75%，或血凝素為，或血凝素為H5H5及及H7H7亞型的病毒，亞型的病毒，需要進一步的試驗和驗證。需要進一步的試驗和驗證。如

9、果分離的禽流感病毒只能致死如果分離的禽流感病毒只能致死8 8只中的只中的1 15 5只，但能在沒有胰蛋酶只，但能在沒有胰蛋酶存在的細胞培養(yǎng)物上生長并能產生細胞病變（存在的細胞培養(yǎng)物上生長并能產生細胞病變（CPECPE）或形成蝕斑，則）或形成蝕斑，則必須先測定其必須先測定其HAHA相關多肽的氨基酸序列后才能宣布該分離物是否為高相關多肽的氨基酸序列后才能宣布該分離物是否為高致病性毒株。致病性毒株。鑒定分離株是否為高致病性禽流感（鑒定分離株是否為高致病性禽流感（HPAIHPAI）及是否執(zhí)行撲滅計劃）及是否執(zhí)行撲滅計劃動物檢疫檢驗技術專業(yè)教學資源庫動物性食品中禽流感病毒檢驗動物性食品中禽流感病毒檢驗

10、病毒形態(tài)病毒形態(tài)n 甲型流感病毒呈多形性，其中球形直徑甲型流感病毒呈多形性，其中球形直徑8080120nm120nm，有囊膜。基，有囊膜?；蚪M為分節(jié)段因組為分節(jié)段 單股負鏈單股負鏈RNARNA。依據(jù)其外膜血凝素（。依據(jù)其外膜血凝素（H H）和神經(jīng)氨）和神經(jīng)氨酸酶（酸酶（N N）蛋白抗原性的不同，目前可分為）蛋白抗原性的不同，目前可分為1616個個H H亞型（亞型（H1H1H16H16）和）和9 9個個N N亞型（亞型（N1N1N9N9）。感染人的禽流感病毒亞型主要為）。感染人的禽流感病毒亞型主要為H5N1H5N1、H9N2H9N2、H7N7H7N7，其中感染，其中感染H5N1H5N1的患者病

11、情重，病死率高。的患者病情重，病死率高。n 研究表明，原本為低致病性禽流感病毒株（研究表明，原本為低致病性禽流感病毒株（H5N2H5N2、H7N7H7N7、H9N2H9N2），可經(jīng)），可經(jīng)6 69 9個月禽間流行的迅速變異而成為高致病性毒株（個月禽間流行的迅速變異而成為高致病性毒株（H5N1H5N1）。）。動物檢疫檢驗技術專業(yè)教學資源庫動物性食品中禽流感病毒檢驗動物性食品中禽流感病毒檢驗流感病毒流感病毒HA 血凝素纖突血凝素纖突NA 神經(jīng)氨酸酶神經(jīng)氨酸酶動物檢疫檢驗技術專業(yè)教學資源庫動物性食品中禽流感病毒檢驗動物性食品中禽流感病毒檢驗n 禽流感病毒對乙醚、氯仿、丙酮等有機溶劑均敏感。常用消毒劑

12、容易禽流感病毒對乙醚、氯仿、丙酮等有機溶劑均敏感。常用消毒劑容易將其滅活，如氧化劑、稀酸、十二烷基硫酸鈉、鹵素化合物（如漂白將其滅活，如氧化劑、稀酸、十二烷基硫酸鈉、鹵素化合物（如漂白粉和碘劑）等都能迅速破壞其傳染性。粉和碘劑）等都能迅速破壞其傳染性。n 禽流感病毒對熱比較敏感，禽流感病毒對熱比較敏感，6565加熱加熱30min30min或煮沸（或煮沸（100100 ）2min2min以以上可滅活。病毒在糞便中可存活上可滅活。病毒在糞便中可存活1 1周，在水中可存活周，在水中可存活1 1個月，在個月，在pHpH4.14.1的條件下也具有存活能力。病毒對低抗溫抵力較強，在有甘油保的條件下也具有存

13、活能力。病毒對低抗溫抵力較強，在有甘油保護的情況下可保持活力護的情況下可保持活力1 1年以上。年以上。n 病毒在直射陽光下病毒在直射陽光下404048h48h即可滅活，如果用紫外線直接照射，可迅即可滅活，如果用紫外線直接照射，可迅速破壞其傳染性。速破壞其傳染性。抵抗力抵抗力動物檢疫檢驗技術專業(yè)教學資源庫動物性食品中禽流感病毒檢驗動物性食品中禽流感病毒檢驗二、檢驗二、檢驗病毒的鑒定血清學試驗結果報告病原的分離動物檢疫檢驗技術專業(yè)教學資源庫動物性食品中禽流感病毒檢驗動物性食品中禽流感病毒檢驗1.1.病原的分離病原的分離n 病毒分離：病毒分離：AIAI的診斷通常是要靠病原的分離及病毒血清型和亞型的鑒

14、的診斷通常是要靠病原的分離及病毒血清型和亞型的鑒定。通常情況下，禽類只感染定。通常情況下，禽類只感染A A型流感病毒。型流感病毒。病料采集：病料采集：病毒常在呼吸道和病毒常在呼吸道和/ /或消化道中復制增殖，所以采集病料或消化道中復制增殖，所以采集病料多從氣管或泄殖腔中采集。多從氣管或泄殖腔中采集。方法：方法：以棉花或其它材料制成的拭子采集病料樣品，放入加抗生素的以棉花或其它材料制成的拭子采集病料樣品，放入加抗生素的無菌培養(yǎng)液中。無菌培養(yǎng)液中。保存：保存：最好低溫（最好低溫（44）或）或-70-70保存，以液態(tài)氮或干冰較好。病料樣保存，以液態(tài)氮或干冰較好。病料樣品在保存或運送前可先行處理，制成

15、品在保存或運送前可先行處理，制成10%10%的懸液，并進行低速離心澄的懸液，并進行低速離心澄清。清。動物檢疫檢驗技術專業(yè)教學資源庫動物性食品中禽流感病毒檢驗動物性食品中禽流感病毒檢驗n 病毒的培養(yǎng)：病毒的培養(yǎng)：通常用于病毒分離的材料是雞胚（通常用于病毒分離的材料是雞胚（應該用應該用SPFSPF雞胚），雞胚細胞培養(yǎng)物雞胚），雞胚細胞培養(yǎng)物也可供病毒增殖。取也可供病毒增殖。取0.1mL0.1mL處理好的處理好的病料，以尿囊腔途徑接種病料，以尿囊腔途徑接種9 91111日齡日齡的雞胚，可同時羊膜腔接種以增加的雞胚，可同時羊膜腔接種以增加病毒增殖的可能性。病毒增殖的可能性。一般來說，如果樣品中有病毒存

16、在一般來說，如果樣品中有病毒存在，初次傳代后就足以產生紅細胞凝，初次傳代后就足以產生紅細胞凝集作用。如果未檢測到血凝活性，集作用。如果未檢測到血凝活性，需將收獲的雞胚囊液再傳一代。需將收獲的雞胚囊液再傳一代。動物檢疫檢驗技術專業(yè)教學資源庫動物性食品中禽流感病毒檢驗動物性食品中禽流感病毒檢驗n 在病毒的分離和鑒定的同時，常在病毒的分離和鑒定的同時，常常要做病原的致病性試驗，以確常要做病原的致病性試驗，以確定所分離毒株是強毒株還是非致定所分離毒株是強毒株還是非致病株或低致病株。盡管體外試驗病株或低致病株。盡管體外試驗可以獲得一些有關致病力的數(shù)據(jù)可以獲得一些有關致病力的數(shù)據(jù)。但用動物作攻毒試驗來確定

17、病。但用動物作攻毒試驗來確定病毒的性質特性是必要的，這也是毒的性質特性是必要的，這也是推薦的標準。推薦的標準。動物檢疫檢驗技術專業(yè)教學資源庫動物性食品中禽流感病毒檢驗動物性食品中禽流感病毒檢驗n 用于病毒鑒定的標準方法是以雞紅細胞檢測胚液的血凝活性，用于病毒鑒定的標準方法是以雞紅細胞檢測胚液的血凝活性，常量法和微量法都可使用。常量法和微量法都可使用。n 確定尿囊液或其它胚液的血凝活性后，還要鑒別是否由副粘病確定尿囊液或其它胚液的血凝活性后，還要鑒別是否由副粘病毒雞新城疫病毒（毒雞新城疫病毒（NDVNDV）所致。因此，首先要用）所致。因此，首先要用NDND抗血清作抗血清作HIHI試驗，以排除試驗

18、，以排除NDVNDV的可能性。如果的可能性。如果NDV HINDV HI陰性，才可以進行下陰性，才可以進行下一步工作，即確定一步工作，即確定A A型流感病毒型流感病毒NPNP抗原的存在?？捎醚鍖W方抗原的存在?？捎醚鍖W方法，如雙向擴散、免疫電泳或單輻射溶血試驗等方式來檢測型法，如雙向擴散、免疫電泳或單輻射溶血試驗等方式來檢測型特異性的核心抗原特異性的核心抗原NPNP或或MPMP。A A型流感病毒都具有相同的型特異型流感病毒都具有相同的型特異性抗原。性抗原。2.2.病原的鑒定病原的鑒定動物檢疫檢驗技術專業(yè)教學資源庫動物性食品中禽流感病毒檢驗動物性食品中禽流感病毒檢驗血凝試驗與血凝抑制試驗瓊脂凝

19、膠擴散試驗3.3.生物學試驗生物學試驗動物檢疫檢驗技術專業(yè)教學資源庫動物性食品中禽流感病毒檢驗動物性食品中禽流感病毒檢驗血凝試驗原理血凝試驗原理n 有些病毒的表面有血凝素，有些病毒的表面有血凝素，能與某些動物的紅細胞表面能與某些動物的紅細胞表面受體結合，從而出現(xiàn)紅細胞受體結合，從而出現(xiàn)紅細胞凝集現(xiàn)象，稱為病毒的血凝凝集現(xiàn)象，稱為病毒的血凝現(xiàn)象，簡稱病毒的血凝?，F(xiàn)象，簡稱病毒的血凝。病毒病毒紅細胞紅細胞動物檢疫檢驗技術專業(yè)教學資源庫動物性食品中禽流感病毒檢驗動物性食品中禽流感病毒檢驗動物檢疫檢驗技術專業(yè)教學資源庫動物性食品中禽流感病毒檢驗動物性食品中禽流感病毒檢驗血凝抑制試驗原理血凝抑制試驗原理

20、n 當病毒與相應的抗病毒抗當病毒與相應的抗病毒抗體結合后，能使紅細胞的體結合后，能使紅細胞的凝集現(xiàn)象受到抑制，為病凝集現(xiàn)象受到抑制，為病毒血凝抑制現(xiàn)象，簡稱病毒血凝抑制現(xiàn)象，簡稱病毒的血凝抑制。毒的血凝抑制。有其受體的紅有其受體的紅細胞細胞 v血凝性血凝性病毒病毒 特異性抗體特異性抗體 非特異性抗體非特異性抗體 動物檢疫檢驗技術專業(yè)教學資源庫動物性食品中禽流感病毒檢驗動物性食品中禽流感病毒檢驗vvvvvvvvvvvv當當病病毒毒遇遇到到特特異異性性抗抗體體時時當當病病毒毒遇遇到到非非特特異異性性抗抗體體時時動物檢疫檢驗技術專業(yè)教學資源庫動物性食品中禽流感病毒檢驗動物性食品中禽流感病毒檢驗瓊脂擴

21、散試驗瓊脂擴散試驗n 抗原制備：抗原制備：抗原可用標準株或已知毒株自行制備。一般都采集有抗原可用標準株或已知毒株自行制備。一般都采集有血凝活性的雞胚絨毛尿囊膜（血凝活性的雞胚絨毛尿囊膜（CAMCAM），用），用pH7.2pH7.2磷酸鹽緩沖液沖洗磷酸鹽緩沖液沖洗CAMCAM后，吸干，磨碎，凍融后，吸干，磨碎，凍融3 3次或超聲波處理，再低速離心，取上次或超聲波處理，再低速離心，取上清液加入甲醛（至終濃度清液加入甲醛（至終濃度0.1%0.1%），），3737滅活滅活3636小時，即可應用。小時，即可應用。n 瓊脂板制備瓊脂板制備 n 加樣：加樣：中心孔加待檢抗原，周圍孔加入各型標準陽性血清，各孔

22、中心孔加待檢抗原，周圍孔加入各型標準陽性血清，各孔加滿止。將瓊脂板放濕盒中，加蓋后放在室溫或加滿止。將瓊脂板放濕盒中，加蓋后放在室溫或3737溫箱中自然溫箱中自然擴散。擴散。動物檢疫檢驗技術專業(yè)教學資源庫動物性食品中禽流感病毒檢驗動物性食品中禽流感病毒檢驗n 觀察與結果判定：觀察與結果判定：擴散擴散2424小小時后，可將平皿放于暗視野時后，可將平皿放于暗視野箱上或借自然光進行觀察，箱上或借自然光進行觀察，5 57 7天最后判定。當被檢抗原天最后判定。當被檢抗原與某一標準血清一致時，在與某一標準血清一致時，在抗原與相應血清之間出現(xiàn)灰抗原與相應血清之間出現(xiàn)灰白色的沉淀線，此時根據(jù)標白色的沉淀線，此

23、時根據(jù)標準血清型別，便可確定被檢準血清型別，便可確定被檢抗原中口蹄疫病毒的型別?？乖锌谔阋卟《镜男蛣e。白色沉淀線白色沉淀線動物檢疫檢驗技術專業(yè)教學資源庫動物性食品中禽流感病毒檢驗動物性食品中禽流感病毒檢驗4.4.報告結果報告結果n 綜合以上試驗結果，報告檢樣單位中檢出或未檢出禽流感病綜合以上試驗結果，報告檢樣單位中檢出或未檢出禽流感病毒。毒。動物檢疫檢驗技術專業(yè)教學資源庫動物性食品中禽流感病毒檢驗動物性食品中禽流感病毒檢驗三、衛(wèi)生評價與處理三、衛(wèi)生評價與處理n 發(fā)生高致病性禽流感時，要根據(jù)發(fā)生高致病性禽流感時，要根據(jù)高致病性禽流感防治技高致病性禽流感防治技術規(guī)范術規(guī)范要求和相關法律法規(guī)嚴格執(zhí)行封鎖、隔離、消毒要求和相關法律法規(guī)嚴格執(zhí)行封鎖、隔離、消毒和焚毀病雞群及尸體等綜合性防制措施。及時確診，鑒定和焚毀病雞群及尸體等綜合性防制措施。及時確診，鑒定病毒的毒力和致病性。確診后立即封鎖和隔離疫區(qū)，并上病毒的毒力和致病性。確診后立即封鎖和隔離疫區(qū)，并上報有關部門。報有關部門。動物檢疫檢驗技術專業(yè)教學資源庫動物性食品中禽流感病毒檢驗動物性食品中禽流感病毒檢驗三、衛(wèi)生評價與處理三、衛(wèi)生評價與處理n 劃定疫區(qū)，嚴格封鎖，對劃入控制區(qū)的禽場密切監(jiān)視，清除和撲殺所劃定疫區(qū)，嚴格封鎖，對劃入控制區(qū)的禽場密切監(jiān)視，清除和撲殺所有感染高致病性禽流感的禽、禽產品、廢物雜物、糞便、飼料和設備有感染高