淺談轉(zhuǎn)基因技術(shù)在農(nóng)作物抗蟲研究上的應(yīng)用

1、·生物技術(shù)在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用論文·題目：淺談轉(zhuǎn)基因技術(shù)在農(nóng)作物抗蟲研究上的應(yīng)用論文提綱一、國內(nèi)外的研究進(jìn)展 1.1國外的研究情況 1.2我國的研究現(xiàn)狀2、 轉(zhuǎn)基因技術(shù)在農(nóng)作物抗蟲研究上的應(yīng)用 2.1.蘇云金桿菌毒蛋白基因 2.1.1概述 2.1.2機(jī)理及應(yīng)用 2.2植物凝集素基因 2.2.1概述 2.2.2機(jī)理及應(yīng)用 2.3蛋白酶抑制劑基因 2.3.1概述機(jī)理及應(yīng)用三、結(jié)論與展望 3.1結(jié)論 3.2展望淺談轉(zhuǎn)基因技術(shù)在農(nóng)作物抗蟲研究上的應(yīng)用【摘要】隨著轉(zhuǎn)基因植物商品化進(jìn)程的不斷加深，轉(zhuǎn)基因植物的發(fā)展前景也越來越來起人們的關(guān)注，本文筆者于植物抗蟲基因工程在國內(nèi)外的進(jìn)展情況的基礎(chǔ)上

2、，就轉(zhuǎn)基因技術(shù)在農(nóng)作物抗蟲研究上的應(yīng)用進(jìn)行探討研究?！娟P(guān)鍵詞】轉(zhuǎn)基因技術(shù) 抗蟲機(jī)理 基因蟲害嚴(yán)重影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，制約農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的穩(wěn)定發(fā)展。長期以來人們普遍采用化學(xué)殺蟲劑來控制害蟲，但隨著時間的推移尤其是化學(xué)農(nóng)藥的大量、不合理的使用，帶來了如農(nóng)藥殘留、害蟲產(chǎn)生抗藥性、殺滅天敵等自然生態(tài)平衡被破壞、環(huán)境污染的嚴(yán)重問題。利用植物抗蟲基岡工程培育的抗蟲作物，可以避免害蟲危害，還具有成本低、保護(hù)全、特異性強(qiáng)等優(yōu)點，從而倍受關(guān)注，成為當(dāng)前農(nóng)業(yè)生物工程研究的一個熱點。植物抗蟲基因工程是植物基因工程中最為重要的研究內(nèi)容之一。自從l987年比利時植物遺傳所的Vaeck等AYI首先報道了外源抗蟲

3、基閣轉(zhuǎn)入炯草，隨后Barton等和美國孟山都公司的Fishhoff等人也都報道了他們獲得抗蟲轉(zhuǎn)基因煙草和番茄植株的研究，由此開創(chuàng)了植物抗蟲育種的新領(lǐng)域。目前已有多種植物抗蟲基因在煙草、水稻、玉米、棉花、馬鈴薯等多種作物上獲得了轉(zhuǎn)基因抗蟲植株，有的已申請到田間釋放和商品化生產(chǎn)。本文筆者于植物抗蟲基因工程在國內(nèi)外的進(jìn)展情況的基礎(chǔ)上，就轉(zhuǎn)基因技術(shù)在農(nóng)作物抗蟲研究上的應(yīng)用進(jìn)行探討研究。一、國內(nèi)外的研究進(jìn)展 1.1國外的研究情況 1987年比利時科學(xué)家首次成功地將Bt毒蛋白基因?qū)藷煵菀詠恚D(zhuǎn)基因抗蟲植物的研究日新月異、碩果累累。迄今為止，得到的抗蟲轉(zhuǎn)基因植物種類已達(dá)25種以上，有的已進(jìn)入商品化生產(chǎn)1。

4、根據(jù)它們的來源，已克隆得到的抗蟲基因可分為三類：第一類是從細(xì)菌中分離出來的抗蟲基因，主要是蘇云金桿菌殺蟲結(jié)晶蛋白(Bt)基因；第二類是從植物組織中分離出的抗蟲基因，主要為蛋白酶抑制劑基因、淀粉酶抑制劑基因、外源凝集素基因(Lec)等，應(yīng)用最廣泛的是豇豆胰蛋白酶抑制劑基因(CpTI)；第三類是從動物體內(nèi)分離的毒素基因，主要有蝎毒素基因和蜘蛛毒素基因等2。 1.2我國的研究現(xiàn)狀 在報道了首例有關(guān)轉(zhuǎn)Bt基因煙草和番茄的研究后，Bt基因被相繼轉(zhuǎn)入到棉花、水稻、玉米、蘋果和核桃等作物中，目前已經(jīng)有6O多種Bt基因被報道。美國用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Bt基因?qū)霘ぷ衙?，育成世界上首例抗蟲棉，棉鈴蟲為害率下降5O。

5、1996年美國Bt基因抗蟲棉種植面積72萬hm，約占總植棉面積143。我國是繼美國后育成抗蟲轉(zhuǎn)基因棉的第二個國家，育成中國第一代單價抗蟲棉的抗蟲性在9O 以上，減少用藥6O 8O，增產(chǎn)3O4O 4。1992年底中國農(nóng)科院生物技術(shù)研究中心的郭三堆等5 人在國內(nèi)首先人工合成了Bt基因之后，又對豇豆胰蛋白酶抑制劑(CpTI)基因進(jìn)行了修飾，構(gòu)建了同時帶有這兩種基因的雙價殺蟲基因高效植物表達(dá)載體，再通過花粉管通道轉(zhuǎn)化技術(shù)導(dǎo)入我國不同棉花生產(chǎn)區(qū)的主栽品種，已獲得了數(shù)十個雙價轉(zhuǎn)基因抗蟲棉株系。雙價抗蟲轉(zhuǎn)基因棉花研制成功并大面積進(jìn)入田間試驗，目前在國外尚未見報道，標(biāo)志著我國在抗蟲棉的研究方面已達(dá)到了國際先進(jìn)

6、水平。 二、轉(zhuǎn)基因技術(shù)在農(nóng)作物抗蟲研究上的應(yīng)用 2.1.蘇云金桿菌毒蛋白基因 2.1.1概述 蘇云金芽孢桿菌(研)晶體蛋白基因，克隆于蘇云金芽孢桿菌。蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)是一種革蘭氏陽性菌，分類上屬原核生物，細(xì)菌綱，芽孢桿菌科，芽孢桿菌屬，廣泛存在于土壤、塵埃、水域、沙漠、植被、昆蟲尸體中。Bt殺蟲晶體蛋白是蘇云金芽孢桿菌在芽孢形成過程中產(chǎn)生的。德國科學(xué)家Berliner最早從患病地中海螟中分離到了這種芽孢桿菌，并命名為“ Bacillus thuringiensis n.sp.。蘇云金芽孢桿菌可產(chǎn)生對鱗翅目(Lepidopterans)、鞘翅目(Col

7、eopterans)和雙翅目(Dipterans)等作物害蟲有毒性的伴孢結(jié)晶蛋白質(zhì)(Kozicl M G etal，1993)。由于Bt殺蟲蛋白對不同的昆蟲具有很強(qiáng)的專一性和高度選擇性，對植物、人畜無害。據(jù)統(tǒng)計已有60多種Bt基因被報道，根據(jù)它們的殺蟲范圍和基因序列的同源性可大致分為六大類，即Cryl、cry2、Cry3、Cry4、Cry5和Cyt，每一類又包含有不同的亞基，前五類稱為晶體蛋白基因家族(Crystal Protein Coden Gene)，第六類稱為細(xì)胞外溶解性晶體蛋白基因(Cytolytic ProteinCoden Gene)。 2.1.2機(jī)理及應(yīng)用 從基因結(jié)構(gòu)來說，由于

8、蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白來源于原核生物，在基因結(jié)構(gòu)上同真核生物有著顯著的區(qū)別，在轉(zhuǎn)入植株后，在基因的表達(dá)上存在著不穩(wěn)定的因素，表現(xiàn)為不表達(dá)或表達(dá)極弱等，故植株表現(xiàn)為抗性很弱或無抗性。研究發(fā)現(xiàn)在不改變表達(dá)蛋白結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，根據(jù)植物偏愛，適當(dāng)?shù)膶幋a蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白基因進(jìn)行改造后，在植物的表達(dá)效率大大的改善。后來，研究者采用完全改變基因結(jié)構(gòu)的方法(如，G+C的含量有原來的37提高到49 ；18個Polv(A)序列減少到1個；ATTTA序列由13個減為零等)使基因結(jié)構(gòu)完全符合植物的基因結(jié)構(gòu)，結(jié)果得到了表達(dá)量可觀的轉(zhuǎn)化植株6。有趣的是，新近克隆的Crv1 la5基因可不經(jīng)改造而在植株中高效表達(dá)7，

9、這一發(fā)現(xiàn)引起了科研工作者的極大興趣，具有特殊的意義。 2.2植物凝集素基因 2.2.1概述Lectin是一種含有非催化結(jié)構(gòu)域并能可逆結(jié)合到特異單糖或寡糖上的植物保守性(糖)蛋白，主要存在于很多植物的種子和營養(yǎng)組織中。自1988年Stillmark在蓖麻中發(fā)現(xiàn)一種蛋白酶細(xì)胞凝集因子以來，人們已經(jīng)分離了幾百種凝集素，并研究了其生化結(jié)構(gòu)和功能，同時還克隆了許多凝集素基因。目前成功應(yīng)用于植物抗蟲基因工程的凝集素基因有：雪花蓮凝集素(GNA)基因，豌豆凝集素(PLec)基因，麥胚凝集素(WGA)基因，半夏凝集素(PTA)基因。有人研究發(fā)現(xiàn)稻胚凝集素可以與N一乙酰葡萄胺專化結(jié)合，具有同WGA相似的抗蟲性。

10、我國王亦菲(2ooo)以普通水稻為模板，擴(kuò)增出了凝集素基因。部分凝集素對哺乳動物也有顯著毒害，如WGA、PTA，這樣就使得這些凝集素不適于轉(zhuǎn)基因。而GNA對哺乳動物毒害較小，因此大部分工作就集中在了GNA基因的轉(zhuǎn)化研究上，迄今為止GNA基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入到馬鈴薯、番茄、煙草、萵苣等9種作物。研究證明GNA對刺吸式口器的昆蟲如蚜蟲、褐飛虱等同翅目及線蟲有特效，對咀嚼式口器也有中等毒殺作用82.2.2機(jī)理及應(yīng)用 凝集素是植物界普遍存在的一類保守性很強(qiáng)的蛋白質(zhì)，在植物體內(nèi)有著特殊的生理功能。從現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基岡植物的抗蟲性來看，禾本科中典型的植物凝集素麥胚凝集素(WGA)，對歐洲玉米螟有良好的抗性，并且KSPo

11、well等人將WGA以0.1(wv)飼喂稻褐飛虱(Nilapaveta lugens)超過24h，同對照相比蜜汁滴數(shù)顯著降低了54，盡管平均喂WGA的昆蟲分泌蜜汁體積小于對照，但差異并不 著(cp>O.05)；雪蓮花凝集素(GNA)對蚜蟲、葉蟬、稻褐飛虱等同翅目吸食陛害蟲有極強(qiáng)的毒性，另外由于GNA具有高度特異結(jié)合甘露糖寡聚體,使其在分析，純化糖蛋白方面成為有前途的工具，目前已成功應(yīng)用于純化鼠,清中免疫球蛋白一M的單克隆抗體；豌豆外源凝集素(peaLectin)能抑制豇豆象的生長，并且已分離應(yīng)用到轉(zhuǎn)基因煙草和馬鈴薯等作物中，抗蟲效果比較明顯。 當(dāng)昆蟲進(jìn)食GNA后，GNA在昆蟲的消化道中與

12、腸道膜上相應(yīng)的糖蛋白專一性的結(jié)合，降低膜的透性，從而影響營養(yǎng)的吸收；GNA還能越過上皮的阻礙，進(jìn)入昆蟲循環(huán)系統(tǒng)，造成對整個昆蟲的毒性；同時GNA還可以在昆蟲消化道內(nèi)誘發(fā)病灶，促進(jìn)消化道細(xì)菌繁殖，達(dá)到抗蟲的目的。GNA對幼蟲的存活率、體重、拒食率、化蛹、羽化率及生殖都有很大的影響9 。 2.3蛋白酶抑制劑基因 2.3.1概述 蛋白酶抑制劑(Proteinase Inhibitor，PI)是自然界最豐富的蛋白種類之一，存在于所有的生命體中，與前述蘇云金桿菌相比，更具有抗蟲譜廣、對人畜無剮作用及昆蟲不易產(chǎn)生耐受性等優(yōu)點(Gatehouse，1988),對維持生物體的正常代謝和預(yù)防外來蛋白水解酶對機(jī)體

13、的破壞起著重要作用。其一般為60一l20個氨基酸組成的多肽，分子量約為825kD。20世紀(jì)70年代，人們在研究植物蛋白酶抑制劑時發(fā)現(xiàn)當(dāng)馬鈴薯、兩紅柿等作物在受到昆蟲噬食或機(jī)械損傷f1寸，局部蛋白酶抑制劑含量驟增，從而推測可能是植物抵抗害蟲的一種天然防御系統(tǒng)。在植物界，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)了包括絲氨酸蛋白酶抑制劑、巰基蛋白酶抑制劑、金屬蛋白酶抑制劑和天冬氨酸蛋白酶抑制劑等近l0個蛋白酶抑制劑家族。其中絲氨酸蛋白酶抑制劑在植物抗蟲基因工程中有更大的應(yīng)用價值，因為多數(shù)昆蟲所利用的蛋白消化酶正是絲氨酸類蛋白消化酶，尤其是類胰蛋白酶，而絲氨酸蛋白酶抑制劑又可分為BowmanBirk、Kunitz、PII和PIII家

14、族等不同的類型11410其中又以BowmanBirk家族的豇豆胰蛋白酶抑制劑(CpT I)研究得較為深人且應(yīng)用廣泛。 2.3.2機(jī)理及應(yīng)用 1987年英國的Hilder等把編碼CpT I的eDNA導(dǎo)人煙草獲得轉(zhuǎn)CpT I基岡的抗蟲植株。研究表明，該轉(zhuǎn)基因煙草能抗煙草夜蛾、玉米穗蛾、棉鈴蟲和粘蟲等，且發(fā)現(xiàn)其CpT I的表達(dá)量與抗蟲性里正相關(guān)。此后，世界上的一些實驗室和公司相繼把cpT l基岡轉(zhuǎn)入水稻、油菜、白薯、蘋果和楊樹等具有重要經(jīng)濟(jì)價值的植物中。墨西哥大學(xué)、美國的Mon santo公司也把該基因轉(zhuǎn)入棉花用于防治棉鈴蟲、棉象鼻蟲和螟蛉蟲。中國農(nóng)科院生物技術(shù)中心也正在將人工合成的毒素基因與改造的

15、CpT I基因經(jīng)重組構(gòu)成雙價抗蟲基因?qū)嗣藁ǖ茸魑?。此外，將馬鈴薯蛋白酶抑制劑基因?qū)藷煵莺退?，還獲得了表達(dá)水稻巰基蛋白酶抑制劑基因的轉(zhuǎn)基因煙草工程植株。植物生長發(fā)育過程中PI的合成具有階段特異性(stage-specific)，即P1只在某一階段合成，隨后將被降解10 。其機(jī)理尚待進(jìn)一步研究。植物對PI具有損傷誘導(dǎo)表達(dá)機(jī)制11 ，許多植物受到昆蟲侵害后局部組織或整個植株的PI含量會急劇增加，從而抑制昆蟲的攝食。PI的誘導(dǎo)合成是植物對外界損傷的種反應(yīng)12 ，誘導(dǎo)的PI可以更有效抑制昆蟲腸道中蛋白酶的活性13 。馬鈴薯蛋白酶抑制劑一II(Dotato inhibitor II，PTII)基因具

16、有損傷誘導(dǎo)型啟動子14，如果使用這類啟動子調(diào)控其它外源抗蟲基因在植物中的表達(dá)，將具有特殊的意義。三、結(jié)論與展望 3.1結(jié)論 目前，雖然有各種各樣的抗蟲基因和基因表達(dá)載體相繼問世，但是由于基因轉(zhuǎn)移方法上的原因，有些抗蟲基因無法轉(zhuǎn)移給植物或者轉(zhuǎn)化頻率很低。要從事抗蟲基因的轉(zhuǎn)移，一方面要了解抗蟲基因的來源、作用，另一方面要掌握遺傳轉(zhuǎn)化的理論、方法。其中如何提高轉(zhuǎn)化過程中植株再生頻率也是問題的關(guān)鍵之一。由于在室內(nèi)和田問都已發(fā)現(xiàn)昆蟲對Bt。產(chǎn)生了抗藥性，因此如何防止抗性擴(kuò)散是轉(zhuǎn)抗蟲基因遺傳工程所面臨的一大問題人們已采取了一些降低選擇壓力的方法來克服這個問題，如將轉(zhuǎn)基因植株與非轉(zhuǎn)基因植株混種、使Bt基因的

17、表達(dá)局限在特定器官、開辟隔離帶、使用化學(xué)調(diào)節(jié)性啟動子等。 已有報道，將不同的抗蟲基因豇豆胰蛋白酶抑制劑基因和凝集素基因同時轉(zhuǎn)入煙草，具有加性抗蟲作用。由于植物的害蟲是多種多樣的，如何提高轉(zhuǎn)基因植物的抗蟲廣譜性，也是需要進(jìn)一步研究的課題。除了使植物獲取得抗蟲性外，也可以對昆蟲進(jìn)行改造可將顯性的雌性不育基因轉(zhuǎn)入昆蟲胚胎的基因組中，以育成不育昆蟲?？傊蚬こ滩⒎墙鉀Q一切問題的萬全之策，只有將傳統(tǒng)的抗蟲育種、遺傳工程及田間綜合防治相互結(jié)合起來，才能更好地控制害蟲發(fā)生，更好地改良植物。 3.2展望植物抗蟲基因工程在短短十幾年中已取得了豐碩成果，抗蟲轉(zhuǎn)基因棉花、玉米、馬鈴薯的商業(yè)化推廣證明了這項技術(shù)的

18、實用性。在轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)，抗蟲基因在植物整個生活周期中都存在并行使其抗蟲功能，克服了使用農(nóng)藥控制蟲害的時效性和易被沖刷、流失、分解等缺點，又防止了化學(xué)農(nóng)藥在食物中的殘留危害人體健康和對環(huán)境造成的污染等問題。多種抗蟲基因的同時開發(fā)及其互補(bǔ)和協(xié)同作用。對于控制昆蟲產(chǎn)生抗性，提高抗蟲植物的抗蟲能力及抗蟲范圍前景是樂觀的。另外，我們必須認(rèn)識到?；蚬こ滩⒎鞘墙鉀Q一切問題的萬全之策。通過植物基因工程得到的只是一種人工種質(zhì)新材料。而不是生產(chǎn)上可以立即應(yīng)用的新品種，它必須經(jīng)過常規(guī)育種考驗。只有將傳統(tǒng)的抗蟲育種、遺傳工程及田間綜合防治相互結(jié)合起來，才能更好地控制害蟲發(fā)生，更好地改良植物。因此，植物基因工程技術(shù)

19、必須與常規(guī)育種相結(jié)合，并經(jīng)大田試驗將轉(zhuǎn)基因植物的外源目的基固持續(xù)遺傳給后代或通過有性繁殖轉(zhuǎn)移到其他品種上去?？梢韵嘈牛S著研究的不斷深入，目前抗蟲轉(zhuǎn)基因工程中存在的各種問題必將得到解決，在不久的將來會有更多的抗蟲作物新品種從實驗室走向大田?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 Gathehouse AMR，Hilder VA，BoulterDPlant Genetic M anipulation for Crop ProtectionDBCAB internitonal，1992，1551812 謝先芝抗蟲轉(zhuǎn)基因植物的研究進(jìn)展及前景J生物工程進(jìn)展1999，19(6)：47513 崔洪志，郭三堆Bt毒蛋白抗蟲植物基因

20、工程研究J農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，1998，6(2)；1661714 倪萬潮，張震林，郭三堆轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的培育J1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，1998，31(2)：8II5 郭三堆植物Bt抗蟲基因工程研究進(jìn)展J中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，1995，28(5)：8I36M aqbool SB，Husana T，et a1.M ol Breed，1998，4-501507.7Selvapandiyan A ，Reddy V S，et a1. M ol Breed， 1998.4：473 478.8王志斌，李學(xué)勇，等。生物技術(shù)通報，1998，(2)：5 10.9Machuka J，Damme EJM Van .Entomologia

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