大腸桿菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定1

1、大腸桿菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定大腸桿菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定授課教師授課教師: : 孫教授孫教授研研 究究 生生: : 何何 李李 何何 張張 目的要求目的要求1、通過(guò)光密度值的測(cè)量了解大腸桿菌的生 長(zhǎng)規(guī)律，繪制生長(zhǎng)曲線。2、了解光電比濁法測(cè)量細(xì)菌數(shù)量的原理。細(xì)菌數(shù)量的原理。 基本原理 將一定量的細(xì)菌接種到將一定量的細(xì)菌接種到恒容積恒容積的液體培養(yǎng)基的液體培養(yǎng)基中，在適宜的培養(yǎng)條件下，該群體就會(huì)有規(guī)律的中，在適宜的培養(yǎng)條件下，該群體就會(huì)有規(guī)律的增長(zhǎng)。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以細(xì)胞數(shù)目的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以細(xì)胞數(shù)目的對(duì)數(shù)或生長(zhǎng)速率為縱坐標(biāo)作圖所繪制的曲線稱(chēng)為該細(xì)或生長(zhǎng)速率為縱坐標(biāo)作圖所繪制的曲線稱(chēng)為該細(xì)

2、菌的生長(zhǎng)曲線。該曲線包括四個(gè)階段：延滯期、菌的生長(zhǎng)曲線。該曲線包括四個(gè)階段：延滯期、指數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期。指數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期。 本實(shí)驗(yàn)采用分光光度計(jì)進(jìn)行光電比濁本實(shí)驗(yàn)采用分光光度計(jì)進(jìn)行光電比濁測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間細(xì)菌懸浮液的測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間細(xì)菌懸浮液的光密度光密度值，值，繪制生長(zhǎng)曲線。繪制生長(zhǎng)曲線。光吸收的基本定律：光吸收的基本定律：朗伯比耳定律朗伯比耳定律A=kbc (k為摩爾吸光系數(shù)，b為液層厚度，c為溶液濃度)朗伯比耳定律的意義是：當(dāng)一束平行單色光通過(guò)均勻、非散射的溶液時(shí)，其吸光度與溶液濃度和液層厚度的乘積成正比。FeSO4溶液在溶液在650nm的的光吸收曲線光吸收曲線大腸桿菌懸浮液的

3、光吸收規(guī)律：實(shí)驗(yàn)表明，實(shí)驗(yàn)表明，OD600在在0.1 0.65之內(nèi)的之內(nèi)的大腸桿菌懸浮液基本符合大腸桿菌懸浮液基本符合朗朗伯比耳定律，即吸光度與菌液濃度成正比。伯比耳定律，即吸光度與菌液濃度成正比。大腸桿菌梯度稀釋液的大腸桿菌梯度稀釋液的光吸收曲線光吸收曲線 器器 材材 1 1、菌、菌 種：大腸桿菌。種：大腸桿菌。 2 2、培養(yǎng)基：、培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基。 3 3、儀器與耗材：、儀器與耗材：722型分光光度計(jì)、恒溫?fù)u型分光光度計(jì)、恒溫?fù)u 床、無(wú)菌試管、無(wú)菌吸管。床、無(wú)菌試管、無(wú)菌吸管。操作步驟操作步驟 1、配制、配制LB液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基100 ml，分裝，分裝2個(gè)個(gè)250 m

4、l的三角瓶，的三角瓶，一瓶一瓶 55ml，一瓶，一瓶45ml，121滅菌滅菌20min。 2、取、取11支無(wú)菌大試管，用記號(hào)筆分別標(biāo)明培養(yǎng)時(shí)間，支無(wú)菌大試管，用記號(hào)筆分別標(biāo)明培養(yǎng)時(shí)間，即即0、1.5、 3、4、6、8、10、12、14、16和和20 h。 3、用、用5 ml無(wú)菌吸管取無(wú)菌吸管取2.5 ml大腸桿菌培養(yǎng)液大腸桿菌培養(yǎng)液(培養(yǎng)培養(yǎng)12h)轉(zhuǎn)入裝有轉(zhuǎn)入裝有 55ml LB液體培養(yǎng)基的三角瓶?jī)?nèi)，混勻后分別取液體培養(yǎng)基的三角瓶?jī)?nèi)，混勻后分別取5ml混合液放混合液放 入上述標(biāo)記的入上述標(biāo)記的11支無(wú)菌大試管中。支無(wú)菌大試管中。 4、將已接種的試管置搖床、將已接種的試管置搖床37振蕩培養(yǎng)振蕩

5、培養(yǎng)(200 rpm)，在相應(yīng)時(shí)間，在相應(yīng)時(shí)間 取出試管放于冰箱中，最后一同測(cè)定取出試管放于冰箱中，最后一同測(cè)定OD600值。值。 5、進(jìn)行光密度測(cè)定時(shí)，以未接種的、進(jìn)行光密度測(cè)定時(shí)，以未接種的LB液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照，液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照， 從早取出的培養(yǎng)液開(kāi)始依次測(cè)定，細(xì)胞密度大的培養(yǎng)液用從早取出的培養(yǎng)液開(kāi)始依次測(cè)定，細(xì)胞密度大的培養(yǎng)液用LB 液體培養(yǎng)基稀釋后測(cè)定，使液體培養(yǎng)基稀釋后測(cè)定，使OD600值在值在0.1 0.65之內(nèi)。之內(nèi)。不同培養(yǎng)時(shí)間的菌不同培養(yǎng)時(shí)間的菌液液注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)： 選用規(guī)格一致的試管；選用規(guī)格一致的試管； 每支試管的裝液量應(yīng)相同每支試管的裝液量應(yīng)相同(5 ml/支支)； 混勻的菌懸液加入到比色皿后應(yīng)迅速讀取混勻的菌懸液加入到比色皿后應(yīng)迅速讀取OD值；值； 保護(hù)比色皿透光面不受磨損，不要用手指直接接觸；保護(hù)比色皿透光面不受磨損，不要用手指直接接觸； 分光光度計(jì)在未測(cè)樣品時(shí)應(yīng)及時(shí)打開(kāi)蓋。分光光度計(jì)在未測(cè)樣品時(shí)應(yīng)及時(shí)打開(kāi)蓋。實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、將測(cè)定的2、繪制大腸桿菌的生長(zhǎng)