基因表達(dá)的檢測(cè)

1、基因表達(dá)水平的檢測(cè)基因表達(dá)水平的檢測(cè)蘇蘇 川川南京醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)系南京醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)系 86862774江蘇省病原生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室江蘇省病原生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 86862773一、基因表達(dá)的概述：一、基因表達(dá)的概述： 從基因到蛋白質(zhì)從基因到蛋白質(zhì)中心法則：中心法則： DNAmRNA蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄翻譯翻譯復(fù)制復(fù)制2. 教學(xué)目的：教學(xué)目的：了解檢測(cè)基因表達(dá)主要方法的原理及大概操了解檢測(cè)基因表達(dá)主要方法的原理及大概操作要點(diǎn)作要點(diǎn)理解各檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)理解各檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)懂得合理選擇實(shí)驗(yàn)方法及對(duì)各實(shí)驗(yàn)結(jié)果的合懂得合理選擇實(shí)驗(yàn)方法及對(duì)各實(shí)驗(yàn)結(jié)果的合理解釋理解釋二、基因表達(dá)調(diào)控的

2、基本概念與原理：二、基因表達(dá)調(diào)控的基本概念與原理： 基因表達(dá)調(diào)控的概念及方式：基因表達(dá)調(diào)控的概念及方式：基因：基因：一個(gè)遺傳單位，是一段可表達(dá)的一個(gè)遺傳單位，是一段可表達(dá)的DNA序列。序列。基因組：基因組：一個(gè)單倍體細(xì)胞或病毒顆粒的全套基因。人類(lèi)基因一個(gè)單倍體細(xì)胞或病毒顆粒的全套基因。人類(lèi)基因組含約組含約4萬(wàn)個(gè)基因。萬(wàn)個(gè)基因?；虮磉_(dá)：基因表達(dá)：基因所包含的遺傳信息通過(guò)轉(zhuǎn)錄生成基因所包含的遺傳信息通過(guò)轉(zhuǎn)錄生成RNA，再，再經(jīng)過(guò)翻譯生成蛋白質(zhì)的過(guò)程。一般而言，在某一特定時(shí)刻，經(jīng)過(guò)翻譯生成蛋白質(zhì)的過(guò)程。一般而言，在某一特定時(shí)刻，高等生物僅有不到高等生物僅有不到15%的基因表達(dá)。的基因表達(dá)。基因表達(dá)

3、調(diào)控：基因表達(dá)調(diào)控：基因表達(dá)有其特定的規(guī)律，并受到機(jī)體各種基因表達(dá)有其特定的規(guī)律，并受到機(jī)體各種因素的調(diào)節(jié)和控制。對(duì)基因的表達(dá)實(shí)施精確的控制，使細(xì)胞因素的調(diào)節(jié)和控制。對(duì)基因的表達(dá)實(shí)施精確的控制，使細(xì)胞適應(yīng)不同階段、不同環(huán)境條件下的生長(zhǎng)與發(fā)育的需要，維持適應(yīng)不同階段、不同環(huán)境條件下的生長(zhǎng)與發(fā)育的需要，維持機(jī)體正常生命活動(dòng)，有著重要意義。機(jī)體正常生命活動(dòng)，有著重要意義?？烧T導(dǎo)基因：基因表達(dá)的時(shí)間特異性可誘導(dǎo)基因：基因表達(dá)的時(shí)間特異性 基因表達(dá)的空間特異性（組織特異性）基因表達(dá)的空間特異性（組織特異性）看家基因看家基因:2. 基因表達(dá)調(diào)控的基本原理：基因表達(dá)調(diào)控的基本原理：原核生物和真核生物的基因表

4、達(dá)調(diào)控盡管在細(xì)節(jié)上差異原核生物和真核生物的基因表達(dá)調(diào)控盡管在細(xì)節(jié)上差異很大，但兩者的調(diào)控模式和原理極為相似。很大，但兩者的調(diào)控模式和原理極為相似。調(diào)節(jié)作用主要包括核酸之間的相互作用、核酸與蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)作用主要包括核酸之間的相互作用、核酸與蛋白質(zhì)之間的相互作用以及蛋白質(zhì)之間的相互作用。之間的相互作用以及蛋白質(zhì)之間的相互作用。調(diào)控作用可能是正向的或負(fù)向的。調(diào)控作用可能是正向的或負(fù)向的。調(diào)控點(diǎn)可以位于基因表達(dá)過(guò)程的各個(gè)環(huán)節(jié)，如基因的激調(diào)控點(diǎn)可以位于基因表達(dá)過(guò)程的各個(gè)環(huán)節(jié)，如基因的激活、轉(zhuǎn)錄起始、轉(zhuǎn)錄后加工、活、轉(zhuǎn)錄起始、轉(zhuǎn)錄后加工、mRNA降解、蛋白質(zhì)翻譯、降解、蛋白質(zhì)翻譯、翻譯后加工和蛋白質(zhì)降解等。

5、翻譯后加工和蛋白質(zhì)降解等。特異特異DNA序列對(duì)基因表達(dá)的影響：序列對(duì)基因表達(dá)的影響：真（原）核生物真（原）核生物DNA分子上的特定序列構(gòu)成了基因表達(dá)的基分子上的特定序列構(gòu)成了基因表達(dá)的基本信號(hào)：起始密碼、調(diào)控序列、編碼序列、終止密碼、單拷貝本信號(hào)：起始密碼、調(diào)控序列、編碼序列、終止密碼、單拷貝序列、重復(fù)序列等。序列、重復(fù)序列等。DNA與蛋白質(zhì)之間相互作用對(duì)基因表達(dá)的影響：與蛋白質(zhì)之間相互作用對(duì)基因表達(dá)的影響：DNA上的特定序列可以與相應(yīng)的蛋白質(zhì)結(jié)合，這些蛋白質(zhì)依其作用分上的特定序列可以與相應(yīng)的蛋白質(zhì)結(jié)合，這些蛋白質(zhì)依其作用分為：為：阻遏蛋白（阻遏蛋白（repressor）：與操縱序列結(jié)合，阻遏

6、基因的轉(zhuǎn)錄。）：與操縱序列結(jié)合，阻遏基因的轉(zhuǎn)錄。激活蛋白（激活蛋白（activator）：與啟動(dòng)子中的特定序列結(jié)合，增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄。）：與啟動(dòng)子中的特定序列結(jié)合，增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄。特異因子特異因子轉(zhuǎn)錄因子（轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor, TF）也稱反式作用因子（）也稱反式作用因子（trans-acting factor）：通過(guò)與順式作用元件結(jié)合，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性）：通過(guò)與順式作用元件結(jié)合，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性DNA-蛋白質(zhì)之間的結(jié)合通常是非共價(jià)鍵的形式，通過(guò)蛋白質(zhì)分子中特蛋白質(zhì)之間的結(jié)合通常是非共價(jià)鍵的形式，通過(guò)蛋白質(zhì)分子中特殊的結(jié)構(gòu)域與殊的結(jié)構(gòu)域與DNA分子中雙螺旋結(jié)構(gòu)的大溝結(jié)合，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄

7、。分子中雙螺旋結(jié)構(gòu)的大溝結(jié)合，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。常見(jiàn)的常見(jiàn)的DNA-蛋白質(zhì)結(jié)合域有：蛋白質(zhì)結(jié)合域有：螺旋轉(zhuǎn)角螺旋（螺旋轉(zhuǎn)角螺旋（helix-turn-helix）鋅指（鋅指（zinc fingers）蛋白質(zhì)之間相互作用對(duì)基因表達(dá)的影響：蛋白質(zhì)之間相互作用對(duì)基因表達(dá)的影響：調(diào)節(jié)蛋白通常通過(guò)二聚體（調(diào)節(jié)蛋白通常通過(guò)二聚體（dimer）或多聚體（）或多聚體（polymer）的形）的形式與式與DNA結(jié)合結(jié)合不同的調(diào)節(jié)蛋白也可以相互作用或結(jié)合后，再與不同的調(diào)節(jié)蛋白也可以相互作用或結(jié)合后，再與DNA特定部位特定部位結(jié)合，調(diào)節(jié)同一基因的不同轉(zhuǎn)錄水平，尤其多見(jiàn)于真核生物。結(jié)合，調(diào)節(jié)同一基因的不同轉(zhuǎn)錄水平，尤其多

8、見(jiàn)于真核生物。蛋白質(zhì)之間相互作用的典型特征包括：蛋白質(zhì)之間相互作用的典型特征包括：亮氨酸拉鏈（亮氨酸拉鏈（leucine zipper）螺旋轉(zhuǎn)角螺旋（螺旋轉(zhuǎn)角螺旋（helix-loop-helix）RNA聚合酶對(duì)基因表達(dá)的影響：聚合酶對(duì)基因表達(dá)的影響：轉(zhuǎn)錄起始是通過(guò)轉(zhuǎn)錄起始是通過(guò)RNA聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)的，轉(zhuǎn)錄聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)的，轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控是基因表達(dá)調(diào)控中最重要、最基礎(chǔ)的調(diào)控點(diǎn)之一。起始的調(diào)控是基因表達(dá)調(diào)控中最重要、最基礎(chǔ)的調(diào)控點(diǎn)之一。不同啟動(dòng)子的序列不同，因而影響它們與不同啟動(dòng)子的序列不同，因而影響它們與RNA聚合酶結(jié)合的聚合酶結(jié)合的親和力，親和力的不同繼而直接影響轉(zhuǎn)錄

9、起始的頻率。親和力，親和力的不同繼而直接影響轉(zhuǎn)錄起始的頻率。RNA聚合酶和啟動(dòng)子的結(jié)合也會(huì)受到調(diào)節(jié)蛋白的影響聚合酶和啟動(dòng)子的結(jié)合也會(huì)受到調(diào)節(jié)蛋白的影響,阻遏蛋阻遏蛋白、激活蛋白、特異因子、轉(zhuǎn)錄因子等均可通過(guò)增強(qiáng)或者干擾白、激活蛋白、特異因子、轉(zhuǎn)錄因子等均可通過(guò)增強(qiáng)或者干擾RNA聚合酶與啟動(dòng)子之間的結(jié)合，調(diào)節(jié)基因的起始。聚合酶與啟動(dòng)子之間的結(jié)合，調(diào)節(jié)基因的起始。三、原核生物的基因表達(dá)調(diào)控：三、原核生物的基因表達(dá)調(diào)控： 原核生物結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、無(wú)細(xì)胞核，轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程耦聯(lián)在一起，原核生物結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、無(wú)細(xì)胞核，轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程耦聯(lián)在一起，對(duì)環(huán)境條件的變化反應(yīng)迅速，可以根據(jù)環(huán)境因素的變化迅速對(duì)環(huán)境條件的變化反應(yīng)

10、迅速，可以根據(jù)環(huán)境因素的變化迅速調(diào)整自身基因的表達(dá)，滿足其生長(zhǎng)和繁殖的需要。原核基因調(diào)整自身基因的表達(dá)，滿足其生長(zhǎng)和繁殖的需要。原核基因表達(dá)調(diào)控的特點(diǎn)為：表達(dá)調(diào)控的特點(diǎn)為：普遍存在操縱子調(diào)控模式普遍存在操縱子調(diào)控模式通過(guò)特異的阻遏蛋白或激活蛋白調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄通過(guò)特異的阻遏蛋白或激活蛋白調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄與翻譯的耦聯(lián)轉(zhuǎn)錄與翻譯的耦聯(lián)轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控：轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控：乳糖操縱子的調(diào)控：乳糖操縱子的調(diào)控：阻遏蛋白對(duì)乳糖操縱子的調(diào)節(jié)阻遏蛋白對(duì)乳糖操縱子的調(diào)節(jié)2） 其它轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制：其它轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制：轉(zhuǎn)錄衰減：轉(zhuǎn)錄衰減：基因重組：基因重組：翻譯水平的調(diào)控：翻譯水平的調(diào)控：SD序列對(duì)翻譯的影響：序列對(duì)翻譯的

11、影響：SD序列是原核生物序列是原核生物mRNA起始密碼子起始密碼子AUG上游上游3-10堿基的由堿基的由3-9個(gè)堿基組成的一個(gè)富含嘌呤核苷酸的序個(gè)堿基組成的一個(gè)富含嘌呤核苷酸的序列，能與核糖體小亞基列，能與核糖體小亞基16s rRNA3末端富含嘧啶的序列互補(bǔ)，從末端富含嘧啶的序列互補(bǔ)，從而使核糖體與而使核糖體與mRNA結(jié)合，開(kāi)始翻譯。結(jié)合，開(kāi)始翻譯。mRNA的穩(wěn)定性：原核細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性：原核細(xì)胞內(nèi)mRNA通常很快被降解。例如：通常很快被降解。例如：E. coli的許多的許多mRNA在在37時(shí)的平均壽命只有大約時(shí)的平均壽命只有大約2分鐘。分鐘。翻譯產(chǎn)物對(duì)翻譯的影響：有些翻譯產(chǎn)物對(duì)翻譯的影響：有些

12、mRNA編碼的蛋白質(zhì)，本身就是在編碼的蛋白質(zhì)，本身就是在蛋白翻譯過(guò)程中發(fā)揮作用的因子。這些因子可對(duì)自身的翻譯產(chǎn)生蛋白翻譯過(guò)程中發(fā)揮作用的因子。這些因子可對(duì)自身的翻譯產(chǎn)生調(diào)控作用。如起始因子調(diào)控作用。如起始因子3（IF-3），當(dāng)它合成過(guò)多時(shí)，能有效地校），當(dāng)它合成過(guò)多時(shí)，能有效地校正和抑制其自身的起始密碼子與起始正和抑制其自身的起始密碼子與起始tRNA的配對(duì)而抑制翻譯的的配對(duì)而抑制翻譯的起始。另外還有核糖體蛋白、翻譯終止因子等均可影響翻譯過(guò)程。起始。另外還有核糖體蛋白、翻譯終止因子等均可影響翻譯過(guò)程。四、真核生物的基因表達(dá)調(diào)控：四、真核生物的基因表達(dá)調(diào)控：真核生物基因表達(dá)調(diào)控與原核不同點(diǎn)在于：真

13、核生物基因表達(dá)調(diào)控與原核不同點(diǎn)在于：轉(zhuǎn)錄激活與染色體轉(zhuǎn)錄區(qū)特定結(jié)構(gòu)相適應(yīng)轉(zhuǎn)錄激活與染色體轉(zhuǎn)錄區(qū)特定結(jié)構(gòu)相適應(yīng)正性調(diào)節(jié)占主導(dǎo)正性調(diào)節(jié)占主導(dǎo)轉(zhuǎn)錄與翻譯在空間上的分離轉(zhuǎn)錄與翻譯在空間上的分離1.1. 更多、更復(fù)雜的調(diào)控蛋白更多、更復(fù)雜的調(diào)控蛋白（一）、DNADNA水平的調(diào)控（真核生物表達(dá)調(diào)控的次水平的調(diào)控（真核生物表達(dá)調(diào)控的次要和輔助手段）：要和輔助手段）：染色質(zhì)（染色質(zhì)（chromatin）結(jié)構(gòu)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用：）結(jié)構(gòu)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用：真核基因通常與組蛋白（真核基因通常與組蛋白（histone）結(jié)合形成核小體，從而保護(hù)）結(jié)合形成核小體，從而保護(hù)DNA免受損傷，維持基因組穩(wěn)定，抑制基因的表達(dá)

14、。影響基因免受損傷，維持基因組穩(wěn)定，抑制基因的表達(dá)。影響基因表達(dá)水平的主要有：表達(dá)水平的主要有： 組蛋白的含量組蛋白的含量 組蛋白的結(jié)構(gòu)組蛋白的結(jié)構(gòu) 調(diào)節(jié)蛋白與組蛋白調(diào)節(jié)蛋白與組蛋白H1和和H5竟?fàn)幒途範(fàn)幒虳NA的結(jié)合，從而解除的結(jié)合，從而解除組蛋白對(duì)基因表達(dá)的抑制作用。組蛋白對(duì)基因表達(dá)的抑制作用?；蛐揎棇?duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用：基因修飾對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用：胞嘧啶經(jīng)甲基化為胞嘧啶經(jīng)甲基化為5-甲基胞嘧啶（常出現(xiàn)在甲基胞嘧啶（常出現(xiàn)在5端側(cè)翼序列的端側(cè)翼序列的GC豐富區(qū)），影響豐富區(qū)），影響DNA特異序列與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，使基因不能特異序列與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，使基因不能轉(zhuǎn)錄或阻止轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的形成。

15、轉(zhuǎn)錄或阻止轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的形成?；騺G失：基因丟失：在細(xì)胞分化過(guò)程中，可以通過(guò)丟失掉某些基因而去除掉某在細(xì)胞分化過(guò)程中，可以通過(guò)丟失掉某些基因而去除掉某些基因的活性。些基因的活性。染色體破碎所致的不均等分配。染色體破碎所致的不均等分配。僅發(fā)生在低等生物中（原生動(dòng)物、線蟲(chóng)、昆蟲(chóng)、甲殼類(lèi)動(dòng)僅發(fā)生在低等生物中（原生動(dòng)物、線蟲(chóng)、昆蟲(chóng)、甲殼類(lèi)動(dòng)物等），此現(xiàn)象在高等生物中迄今尚未發(fā)現(xiàn)。物等），此現(xiàn)象在高等生物中迄今尚未發(fā)現(xiàn)?；驍U(kuò)增：基因擴(kuò)增：細(xì)胞內(nèi)某些特定基因的拷貝數(shù)專(zhuān)一性地大量增加的現(xiàn)象，細(xì)胞內(nèi)某些特定基因的拷貝數(shù)專(zhuān)一性地大量增加的現(xiàn)象，它是細(xì)胞在短期內(nèi)為滿足某種需要（發(fā)育需要、外界環(huán)境它是細(xì)胞在短期內(nèi)為

16、滿足某種需要（發(fā)育需要、外界環(huán)境因素）而產(chǎn)生足夠的基因產(chǎn)物的一種調(diào)控手段。因素）而產(chǎn)生足夠的基因產(chǎn)物的一種調(diào)控手段。 基因重排：基因重排：基因重排是指某些基因片段改變?cè)瓉?lái)的存在順序，通過(guò)調(diào)整有基因重排是指某些基因片段改變?cè)瓉?lái)的存在順序，通過(guò)調(diào)整有關(guān)基因片段的銜接順序，重新組成為一個(gè)完整的轉(zhuǎn)錄單位。一關(guān)基因片段的銜接順序，重新組成為一個(gè)完整的轉(zhuǎn)錄單位。一種熟知的以基因重排來(lái)調(diào)節(jié)不同基因表達(dá)的例子是哺乳動(dòng)物免種熟知的以基因重排來(lái)調(diào)節(jié)不同基因表達(dá)的例子是哺乳動(dòng)物免疫球蛋白各編碼區(qū)的連接：疫球蛋白各編碼區(qū)的連接：一個(gè)免疫球蛋白分子包括兩條相同的輕鏈和重鏈。一個(gè)免疫球蛋白分子包括兩條相同的輕鏈和重鏈。輕

17、鏈：可變區(qū)、恒定區(qū)、連接區(qū)都由位于同一染色體不同輕鏈：可變區(qū)、恒定區(qū)、連接區(qū)都由位于同一染色體不同位置的位置的DNADNA片段編碼，在形成活性基因前，上述各一個(gè)基因片段編碼，在形成活性基因前，上述各一個(gè)基因通過(guò)染色體內(nèi)重組成連到一起。通過(guò)染色體內(nèi)重組成連到一起。重鏈：可變區(qū)、恒定區(qū)、連接區(qū)、歧化區(qū)重鏈：可變區(qū)、恒定區(qū)、連接區(qū)、歧化區(qū)（二）、轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控：（二）、轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控： 轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是真核基因表達(dá)調(diào)控中轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是真核基因表達(dá)調(diào)控中最重要最重要的環(huán)節(jié)，的環(huán)節(jié)，大多數(shù)生物基因在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是決定細(xì)胞質(zhì)中大多數(shù)生物基因在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是決定細(xì)胞質(zhì)中mRNAmRNA水平的一個(gè)最重要

18、方式，調(diào)控主要通過(guò)反式作用水平的一個(gè)最重要方式，調(diào)控主要通過(guò)反式作用因子和因子和RNARNA聚合酶的相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)。聚合酶的相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)。 反式作用因子反式作用因子是一類(lèi)細(xì)胞核內(nèi)存在的蛋白質(zhì)，是與特異的是一類(lèi)細(xì)胞核內(nèi)存在的蛋白質(zhì)，是與特異的DNADNA序列（順式作用元件）結(jié)合的調(diào)控蛋白。它通過(guò)識(shí)別并結(jié)合上游序列（順式作用元件）結(jié)合的調(diào)控蛋白。它通過(guò)識(shí)別并結(jié)合上游啟動(dòng)子元件和增強(qiáng)子中的順式元件，激活或阻遏基因的表達(dá)。它啟動(dòng)子元件和增強(qiáng)子中的順式元件，激活或阻遏基因的表達(dá)。它包括三個(gè)功能域：包括三個(gè)功能域： DNADNA識(shí)別結(jié)合域（常有鋅指結(jié)構(gòu)）識(shí)別結(jié)合域（常有鋅指結(jié)構(gòu)） 轉(zhuǎn)錄活性域（富含某些特

19、定氨基酸如谷氨酰氨）轉(zhuǎn)錄活性域（富含某些特定氨基酸如谷氨酰氨） 蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域（常具有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)和螺旋蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域（常具有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)和螺旋環(huán)螺旋結(jié)構(gòu)等）。環(huán)螺旋結(jié)構(gòu)等）。轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物: :轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成過(guò)程有三步：轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成過(guò)程有三步：TATATATA因子結(jié)合因子結(jié)合TATATATA盒（形成盒（形成TATATATA因子因子DNADNA復(fù)合物）復(fù)合物）RNA polRNA pol識(shí)別并結(jié)合識(shí)別并結(jié)合TATATATA因子因子DNADNA復(fù)合物（閉合復(fù)合物，復(fù)合物（閉合復(fù)合物，DNADNA雙鏈沒(méi)有打開(kāi)，不能啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄）雙鏈沒(méi)有打開(kāi)，不能啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄）轉(zhuǎn)

20、錄起始因子與轉(zhuǎn)錄起始因子與RNA polRNA pol結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物（開(kāi)放復(fù)合物，（開(kāi)放復(fù)合物，DNADNA雙螺旋已打開(kāi)，可以合成雙螺旋已打開(kāi)，可以合成RNARNA）轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控：轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控：基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控主要通過(guò)反式作用因子、順式作用元基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控主要通過(guò)反式作用因子、順式作用元件和件和RNARNA聚合酶的相互作用來(lái)完成。調(diào)控機(jī)制涉及反式作用因聚合酶的相互作用來(lái)完成。調(diào)控機(jī)制涉及反式作用因子的激活及反式作用因子的作用等。子的激活及反式作用因子的作用等。反式作用因子的活性調(diào)節(jié)：反式作用因子的活性調(diào)節(jié)：表達(dá)調(diào)節(jié)：迅速合成、迅速降解表達(dá)調(diào)節(jié)

21、：迅速合成、迅速降解共價(jià)修飾：磷酸化去磷酸化、糖基化共價(jià)修飾：磷酸化去磷酸化、糖基化配體結(jié)合：激素激素受體（是核內(nèi)的反式作用因子）配體結(jié)合：激素激素受體（是核內(nèi)的反式作用因子）蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用：蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用：maxmax蛋白蛋白c-mycc-myc蛋白（核內(nèi)蛋白（核內(nèi)的反式作用因子）的反式作用因子）反式作用因子與順式元件結(jié)合的調(diào)節(jié)：反式作用因子與順式元件結(jié)合的調(diào)節(jié)：順式作用元件包括：順式作用元件包括： 上游啟動(dòng)子元件上游啟動(dòng)子元件 遠(yuǎn)距離的增強(qiáng)子元件（上游增強(qiáng)子元件、下游增強(qiáng)遠(yuǎn)距離的增強(qiáng)子元件（上游增強(qiáng)子元件、下游增強(qiáng)子元件）子元件）反式作用因子作用方式的調(diào)節(jié)：反式作用因子作用

22、方式的調(diào)節(jié)：反式作用因子通過(guò)下列不同的方式作用到反式作用因子通過(guò)下列不同的方式作用到RNARNA聚合酶結(jié)合聚合酶結(jié)合位點(diǎn)從而影響其轉(zhuǎn)錄活性：位點(diǎn)從而影響其轉(zhuǎn)錄活性： 成環(huán)成環(huán) 扭曲扭曲 滑動(dòng)滑動(dòng) 連鎖反應(yīng)連鎖反應(yīng)反式作用因子的組合式調(diào)節(jié)：反式作用因子的組合式調(diào)節(jié)：幾種不同的反式作用因子組合，發(fā)揮特定的作用。幾種不同的反式作用因子組合，發(fā)揮特定的作用。（三）、轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控：（三）、轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控： 轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控一般是指基因轉(zhuǎn)錄后對(duì)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控一般是指基因轉(zhuǎn)錄后對(duì)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行一系列修飾、加工過(guò)程，主要包括進(jìn)行一系列修飾、加工過(guò)程，主要包括mRNAmRNA選擇性選擇性剪切、胞內(nèi)

23、定位以及剪切、胞內(nèi)定位以及mRNAmRNA穩(wěn)定性調(diào)節(jié)：穩(wěn)定性調(diào)節(jié)： DNADNA（核內(nèi)）（核內(nèi)）轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄 mRNAmRNA前體前體 加工加工成熟成熟mRNAmRNA 運(yùn)輸運(yùn)輸細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞質(zhì) mRNAmRNA前體加帽、加尾以調(diào)控其穩(wěn)定性：前體加帽、加尾以調(diào)控其穩(wěn)定性：55加帽（加帽（cappingcapping）：）：7 7甲基鳥(niǎo)苷三磷酸甲基鳥(niǎo)苷三磷酸33端加尾（端加尾（tailingtailing）：多聚）：多聚A A（Poly APoly A）mRNAmRNA前體的選擇性剪接（前體的選擇性剪接（splicingsplicing）與拼接：）與拼接：選擇性剪切：去除選擇性剪切：去除mRNAmRNA

24、前體中的內(nèi)含子前體中的內(nèi)含子選擇性拼接：從同一基因產(chǎn)生若干種有部分相同結(jié)選擇性拼接：從同一基因產(chǎn)生若干種有部分相同結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，即通過(guò)構(gòu)的蛋白質(zhì)，即通過(guò)MrnauMrnau前性的選擇性拼接而產(chǎn)前性的選擇性拼接而產(chǎn)生不同的成熟生不同的成熟mRNAmRNA，然后翻譯成不同的蛋白質(zhì)。，然后翻譯成不同的蛋白質(zhì)。選擇性表達(dá)：多基因的基因家族中的各成員在特定選擇性表達(dá)：多基因的基因家族中的各成員在特定的細(xì)胞中，在一定的發(fā)育階段和在一定的生理?xiàng)l件的細(xì)胞中，在一定的發(fā)育階段和在一定的生理?xiàng)l件下選擇性的表達(dá)。下選擇性的表達(dá)。 RNA編輯的調(diào)控：編輯的調(diào)控：RNA編輯（編輯（editing）：是指轉(zhuǎn)錄后的）：是指

25、轉(zhuǎn)錄后的mRNA前體在前體在編碼區(qū)發(fā)生核苷酸改變的現(xiàn)象，從而產(chǎn)生出氨基酸序編碼區(qū)發(fā)生核苷酸改變的現(xiàn)象，從而產(chǎn)生出氨基酸序列不同的蛋白質(zhì)。包括：列不同的蛋白質(zhì)。包括：核苷酸的替換核苷酸的替換核苷酸的插入或缺失核苷酸的插入或缺失mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控：轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控：mRNA前體經(jīng)過(guò)加帽、加尾、剪切等加工后通過(guò)核膜孔從核前體經(jīng)過(guò)加帽、加尾、剪切等加工后通過(guò)核膜孔從核內(nèi)運(yùn)至胞漿。內(nèi)運(yùn)至胞漿。大約只有大約只有20%的的mRNA進(jìn)入胞漿，留在核內(nèi)的進(jìn)入胞漿，留在核內(nèi)的mRNA約約50%會(huì)在會(huì)在1小時(shí)內(nèi)降解。小時(shí)內(nèi)降解。（四）、翻譯水平的調(diào)控： 翻譯水平的調(diào)控主要是控制翻譯水平的調(diào)控主要是控制mRNAmRNA的穩(wěn)

26、定性和的穩(wěn)定性和mRNAmRNA翻譯的起始頻翻譯的起始頻率，是一種迅速控制基因表達(dá)的方式，是各種高等生物廣泛采率，是一種迅速控制基因表達(dá)的方式，是各種高等生物廣泛采用的調(diào)控方式。用的調(diào)控方式。mRNAmRNA的穩(wěn)定性，取決于：的穩(wěn)定性，取決于：mRNAmRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)（不易受外切酶攻擊）的二級(jí)結(jié)構(gòu)（不易受外切酶攻擊）帽子及其種類(lèi)帽子及其種類(lèi)polyApolyA尾的長(zhǎng)短尾的長(zhǎng)短與與mRNAmRNA結(jié)合的蛋白質(zhì)的種類(lèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)的種類(lèi)mRNAmRNA翻譯起始的調(diào)控（即控制翻譯起始的調(diào)控（即控制mRNAmRNA的可翻譯性）：的可翻譯性）：許多蛋白質(zhì)因子可以影響蛋白質(zhì)合成的起始，如真核生物起始因許多

27、蛋白質(zhì)因子可以影響蛋白質(zhì)合成的起始，如真核生物起始因子子2 2（eukaryotic initiation factoreukaryotic initiation factor，eIF-2eIF-2）的磷酸化會(huì)使）的磷酸化會(huì)使其活性降低，從而減少蛋白質(zhì)合成。其活性降低，從而減少蛋白質(zhì)合成。Recruitment factorRecruitment factor可使可使masked mRNAmasked mRNA與核糖體、氨酰基與核糖體、氨酰基-tRNA-tRNA、蛋白質(zhì)結(jié)合。蛋白質(zhì)結(jié)合。真核生物蛋白質(zhì)合成的自體調(diào)控：真核生物蛋白質(zhì)合成的自體調(diào)控：某些蛋白可抑制其自身某些蛋白可抑制其自身mRNA

28、mRNA的翻譯的翻譯 （五）、翻譯后水平的調(diào)控：mRNA翻譯的產(chǎn)物新生多肽鏈大多是沒(méi)有生物翻譯的產(chǎn)物新生多肽鏈大多是沒(méi)有生物學(xué)活性的，必須經(jīng)過(guò)加工、修飾才能成為有活性的學(xué)活性的，必須經(jīng)過(guò)加工、修飾才能成為有活性的蛋白質(zhì)，加工、修飾過(guò)程包括：蛋白質(zhì)，加工、修飾過(guò)程包括：信號(hào)肽的切除：由信號(hào)肽的切除：由1530個(gè)疏水氨基酸組成的信個(gè)疏水氨基酸組成的信號(hào)肽可使蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜進(jìn)入高爾基體。號(hào)肽可使蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜進(jìn)入高爾基體。新生肽鏈的修飾：磷酸化、羥基化、糖基化、乙新生肽鏈的修飾：磷酸化、羥基化、糖基化、乙?；取ｕ；?。1.肽鏈的剪切與正確折疊肽鏈的剪切與正確折疊五、蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)方法及選擇

29、五、蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)方法及選擇DNA水平的檢測(cè)：水平的檢測(cè)：Southern blotPCRDNA測(cè)序測(cè)序蛋白質(zhì)表達(dá)水平的檢測(cè)：蛋白質(zhì)表達(dá)水平的檢測(cè)：SDSPAGE與與Western blotELISA流式細(xì)胞儀（流式細(xì)胞儀（FACS）檢測(cè)）檢測(cè)免疫組化免疫組化蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片mRNA水平的檢測(cè)：水平的檢測(cè)：Northern blot基因芯片基因芯片Nuclei run-on原位雜交原位雜交RT-PCR實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量RTPCR半定量半定量RTPCRSouthern Blot原理：原理：DNADNA雜交雜交操作過(guò)程：操作過(guò)程：基因組基因組DNA經(jīng)過(guò)一種或多種限制性內(nèi)切酶消化經(jīng)過(guò)一

30、種或多種限制性內(nèi)切酶消化消化后的消化后的DNA片段在標(biāo)準(zhǔn)的瓊脂糖凝膠上經(jīng)電泳按照大小片段在標(biāo)準(zhǔn)的瓊脂糖凝膠上經(jīng)電泳按照大小進(jìn)行分離進(jìn)行分離DNA經(jīng)原位變性后從凝膠中轉(zhuǎn)移到固定支持物上（通常為經(jīng)原位變性后從凝膠中轉(zhuǎn)移到固定支持物上（通常為尼龍膜或硝酸纖維素膜）尼龍膜或硝酸纖維素膜）變性的變性的DNA可以與標(biāo)記的可以與標(biāo)記的DNA、RNA或寡核苷酸探針雜交或寡核苷酸探針雜交通過(guò)特定的檢測(cè)方法（如放射自顯影）來(lái)確定與探針互補(bǔ)的通過(guò)特定的檢測(cè)方法（如放射自顯影）來(lái)確定與探針互補(bǔ)的帶的位置；或通過(guò)對(duì)經(jīng)過(guò)不同限制性內(nèi)切酶（單一或聯(lián)合使帶的位置；或通過(guò)對(duì)經(jīng)過(guò)不同限制性內(nèi)切酶（單一或聯(lián)合使用的）消化過(guò)的基因組

31、用的）消化過(guò)的基因組DNA產(chǎn)生的帶的大小及數(shù)量的估計(jì)產(chǎn)生的帶的大小及數(shù)量的估計(jì)來(lái)判斷結(jié)果來(lái)判斷結(jié)果 重物（重物（400克）克）瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠濾紙濾紙濾紙橋?yàn)V紙橋尼龍膜尼龍膜濾紙濾紙吸水紙吸水紙玻璃板玻璃板支持物支持物20XSSC上行毛細(xì)管轉(zhuǎn)移示意圖上行毛細(xì)管轉(zhuǎn)移示意圖Polymerased Chain Reaction (PCR)原理：原理：高溫下雙鏈高溫下雙鏈DNA變性為單鏈變性為單鏈DNA低溫下單鏈低溫下單鏈DNA與引物寡核苷酸復(fù)性與引物寡核苷酸復(fù)性中溫下由中溫下由DNA聚合酶進(jìn)行互補(bǔ)鏈的修復(fù)復(fù)聚合酶進(jìn)行互補(bǔ)鏈的修復(fù)復(fù)制過(guò)程制過(guò)程2. 方法方法10 X 反應(yīng)緩沖液：反應(yīng)緩沖液： PH

32、8.8-8.3Mg2+ 0.5-5.0mmol/L，K+ 50-100mmol/L，dNTPs（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）模板模板DNA引物（引物是引物（引物是PCR反應(yīng)成功與否的關(guān)鍵之一）反應(yīng)成功與否的關(guān)鍵之一）上游引物上游引物下游引物下游引物TaqDNA聚合酶聚合酶ddH2O95 C 1min55 C 1min72 C 1min4 C 35XDNA 序列測(cè)定Sanger雙脫氧未端終止法測(cè)序原理：雙脫氧未端終止法測(cè)序原理： 聚合酶擴(kuò)增：聚合酶擴(kuò)增：PCR擴(kuò)增的同時(shí)在部分產(chǎn)物末端摻入四色熒光標(biāo)擴(kuò)增的同時(shí)在部分產(chǎn)物末端摻入四色熒光標(biāo)記的四種記的四種ddNTPs電泳分離、激光讀序電泳

33、分離、激光讀序 ABI 377全自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行全自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行DNA核苷酸序列測(cè)定核苷酸序列測(cè)定方法：方法： 引物準(zhǔn)備：引物準(zhǔn)備：純度：須事先用純度：須事先用PAGE膠純化過(guò)膠純化過(guò)濃度：配制成濃度：配制成5-10pmol/uL5-10pmol/uL 模板準(zhǔn)備：模板準(zhǔn)備： 純度：推薦使用試劑盒進(jìn)行純化純度：推薦使用試劑盒進(jìn)行純化 模板量：模板量：PCR產(chǎn)物產(chǎn)物 100-200bp 2-4ng 單鏈單鏈 50-100ng 200-500bp 4-10ng 雙鏈雙鏈 200-500ng 500-1000bp 6-20ng 粘粒、粘粒、BAC 0.5-1ug 1000-2000bp 10-40ng

34、細(xì)菌基因組細(xì)菌基因組DNA 2-3ug 2000bp 80-2000ng測(cè)序測(cè)序PCR：用于：用于PCR產(chǎn)物，單、雙鏈產(chǎn)物，單、雙鏈 加樣：加樣： Terminator Ready Reaction Mix 8.0ul模板模板 不定量不定量引物引物 3.2pmolddH2O 不定量不定量 合計(jì)合計(jì) 20ul 反應(yīng)：反應(yīng)：96 C 10sec50 C 5sec60 C 4min4 C 70X純化測(cè)序產(chǎn)物：純化測(cè)序產(chǎn)物： 加加50ul 95%乙醇，混勻乙醇，混勻 置室溫（置室溫（25度）度）15分鐘，分鐘，12000g離心離心20分鐘，棄上清分鐘，棄上清 加加150ul 75%乙醇洗乙醇洗1-2次

35、，同上離心次，同上離心10分鐘。分鐘。 棄上清，抽干。棄上清，抽干。制備測(cè)序電泳用制備測(cè)序電泳用PAGPAG變性膠變性膠 預(yù)電泳（預(yù)電泳（Pre-runPre-run） 電泳電泳數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析 SDSPAGE與與Western blot(蛋白凝膠電泳及免疫印跡法蛋白凝膠電泳及免疫印跡法)原理：原理：確保蛋白質(zhì)解離為單個(gè)多肽確保蛋白質(zhì)解離為單個(gè)多肽亞基（亞基（SDS）通過(guò)分離膠的篩分作用，將通過(guò)分離膠的篩分作用，將蛋白質(zhì)多肽按分子量的大小蛋白質(zhì)多肽按分子量的大小不同得到分離不同得到分離將蛋白質(zhì)固定于尼龍膜上將蛋白質(zhì)固定于尼龍膜上以抗體識(shí)別待檢蛋白（抗原）以抗體識(shí)別待檢蛋白（抗原）固定物1Ab2

36、AbE 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)（抗原）（抗原）2. 操作過(guò)程操作過(guò)程樣品制備：樣品制備：收集細(xì)胞收集細(xì)胞PBS洗滌并離心沉淀細(xì)胞洗滌并離心沉淀細(xì)胞加入適量細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，置冰上加入適量細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，置冰上30分鐘分鐘高速離心，取上清（蛋白溶液）高速離心，取上清（蛋白溶液）加入等量加入等量2XSDSPAGE樣品緩沖液樣品緩沖液煮沸煮沸5分鐘后上樣（或保存于分鐘后上樣（或保存于20）制膠（不連續(xù)緩沖膠系統(tǒng)）：制膠（不連續(xù)緩沖膠系統(tǒng)）：膠的成份：膠的成份：壓縮膠壓縮膠分離膠分離膠膠濃度的選擇：膠濃度的選擇：丙烯酰氨濃度丙烯酰氨濃度蛋白線性分離范圍蛋白線性分離范圍/KDa1512107.5510431

37、2602080369457212加樣與電泳：加樣與電泳：加適量的樣品（加適量的樣品（2001000ug總蛋白量）、對(duì)照及蛋白總蛋白量）、對(duì)照及蛋白分子量分子量marker180200volts電泳直到溴酚藍(lán)跑出凝膠（電泳直到溴酚藍(lán)跑出凝膠（Bio-Rad電泳電泳裝置）裝置）凝膠染色：凝膠染色：考馬斯亮藍(lán)（考馬斯亮藍(lán)（R250）染色）染色銀染銀染印跡轉(zhuǎn)移：印跡轉(zhuǎn)移：原理：帶正電荷的蛋白質(zhì)在電場(chǎng)作用下從負(fù)極（凝膠）原理：帶正電荷的蛋白質(zhì)在電場(chǎng)作用下從負(fù)極（凝膠）向正極（尼龍膜或硝纖膜）遷移，蛋白質(zhì)通過(guò)疏水作用向正極（尼龍膜或硝纖膜）遷移，蛋白質(zhì)通過(guò)疏水作用結(jié)合到膜上結(jié)合到膜上4條件下，條件下，30

38、0mA電泳電泳13小時(shí)（小時(shí)（Bio-Rad電泳裝置）電泳裝置）封閉：封閉：5%脫脂牛奶或脫脂牛奶或5%BSA，室溫下，室溫下1小時(shí)（或小時(shí)（或4過(guò)夜）過(guò)夜）一抗反應(yīng)：一抗反應(yīng)：選擇合適的第一抗體選擇合適的第一抗體適量抗體以適量抗體以5%脫脂牛奶或脫脂牛奶或5%BSA稀釋稀釋室溫下室溫下1小時(shí)（或小時(shí)（或4過(guò)夜）反應(yīng)過(guò)夜）反應(yīng)二抗反應(yīng)：二抗反應(yīng)：選擇合適的酶標(biāo)第二抗（第一抗體）體選擇合適的酶標(biāo)第二抗（第一抗體）體適量抗體以適量抗體以5%脫脂牛奶或脫脂牛奶或5%BSA稀釋稀釋室溫下室溫下1小時(shí)（或小時(shí)（或4過(guò)夜）反應(yīng)過(guò)夜）反應(yīng)加生色底物顯色加生色底物顯色HRP的底物：的底物：生色：生色：4氯氯1

39、萘酚萘酚/H2O2發(fā)光：發(fā)光：ECL溶液（魯米諾溶液（魯米諾/4碘代酚碘代酚/ H2O2 ）AP的底物：的底物：生色：氮藍(lán)四唑生色：氮藍(lán)四唑/5溴溴4氯吲哚磷酸氯吲哚磷酸發(fā)光：發(fā)光：AMPPD拍片或曝光、洗片拍片或曝光、洗片0 hr2 hr4 hr6 hr8 hr10 hr12 hr14 hrp53p21-TubulinTime after irradiationDNA damage induces down-regulation of histone gene transcription which parallels cell cycle arrest優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：不須純化而

40、直接反映其中單個(gè)蛋白表達(dá)水平的變化不須純化而直接反映其中單個(gè)蛋白表達(dá)水平的變化用于觀察細(xì)胞處理后最后一步變化，結(jié)果最可靠、真實(shí)用于觀察細(xì)胞處理后最后一步變化，結(jié)果最可靠、真實(shí)實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單可靠、重復(fù)性好實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單可靠、重復(fù)性好缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：不能反映蛋白質(zhì)變化的中間過(guò)程不能反映蛋白質(zhì)變化的中間過(guò)程靈敏度相對(duì)較低，多用于檢測(cè)細(xì)胞表達(dá)量較大的蛋白質(zhì)靈敏度相對(duì)較低，多用于檢測(cè)細(xì)胞表達(dá)量較大的蛋白質(zhì)的變化的變化對(duì)抗體的依賴度高對(duì)抗體的依賴度高應(yīng)用應(yīng)用：直接檢測(cè)蛋白質(zhì)的有無(wú)、變化直接檢測(cè)蛋白質(zhì)的有無(wú)、變化可直接檢測(cè)部分蛋白的功能可直接檢測(cè)部分蛋白的功能與其它方法結(jié)合后，可檢測(cè)蛋白蛋白相互作用與其它方法結(jié)合后，可檢測(cè)

41、蛋白蛋白相互作用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）原理：原理：將 可 溶 性 蛋 白 質(zhì)將 可 溶 性 蛋 白 質(zhì)（單一組分或混合（單一組分或混合組分）固定于酶標(biāo)組分）固定于酶標(biāo)板壁上板壁上抗原或抗原或抗體抗體檢測(cè)待檢蛋白檢測(cè)待檢蛋白抗體或抗原抗體或抗原固定物1Ab2AbE 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)（抗原）（抗原）2. 操作過(guò)程（間接法、雙抗體夾心法）操作過(guò)程（間接法、雙抗體夾心法）樣品處理：樣品處理：已知樣品必須是可溶性蛋白溶于已知樣品必須是可溶性蛋白溶于PBS、水等、水等樣品可以是單一組分或混合組分樣品可以是單一組分或混合組分包板：包板：適量的抗原以高適量的抗原以高PH溶液（溶液（PH7

42、.67.8的碳酸鹽緩沖液）或的碳酸鹽緩沖液）或低低PH溶液（溶液（PH4.8枸椽酸鹽緩沖液）稀釋后包被酶標(biāo)板枸椽酸鹽緩沖液）稀釋后包被酶標(biāo)板4反應(yīng)反應(yīng)12天天PBS洗滌后，即可使用該板或可較長(zhǎng)期保存洗滌后，即可使用該板或可較長(zhǎng)期保存封閉：封閉：4%脫脂牛奶或脫脂牛奶或4%BSA，室溫下，室溫下1小時(shí)（或小時(shí)（或4過(guò)夜）過(guò)夜）一抗反應(yīng)：一抗反應(yīng)：選擇合適的第一抗體選擇合適的第一抗體適量抗體以適量抗體以4%脫脂牛奶或脫脂牛奶或4%BSA稀釋稀釋室溫下室溫下1小時(shí)（或小時(shí)（或4過(guò)夜）反應(yīng)過(guò)夜）反應(yīng)二抗反應(yīng)：二抗反應(yīng)：選擇合適的酶標(biāo)第二抗（第一抗體）體選擇合適的酶標(biāo)第二抗（第一抗體）體適量抗體以適量抗

43、體以4%脫脂牛奶或脫脂牛奶或4%BSA稀釋稀釋室溫下室溫下1小時(shí)（或小時(shí)（或4過(guò)夜）反應(yīng)過(guò)夜）反應(yīng)加生色底物顯色：加生色底物顯色：HRP的底物：的底物： H2O2/TMB終止：終止：2M H2SO4結(jié)果判斷：結(jié)果判斷：目測(cè)法目測(cè)法儀器法儀器法優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：用于觀察細(xì)胞處理后最后一步變化，結(jié)果可靠、真實(shí)用于觀察細(xì)胞處理后最后一步變化，結(jié)果可靠、真實(shí)方法簡(jiǎn)單（多樣）、快速方法簡(jiǎn)單（多樣）、快速可大批量檢測(cè)標(biāo)本可大批量檢測(cè)標(biāo)本敏感性較高敏感性較高缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：不能反映蛋白質(zhì)變化的中間過(guò)程不能反映蛋白質(zhì)變化的中間過(guò)程多用于檢測(cè)細(xì)胞表達(dá)量較大的可溶性蛋白質(zhì)的變化多用于檢測(cè)細(xì)胞表達(dá)量較大的可溶

44、性蛋白質(zhì)的變化特異性相對(duì)較低，重復(fù)性相對(duì)較差特異性相對(duì)較低，重復(fù)性相對(duì)較差對(duì)所用抗體的依賴度高對(duì)所用抗體的依賴度高應(yīng)用應(yīng)用：大批量、直接檢測(cè)可溶性蛋白質(zhì)的有無(wú)、變化大批量、直接檢測(cè)可溶性蛋白質(zhì)的有無(wú)、變化What is Flow Cytometry? Flow Cytometry is a powerful technique for cell counting, sorting and surface marker analyzing Flow Cytometry can provide quantitative information about cell surface markers

45、Based on immunofluorescence technique and computer-aided analysis流式細(xì)胞儀（流式細(xì)胞儀（FACS）檢測(cè)）檢測(cè)原理：基于單個(gè)細(xì)胞水平的檢測(cè)原理：基于單個(gè)細(xì)胞水平的檢測(cè)Fluorescence-activated cell sorter (FACS) FACS is one version of Flow Cytometry, which can sort cells by their surface markers Individual cell is positively or negatively charged based

46、on their fluorescence color When charged cells pass through an electric field, they are deflected and hence separated2. FASC的應(yīng)用：的應(yīng)用：細(xì)胞表面標(biāo)志細(xì)胞表面標(biāo)志細(xì)胞組分：細(xì)胞組分：DNA含量含量RNA含量含量蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)含量細(xì)胞動(dòng)力學(xué)參數(shù)細(xì)胞動(dòng)力學(xué)參數(shù)細(xì)胞增殖細(xì)胞增殖細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡細(xì)胞分化細(xì)胞分化其它：其它：白血病免疫分型白血病免疫分型造血干細(xì)胞造血干細(xì)胞血小板血小板機(jī)體免疫功能機(jī)體免疫功能各種基因各種基因v癌基因和抑癌基因癌基因和抑癌基因v調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因v腫

47、瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因v多藥耐藥基因多藥耐藥基因Use Flow Cytometry to examine CD4 and CD8 expression during T cell maturationTreat T cell population with anti-CD4 monoclonal antibody (coupled with dye 1) and anti-CD8 monoclonal antibody (coupled with dye 2) at different maturation stages, then subject the cell populati

48、on to FACS. Flow Cytometry dot plots will be generated.0.111010010000.11101001000dye 1 intensity(for CD4)dye 2 intensity(for CD8)Double Negative(CD4-,CD8-)Doublepositive(CD4+,CD8+)Singlepositive(CD4-,CD8+)Singlepositive(CD4+,CD8-)die T cell(CD4-,CD8-)die0 200 400 600 8001000DNA contentCount Purdue U

49、niversity Cytometry Laboratories4 hr, control28 hr, irradiatedG1: 94.1%S: 1.5%G2/M: 4.4%G1: 94.1%S: 1.1%G2/M: 4.8%G1: 60.6%S: 34.9%G2/M: 4.5%G1: 96.6%S: 1.6%G2/M: 1.8%10%1%90%4%28 hr, control28 hr, aphidicolin 免疫組織化學(xué)法免疫組織化學(xué)法原理：原理：組織細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)等組分被原位固定組織細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)等組分被原位固定以特異性抗體識(shí)別待檢蛋白并顯色以特異性抗體識(shí)別待檢蛋白并顯色方法：方法：組織

50、細(xì)胞固定：組織細(xì)胞固定：4%多聚甲醛，多聚甲醛，RT 10min通透性處理：通透性處理：0.5%Triton-X100，RT 10min封閉：封閉：5%馬血清、馬血清、5%羊血清等，羊血清等，37C 15min一抗：關(guān)鍵一抗：關(guān)鍵二抗：熒光標(biāo)記二抗：熒光標(biāo)記封片，觀察封片，觀察WI38MRC5VA13U2OSHelaSAOS2NPAT concentrates at a few foci in the nuclei of human cellsG0G1SG2PrometaphaseAnaphaseCell cycle-dependent change of NPAT loci in WI38

51、cellsFigure 7: IR-induced dispersion of NPAT protein from histone gene loci depends on p53 and p21.Figure 8: Inhibition of Cdk2 activity prevents NPAT foci formation.優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：不僅可以定性，更重要的是可以定位優(yōu)點(diǎn)：不僅可以定性，更重要的是可以定位缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 無(wú)法檢測(cè)表達(dá)量低的蛋白質(zhì)無(wú)法檢測(cè)表達(dá)量低的蛋白質(zhì) 難以定量難以定量 高度依賴于抗體高度依賴于抗體 操作過(guò)程比較復(fù)雜操作過(guò)程比較復(fù)雜應(yīng)用：應(yīng)用：蛋白定位蛋白定位 在

52、哪里？在哪里？ 去哪里？去哪里？其它其它Northern Blot原理：原理：將將RNA固定于尼龍膜上固定于尼龍膜上以以DNA探針識(shí)別待檢探針識(shí)別待檢mRNA尼尼 龍龍 膜膜AEDCBRNABBB同位素標(biāo)記的同位素標(biāo)記的DNA探針探針2. 操作過(guò)程操作過(guò)程總總RNA提取：提?。河糜肦neasy Mini Kit抽取總抽取總RNA （QIAGEN公司）公司）用用700ul SW1洗一次洗一次用用500ul RPE洗洗2次次用用50ul RNase free ddH2O洗脫兩次洗脫兩次取取2ul加入加入98ul ddH2O，測(cè)取，測(cè)取OD260/280并計(jì)算并計(jì)算RNA濃度及濃度及總總RNA得量得

53、量制膠（變性制膠（變性11.5%Agarose膠）：膠）：制備制備100ml含有含有2.2mol/L甲醛的甲醛的1.5%的瓊脂糖凝膠，加的瓊脂糖凝膠，加1.5克瓊脂糖凝膠粉到克瓊脂糖凝膠粉到72ml滅菌水中，煮沸溶解后置滅菌水中，煮沸溶解后置55水浴，水浴，均衡后均衡后10ml MOPS電泳緩沖液和電泳緩沖液和18ml去離子甲醛，在化學(xué)去離子甲醛，在化學(xué)通風(fēng)櫥內(nèi)灌膠通風(fēng)櫥內(nèi)灌膠加入足夠量的加入足夠量的1XMOPS電泳緩沖液，預(yù)電泳約電泳緩沖液，預(yù)電泳約5分鐘。備用。分鐘。備用。RNA樣品預(yù)處理：樣品預(yù)處理：在一滅菌在一滅菌EP管中建立變性反應(yīng)：管中建立變性反應(yīng)：RNA（多達(dá)（多達(dá)20ug）2.

54、0 ul10XMOPS電流緩沖液電流緩沖液2.0 ul甲醛甲醛4.0 ul甲酰氨甲酰氨10.0ul溴化乙淀溴化乙淀1.0 ul6520分鐘變性，立即置冰上分鐘變性，立即置冰上10分鐘分鐘簡(jiǎn)短離心后備用簡(jiǎn)短離心后備用電泳：電泳：上樣：等量總上樣：等量總RNA/樣品樣品45volts/cm電泳電泳57小時(shí)。小時(shí)。不能用過(guò)高的電壓！不能用過(guò)高的電壓！轉(zhuǎn)移：轉(zhuǎn)移：經(jīng)典方法：搭建經(jīng)典方法：搭建“金字塔金字塔”，轉(zhuǎn)移過(guò)夜。，轉(zhuǎn)移過(guò)夜。 重物（重物（400克）克）瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠濾紙濾紙濾紙橋?yàn)V紙橋尼龍膜尼龍膜濾紙濾紙吸水紙吸水紙玻璃板玻璃板支持物支持物20XSSC上行毛細(xì)管轉(zhuǎn)移示意圖上行毛細(xì)管轉(zhuǎn)移示意

55、圖DNA探針的制備：探針的制備：在一滅菌在一滅菌EP管中建立反應(yīng)：管中建立反應(yīng)：2.0ul模板模板GAPDH PCR產(chǎn)物（產(chǎn)物（150bp,100ng/ul）6.0ul10 X EcoPol buffer6.0uldNTPs（無(wú)（無(wú)dCTP）3.0ul5-GAPDH(100ng/ul)3.0ul3-GAPDH(100ng/ul)31.0ul ddH2O煮沸煮沸10分鐘，立即置冰上分鐘，立即置冰上10分鐘：分鐘：加入：加入：2.5ulKlenow6.5ul32P-dCTP室溫下孵育室溫下孵育6小時(shí)小時(shí)過(guò)柱純化已標(biāo)記探針（過(guò)柱純化已標(biāo)記探針（Phamarcia試劑盒）試劑盒）取相等取相等CPM量量

56、RNA，加入，加入2ml TES/0.6M NaCL10mM TES10mM EDTA0.2%SDS在雜交爐中，在雜交爐中，68反應(yīng)過(guò)夜反應(yīng)過(guò)夜用用2XSSC/0.1%SDS洗膜三次洗膜三次用用0.1XSSC/0.1%SDS洗膜三次洗膜三次曝光于曝光于X光膠片光膠片Crosslink預(yù)雜交預(yù)雜交加入加入10ml雜交混合液，雜交混合液， 68反應(yīng)反應(yīng)45分鐘分鐘雜交雜交H2AH3H4GAPDH0 hr2 hr4 hr6 hr8 hr10 hr12 hr14 hrTime after irradiationC.H2BH102040608010012002468101214time after ir

57、radiation (hr)% controlS phaseH1H2AH2BH3H4DNA damage induces down-regulation of histone gene transcription which parallels cell cycle arrestHCT116（p53+/+,p21+/+)D.E.0 hr2 hr4 hr6 hr8 hr10 hr12 hr14 hr24 hrH2AH4GAPDHTime afer GFP-p21 inductionH1H2BH30204060801000246810121424Hour after GFP-p21 inducti

58、on% controlS phaseNPAT fociH1H2AH2BH3H4Inhibition of CDK activity disperses NPAT from histone gene promoters and down-regulates histone gene expressionA.0204060801001200468101214Time after irradiation (hr)% controlS phaseH1H2AH2BH4H2AH4GAPDHH2BH10 hr4 hr6 hr8 hr10 hr12 hr14 hrTime after irradiationH

59、CT116（p53-/-,p21+/+)Down-regulation of histone gene expression induced by DNA damage depends on p53 and p21S phaseH1H2AH2BH4BH2AH4GAPDHH2BH1Time after irradiation0 hr2 hr4 hr6 hr8 hr10 hr12 hr14 hr020406080100120% control0468101214Time after irradiation (hr)2HCT116（p53+/+,p21-/-)Down-regulation of histone gene expression induced by DNA damage