培養(yǎng)細(xì)胞的觀察和檢測(cè)方法

1、培養(yǎng)細(xì)胞的觀察檢測(cè)方法生物技術(shù)教研室生物技術(shù)教研室 李延蘭李延蘭w 活細(xì)胞的觀察檢測(cè)方法活細(xì)胞的觀察檢測(cè)方法w 培養(yǎng)細(xì)胞常用的染色方法培養(yǎng)細(xì)胞常用的染色方法w 細(xì)胞生長(zhǎng)狀況有關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)方法細(xì)胞生長(zhǎng)狀況有關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)方法w 細(xì)胞生物活性的有關(guān)化學(xué)檢測(cè)方法細(xì)胞生物活性的有關(guān)化學(xué)檢測(cè)方法w 電子顯微鏡技術(shù)電子顯微鏡技術(shù) 一、活細(xì)胞的觀察檢測(cè)方法一、活細(xì)胞的觀察檢測(cè)方法w 肉眼觀察肉眼觀察w 相差顯微鏡觀察相差顯微鏡觀察 細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中需要每天觀察，以便及時(shí)細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中需要每天觀察，以便及時(shí)了解細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)、數(shù)量改變、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞有了解細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)、數(shù)量改變、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞有無(wú)移動(dòng)、

2、有無(wú)污染、培養(yǎng)液無(wú)移動(dòng)、有無(wú)污染、培養(yǎng)液pHpH是否變酸、變黃、是是否變酸、變黃、是否更換等。否更換等。 細(xì)胞常規(guī)檢查的方法為：細(xì)胞常規(guī)檢查的方法為：肉眼觀察肉眼觀察 一般常規(guī)檢查用肉眼即可觀察，主要看培養(yǎng)一般常規(guī)檢查用肉眼即可觀察，主要看培養(yǎng)液的液的顏色顏色和和透明度透明度的變化。的變化。pH pH 顏色顏色 透明度透明度 正常正常 7.27.27.4 7.4 桃紅色桃紅色 清亮、透明清亮、透明酸性產(chǎn)物酸性產(chǎn)物 變淺、變黃變淺、變黃 污染污染 混濁混濁變黃變黃 pH pH pHpH 變紅變紅w大多數(shù)細(xì)胞適于在大多數(shù)細(xì)胞適于在pH 7.2pH 7.27.47.4條件下生長(zhǎng)，低于條件下生長(zhǎng)，低于

3、pH 6.8pH 6.8或高于或高于pH 7.6pH 7.6對(duì)細(xì)胞有害，甚至造成細(xì)胞退化或死亡。細(xì)對(duì)細(xì)胞有害，甚至造成細(xì)胞退化或死亡。細(xì)胞對(duì)堿性不如對(duì)酸性的變化耐受，胞對(duì)堿性不如對(duì)酸性的變化耐受，偏酸的條件比偏堿的環(huán)偏酸的條件比偏堿的環(huán)境對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有利境對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有利。w 隨細(xì)胞數(shù)量的增多、代謝加強(qiáng)，釋放隨細(xì)胞數(shù)量的增多、代謝加強(qiáng)，釋放COCO2 2增多，使增多，使pH pH 降低。為了維持培養(yǎng)基恒定的降低。為了維持培養(yǎng)基恒定的pH pH ，多在培養(yǎng)基中加入磷，多在培養(yǎng)基中加入磷酸鹽等緩沖劑。酸鹽等緩沖劑。w羥乙基哌嗪乙硫磺酸（羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HepesHepes）：對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，也不起：

4、對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，也不起緩沖作用，主要作用是防止緩沖作用，主要作用是防止pHpH迅速變動(dòng)，在開瓶通氣培迅速變動(dòng)，在開瓶通氣培養(yǎng)或活細(xì)胞觀察時(shí)能維持較恒定的養(yǎng)或活細(xì)胞觀察時(shí)能維持較恒定的pHpH值。值。w若培養(yǎng)瓶、瓶塞漏氣，若培養(yǎng)瓶、瓶塞漏氣， 使使COCO2 2溢出，或者由于洗刷不潔、溢出，或者由于洗刷不潔、殘留堿性物，殘留堿性物，使培養(yǎng)液變堿發(fā)紅使培養(yǎng)液變堿發(fā)紅，致使細(xì)胞難以生長(zhǎng)，甚，致使細(xì)胞難以生長(zhǎng)，甚至死亡。至死亡。玻璃器材玻璃器材w 常用的玻璃器材有各種規(guī)格的玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、常用的玻璃器材有各種規(guī)格的玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、吸管、離心管。培養(yǎng)皿、吸管、離心管。w 首次使用：首次使用：w 重

5、復(fù)使用的處理步驟：重復(fù)使用的處理步驟：自來(lái)水刷洗自來(lái)水刷洗0.1稀鹽酸浸泡過(guò)夜稀鹽酸浸泡過(guò)夜自來(lái)水沖洗自來(lái)水沖洗自來(lái)水刷洗自來(lái)水刷洗硫酸重鉻酸鉀浸泡過(guò)夜硫酸重鉻酸鉀浸泡過(guò)夜自來(lái)水沖洗自來(lái)水沖洗10次次雙蒸水沖洗雙蒸水沖洗2次次單蒸水沖洗單蒸水沖洗3次次晾干、包裝晾干、包裝121高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌20min顯微鏡觀察顯微鏡觀察 相差顯微鏡相差顯微鏡 （phase contrast microscopephase contrast microscope） 活細(xì)胞對(duì)光線是透明的，光線通活細(xì)胞對(duì)光線是透明的，光線通過(guò)活細(xì)胞時(shí)，波長(zhǎng)和振幅幾乎沒有過(guò)活細(xì)胞時(shí)，波長(zhǎng)和振幅幾乎沒有改變，所以用普通光鏡無(wú)

6、法看清未改變，所以用普通光鏡無(wú)法看清未經(jīng)染色的活細(xì)胞。經(jīng)染色的活細(xì)胞。 2020世紀(jì)世紀(jì)3030年代年代 荷蘭荷蘭 ZernikeZernike 原理：原理：利用光的衍射和干涉特性，利用光的衍射和干涉特性，把透過(guò)標(biāo)本不同區(qū)域的光波的光程把透過(guò)標(biāo)本不同區(qū)域的光波的光程差轉(zhuǎn)變成振幅差，使細(xì)胞內(nèi)各種結(jié)差轉(zhuǎn)變成振幅差，使細(xì)胞內(nèi)各種結(jié)構(gòu)之間呈現(xiàn)清晰可見的明暗對(duì)比，構(gòu)之間呈現(xiàn)清晰可見的明暗對(duì)比，從而使標(biāo)本的各種結(jié)構(gòu)變得清晰。從而使標(biāo)本的各種結(jié)構(gòu)變得清晰。 相差顯微鏡觀察活細(xì)胞的步驟如下：相差顯微鏡觀察活細(xì)胞的步驟如下： w生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，在顯微鏡下可觀察到生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，在顯微鏡下可觀察到細(xì)胞透明度細(xì)胞透

7、明度大，折光性強(qiáng)，輪廓不清大，折光性強(qiáng)，輪廓不清。w若細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不良，可見若細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不良，可見細(xì)胞輪廓增強(qiáng)，細(xì)胞折細(xì)胞輪廓增強(qiáng)，細(xì)胞折光性變?nèi)?，?xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡、脂滴和其他顆粒光性變?nèi)?，?xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡、脂滴和其他顆粒狀物質(zhì)，細(xì)胞之間空隙增大，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，甚狀物質(zhì)，細(xì)胞之間空隙增大，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，甚至失去原有細(xì)胞的特點(diǎn)，產(chǎn)生圓縮脫落，有時(shí)細(xì)胞至失去原有細(xì)胞的特點(diǎn)，產(chǎn)生圓縮脫落，有時(shí)細(xì)胞表面及周圍出現(xiàn)絲絮狀物表面及周圍出現(xiàn)絲絮狀物。細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)BMSCs培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程w各種細(xì)胞及各代細(xì)胞增殖的時(shí)間不盡相同。各種細(xì)胞及各代細(xì)胞增殖的時(shí)間不盡相同

8、。w原代細(xì)胞、成體組織的潛伏期較長(zhǎng)原代細(xì)胞、成體組織的潛伏期較長(zhǎng)，24h24h后僅見到后僅見到部分細(xì)胞開始貼壁，部分細(xì)胞開始貼壁，9 912d12d長(zhǎng)滿瓶底，細(xì)胞融合呈長(zhǎng)滿瓶底，細(xì)胞融合呈交叉重疊生長(zhǎng)。交叉重疊生長(zhǎng)。w傳代細(xì)胞系、胚胎組織或幼體細(xì)胞潛伏期短傳代細(xì)胞系、胚胎組織或幼體細(xì)胞潛伏期短，一般，一般經(jīng)過(guò)懸浮、貼壁伸展很快進(jìn)入潛伏期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，經(jīng)過(guò)懸浮、貼壁伸展很快進(jìn)入潛伏期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞大量繁殖，逐漸相連成片而長(zhǎng)滿瓶底。細(xì)胞大量繁殖，逐漸相連成片而長(zhǎng)滿瓶底。w一旦發(fā)現(xiàn)細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底一旦發(fā)現(xiàn)細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底8080就應(yīng)及時(shí)傳代，否則會(huì)就應(yīng)及時(shí)傳代，否則會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)甚至脫落。影響細(xì)胞生長(zhǎng)甚

9、至脫落。w懸浮細(xì)胞懸浮細(xì)胞當(dāng)發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)顯著、密度增大、分布稠密、當(dāng)發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)顯著、密度增大、分布稠密、培養(yǎng)液變黃時(shí)也應(yīng)及時(shí)傳代。培養(yǎng)液變黃時(shí)也應(yīng)及時(shí)傳代。Anip973注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)w標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶或皿一般成像效果都較好，但標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶或皿一般成像效果都較好，但反復(fù)刷洗過(guò)的玻璃或塑料器皿將嚴(yán)重影響分辨力。反復(fù)刷洗過(guò)的玻璃或塑料器皿將嚴(yán)重影響分辨力。w準(zhǔn)備觀察的瓶、皿要平坦，質(zhì)地均勻，透光度好，在觀察前準(zhǔn)備觀察的瓶、皿要平坦，質(zhì)地均勻，透光度好，在觀察前將培養(yǎng)瓶、皿面擦凈。將培養(yǎng)瓶、皿面擦凈。w天氣較冷時(shí)，由于溫差使培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)壁形成霧滴而影響觀察的天氣較冷時(shí)，由于溫差使培養(yǎng)

10、瓶?jī)?nèi)壁形成霧滴而影響觀察的清晰度，可輕輕將瓶?jī)A斜使瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液浸潤(rùn)內(nèi)壁，以得到好清晰度，可輕輕將瓶?jī)A斜使瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液浸潤(rùn)內(nèi)壁，以得到好的相差像。的相差像。w對(duì)原代細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行相差顯微照相，應(yīng)在換液后進(jìn)行，這樣對(duì)原代細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行相差顯微照相，應(yīng)在換液后進(jìn)行，這樣可以去除漂浮的組織塊和死細(xì)胞，提高成像清晰度。可以去除漂浮的組織塊和死細(xì)胞，提高成像清晰度。w觀察細(xì)胞時(shí)要有無(wú)菌概念，動(dòng)作要輕，避免猛烈震蕩；觀察觀察細(xì)胞時(shí)要有無(wú)菌概念，動(dòng)作要輕，避免猛烈震蕩；觀察時(shí)間不要太長(zhǎng)，觀察次數(shù)也不要太頻繁，以免影響細(xì)胞生長(zhǎng)。時(shí)間不要太長(zhǎng)，觀察次數(shù)也不要太頻繁，以免影響細(xì)胞生長(zhǎng)。 活細(xì)胞的觀察檢測(cè)方法活細(xì)胞的觀察檢測(cè)

11、方法w 暗視野顯微鏡技術(shù)觀察活細(xì)胞暗視野顯微鏡技術(shù)觀察活細(xì)胞w 縮時(shí)顯微鏡攝影觀察縮時(shí)顯微鏡攝影觀察w 體外活細(xì)胞染色觀察體外活細(xì)胞染色觀察暗視野顯微鏡技術(shù)觀察活細(xì)胞暗視野顯微鏡技術(shù)觀察活細(xì)胞（dark field microscope)原理：原理：利用特殊聚光器使光線不能進(jìn)入物鏡，經(jīng)過(guò)標(biāo)本的散射光線利用特殊聚光器使光線不能進(jìn)入物鏡，經(jīng)過(guò)標(biāo)本的散射光線使物鏡被放大，因此在黑暗背景中可呈現(xiàn)明亮的像。使物鏡被放大，因此在黑暗背景中可呈現(xiàn)明亮的像。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：反差增大，分辨率提高，可觀察到反差增大，分辨率提高，可觀察到5nm的微小質(zhì)點(diǎn)。的微小質(zhì)點(diǎn)。應(yīng)用：應(yīng)用：觀察活細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核、線粒體、細(xì)菌和霉菌

12、等。觀察活細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核、線粒體、細(xì)菌和霉菌等?？s時(shí)顯微攝影術(shù)觀察縮時(shí)顯微攝影術(shù)觀察（time-lapse cinemicrophotagraphy，TLCM）優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：可直接記錄活細(xì)胞的連續(xù)動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，能非常直觀地展現(xiàn)可直接記錄活細(xì)胞的連續(xù)動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，能非常直觀地展現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化，如細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞分裂、細(xì)胞膜變細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化，如細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞分裂、細(xì)胞膜變化、細(xì)胞死亡等過(guò)程?；?、細(xì)胞死亡等過(guò)程。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：較昂貴較昂貴體外活細(xì)胞染色觀察體外活細(xì)胞染色觀察 體外活細(xì)胞染色就是在體外培養(yǎng)條件下，用某種體外活細(xì)胞染色就是在體外培養(yǎng)條件下，用某種染料對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行染色，而不

13、影響活細(xì)胞生命活動(dòng)染料對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行染色，而不影響活細(xì)胞生命活動(dòng)的一種方法。利用這種方法，可以對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行染的一種方法。利用這種方法，可以對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行染色觀察，經(jīng)染色的培養(yǎng)物還可以繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。色觀察，經(jīng)染色的培養(yǎng)物還可以繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。堿性染料堿性染料酸性染料（酸性染料（臺(tái)盼藍(lán)臺(tái)盼藍(lán)、剛果紅、吡咯藍(lán)）、剛果紅、吡咯藍(lán)）活體染料活體染料噻嗪類（次甲基藍(lán)、甲苯胺藍(lán)）噻嗪類（次甲基藍(lán)、甲苯胺藍(lán)）惡嗪類（亮焦油藍(lán)、亮焦油紫）惡嗪類（亮焦油藍(lán)、亮焦油紫）丫嗪類（丫嗪類（中性紅中性紅、詹納斯綠）、詹納斯綠）三酚苯甲烷類（甲基紫、維克多利亞藍(lán)）三酚苯甲烷類（甲基紫、維克多利亞藍(lán)）w中性紅染色中性紅染色 常用活

14、體染料，一般濃度為常用活體染料，一般濃度為1 1：1000010000，用生理鹽，用生理鹽水（或水（或HanksHanks液）溶解后進(jìn)行高壓蒸汽滅菌暗處存液）溶解后進(jìn)行高壓蒸汽滅菌暗處存放，可直接浸染放，可直接浸染活體細(xì)胞活體細(xì)胞顯微鏡下觀察或用于細(xì)胞顯微鏡下觀察或用于細(xì)胞的病毒蝕斑，肉眼計(jì)數(shù)空斑數(shù)目。因其毒性大，染的病毒蝕斑，肉眼計(jì)數(shù)空斑數(shù)目。因其毒性大，染色后細(xì)胞不能再培養(yǎng)。色后細(xì)胞不能再培養(yǎng)。w結(jié)晶紫染色結(jié)晶紫染色 使用濃度為使用濃度為0.10.1，可用生理鹽水配制，室溫?？捎蒙睇}水配制，室溫保存。該染料對(duì)存。該染料對(duì)死、活細(xì)胞死、活細(xì)胞均著色，故只能測(cè)出細(xì)胞均著色，故只能測(cè)出細(xì)胞總數(shù)

15、。總數(shù)。w臺(tái)盼藍(lán)染色臺(tái)盼藍(lán)染色 用用0.50.5濃度的臺(tái)盼藍(lán)（濃度的臺(tái)盼藍(lán)（trypan blue)trypan blue)，用，用PBSPBS配配制，室溫保存，該染料只對(duì)制，室溫保存，該染料只對(duì)死細(xì)胞死細(xì)胞著色，可測(cè)定活著色，可測(cè)定活細(xì)胞數(shù)和計(jì)算存活百分率。細(xì)胞數(shù)和計(jì)算存活百分率。E. coli E. coli 以結(jié)晶紫以結(jié)晶紫 (crystal violet) (crystal violet) 染色染色B.cereusB.cereus以石炭酸復(fù)紅以石炭酸復(fù)紅 (carbol fuchsin) (carbol fuchsin) 染色染色aureus aureus 以甲烯藍(lán)以甲烯藍(lán) (meth

16、ylene blue) (methylene blue) 染色染色二、培養(yǎng)細(xì)胞常用的染色方法二、培養(yǎng)細(xì)胞常用的染色方法w 細(xì)胞固定的基本方法細(xì)胞固定的基本方法w 細(xì)胞常用的染色方法細(xì)胞常用的染色方法w 細(xì)胞特殊的染色方法細(xì)胞特殊的染色方法1、細(xì)胞固定的基本方法、細(xì)胞固定的基本方法w固定組織、細(xì)胞的目的：固定組織、細(xì)胞的目的： 把組織和細(xì)胞的原有結(jié)構(gòu)盡可能完整地保存下把組織和細(xì)胞的原有結(jié)構(gòu)盡可能完整地保存下來(lái)，避免組織和細(xì)胞發(fā)生降解、自溶、腐敗和變形來(lái)，避免組織和細(xì)胞發(fā)生降解、自溶、腐敗和變形等；同時(shí)，固定還可以使細(xì)胞的各部分易于著色，等；同時(shí)，固定還可以使細(xì)胞的各部分易于著色，適于觀察、長(zhǎng)期保

17、存和分析。適于觀察、長(zhǎng)期保存和分析。w固定組織、細(xì)胞的原則：固定組織、細(xì)胞的原則： 盡可能選用新鮮培養(yǎng)物；根據(jù)檢測(cè)工具、對(duì)象、盡可能選用新鮮培養(yǎng)物；根據(jù)檢測(cè)工具、對(duì)象、目的和要求選擇固定劑和固定方法。目的和要求選擇固定劑和固定方法。w固定前的準(zhǔn)備：固定前的準(zhǔn)備： 各種細(xì)胞培養(yǎng)物，如雙蓋片懸滴培養(yǎng)物、懸液培各種細(xì)胞培養(yǎng)物，如雙蓋片懸滴培養(yǎng)物、懸液培養(yǎng)物、單層培養(yǎng)物和蓋片單層培養(yǎng)物都可作固定材養(yǎng)物、單層培養(yǎng)物和蓋片單層培養(yǎng)物都可作固定材料。料。 懸浮細(xì)胞：懸浮細(xì)胞：離心（離心（8001000r/min）PBS/Hanks漂洗漂洗23次次 貼壁細(xì)胞：貼壁細(xì)胞：用鑷子輕輕取出蓋片用鑷子輕輕取出蓋片PB

18、S/Hanks漂洗漂洗23次次注：漂洗的目的是去除血清和附著于細(xì)胞表面的殘?jiān)?，注：漂洗的目的是去除血清和附著于?xì)胞表面的殘?jiān)乐蛊浞恋K染色。防止其妨礙染色。常用固定液常用固定液簡(jiǎn)單固定液：簡(jiǎn)單固定液：甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、戊二醛、苦味酸、甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、戊二醛、苦味酸、重鉻酸鉀、鋨酸等重鉻酸鉀、鋨酸等混合固定液：混合固定液：甲醇甲醇/ /醋酸固定液、醋酸固定液、FAAFAA固定液、固定液、CarnoyCarnoy固定液、固定液、BouinBouin固定液、固定液、4 4多聚甲醛多聚甲醛-PBS-PBS固定液等固定液等甲醇甲醇/ /醋酸固定液：醋酸固定液：甲醇：冰醋酸為甲醇：冰醋酸為

19、3 3：1 1，現(xiàn)用現(xiàn)配，現(xiàn)用現(xiàn)配，適用于適用于GiemsaGiemsa染色染色。FAAFAA固定液：固定液：90mL 8090mL 80酒精酒精5mL 5mL 冰乙酸冰乙酸5mL 405mL 40甲醛，甲醛，適用于蓋片單層培養(yǎng)的細(xì)胞，固定效果好。適用于蓋片單層培養(yǎng)的細(xì)胞，固定效果好。CarnoyCarnoy固定液：固定液：較好的非水溶性固定液，較好的非水溶性固定液，60mL 60mL 純酒精純酒精30mL 30mL 氯仿氯仿10mL 10mL 冰乙酸，適用于顯示細(xì)胞化學(xué)成分。冰乙酸，適用于顯示細(xì)胞化學(xué)成分。2 2、細(xì)胞常用的染色方法、細(xì)胞常用的染色方法wH.EH.E（蘇木精（蘇木精- -伊紅

20、）染色法伊紅）染色法原理：原理：堿性染料蘇木精和酸性染料伊紅分別與細(xì)胞核和細(xì)堿性染料蘇木精和酸性染料伊紅分別與細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，使細(xì)胞的微細(xì)結(jié)構(gòu)通過(guò)顏色而改變它的胞質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，使細(xì)胞的微細(xì)結(jié)構(gòu)通過(guò)顏色而改變它的折射率，從而在光鏡下能清晰地呈現(xiàn)出細(xì)胞的圖像，并折射率，從而在光鏡下能清晰地呈現(xiàn)出細(xì)胞的圖像，并能提供良好的核漿對(duì)比染色。能提供良好的核漿對(duì)比染色。染液配制：染液配制：染色步驟：染色步驟：染色結(jié)果：染色結(jié)果：細(xì)胞核染成紅色，細(xì)胞質(zhì)染成藍(lán)色。細(xì)胞核染成紅色，細(xì)胞質(zhì)染成藍(lán)色。Giemsa（吉姆薩）染色法母液配制：母液配制： GiemsaGiemsa粉粉0.5g0.5g，甘油，甘油22m

21、L22mL，將，將GiemsaGiemsa粉置于研缽粉置于研缽內(nèi)先用少量甘油與之充分混合，研磨至無(wú)顆粒；然后將剩余內(nèi)先用少量甘油與之充分混合，研磨至無(wú)顆粒；然后將剩余甘油混在一起，甘油混在一起，5656保溫保溫2h2h后，加入后，加入33mL33mL純甲醇，混勻，純甲醇，混勻，即為即為GiemsaGiemsa母液，保存于棕色瓶?jī)?nèi)。母液，保存于棕色瓶?jī)?nèi)。染液配制：染液配制：取取9 9份份pH6.87.38pH6.87.38的的SorensenSorensen緩沖液和緩沖液和1 1份份GiemsaGiemsa母液混合即可。母液混合即可。染色步驟：染色步驟：細(xì)胞標(biāo)本用甲醇細(xì)胞標(biāo)本用甲醇/ /醋酸固定

22、液固定醋酸固定液固定30min30min后，用滴管后，用滴管把染液布滿玻片上，染色把染液布滿玻片上，染色1015min1015min，用自來(lái)水沖去多余染，用自來(lái)水沖去多余染液，空氣干燥，二甲苯同名，光學(xué)樹脂封固。液，空氣干燥，二甲苯同名，光學(xué)樹脂封固。染色結(jié)果：染色結(jié)果：細(xì)胞核染成紅色，細(xì)胞質(zhì)染成藍(lán)色。細(xì)胞核染成紅色，細(xì)胞質(zhì)染成藍(lán)色。注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：染液宜現(xiàn)配現(xiàn)用，保存時(shí)間最好不用超過(guò)染液宜現(xiàn)配現(xiàn)用，保存時(shí)間最好不用超過(guò)48h48h，GiemsaGiemsa對(duì)對(duì)pHpH極敏感，緩沖液極敏感，緩沖液pHpH要調(diào)準(zhǔn)確。要調(diào)準(zhǔn)確。3、細(xì)胞特殊的染色方法、細(xì)胞特殊的染色方法w Feulgen Fe

23、ulgen染色法染色法w CoomassieCoomassie染色法染色法w PASPAS反應(yīng)法反應(yīng)法w 油紅油紅OO（oil red Ooil red O）法）法w 免疫熒光染色法免疫熒光染色法w 免疫酶染色法免疫酶染色法FeulgenFeulgen（福爾根）染色法（福爾根）染色法k 原理：原理：在在6060條件下，條件下，DNADNA分子中的嘌呤堿和脫氧核糖分子中的嘌呤堿和脫氧核糖的連鍵可被的連鍵可被1mol/L 1mol/L 鹽酸水解打開，游離出的脫氧核糖醛基鹽酸水解打開，游離出的脫氧核糖醛基能與希夫（能與希夫（SchiffSchiff）試劑結(jié)合，形成紫紅色復(fù)合物。在此過(guò)）試劑結(jié)合，形成

24、紫紅色復(fù)合物。在此過(guò)程中，程中，RNARNA不受影響，故染色具不受影響，故染色具DNADNA特異性。準(zhǔn)確的溫度特異性。準(zhǔn)確的溫度和鹽酸濃度，適宜的水溫、時(shí)間是成功的關(guān)鍵。水溫過(guò)度和鹽酸濃度，適宜的水溫、時(shí)間是成功的關(guān)鍵。水溫過(guò)度或不足均降低染色強(qiáng)度?；虿蛔憔档腿旧珡?qiáng)度。 此法能對(duì)此法能對(duì)DNA DNA 進(jìn)行特異性染色進(jìn)行特異性染色k 試劑配制：試劑配制： 1mol/L HCL1mol/L HCL：濃：濃HCL 8.5ml HCL 8.5ml 蒸餾水蒸餾水 91.5ml91.5ml Schiff Schiff試劑：母液裝入棕色瓶，蓋緊，黑紙包裹置于暗處試劑：母液裝入棕色瓶，蓋緊，黑紙包裹置于暗

25、處k 染色過(guò)程：染色過(guò)程：選用選用CarnoyCarnoy固定液固定液k 染色結(jié)果：染色結(jié)果：細(xì)胞核染成粉紅色至紫紅色，胞質(zhì)為無(wú)色。細(xì)胞核染成粉紅色至紫紅色，胞質(zhì)為無(wú)色?？捡R斯亮藍(lán)（考馬斯亮藍(lán)（CoomassieCoomassie，BBBB）染色法）染色法原理：原理：顯示細(xì)胞骨架、細(xì)胞內(nèi)微絲的染色方法顯示細(xì)胞骨架、細(xì)胞內(nèi)微絲的染色方法試劑配制：試劑配制：固定液：固定液：0.1mol/L NaH2PO42H2O 14.0mL0.1mol/L NaH2PO42H2O 14.0mL 0.1mol/L 0.1mol/L Na2HPO412H2O 36.0mLNa2HPO412H2O 36.0mL蒸餾水

26、蒸餾水50.9mL50.9mL2525戊二戊二醛醛50.0mL50.0mL染色液：甲醇染色液：甲醇46.5mL46.5mL冰醋酸冰醋酸7.0mL7.0mL考馬斯亮藍(lán)考馬斯亮藍(lán)0.02g0.02g染色過(guò)程：染色過(guò)程：染色結(jié)構(gòu)：染色結(jié)構(gòu)：細(xì)胞內(nèi)的微絲呈現(xiàn)藍(lán)色。細(xì)胞內(nèi)的微絲呈現(xiàn)藍(lán)色。過(guò)碘酸席夫反應(yīng)法過(guò)碘酸席夫反應(yīng)法（periodic acid Schiff reactionperiodic acid Schiff reaction，PASPAS） 原理：原理：過(guò)碘酸是一種強(qiáng)氧化劑，能將葡萄糖的乙二過(guò)碘酸是一種強(qiáng)氧化劑，能將葡萄糖的乙二醇基（醇基（CHOH-CHOHCHOH-CHOH）氧化成兩個(gè)游離的

27、醛基，它）氧化成兩個(gè)游離的醛基，它們與們與SchiffSchiff試劑反應(yīng)生成紫紅色產(chǎn)物。試劑反應(yīng)生成紫紅色產(chǎn)物。 細(xì)胞內(nèi)糖類的染色方法細(xì)胞內(nèi)糖類的染色方法 試劑配制：試劑配制： 染色過(guò)程：染色過(guò)程： 染色結(jié)果：染色結(jié)果：細(xì)胞含糖原區(qū)呈紫紅色。細(xì)胞含糖原區(qū)呈紫紅色。細(xì)胞內(nèi)脂類的染色方法細(xì)胞內(nèi)脂類的染色方法| 蘇丹（蘇丹（SudanSudan）/法法| 蘇丹黑法蘇丹黑法| LillieLillie油紅油紅OO（oil red Ooil red O）法）法| CainCain硫酸尼羅藍(lán)（硫酸尼羅藍(lán)（NileNile）法）法| 鋨酸（鋨酸（osmic acidosmic acid）法）法油紅油紅OO

28、（oil red Ooil red O）法）法w 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：油紅油紅OO染色的脂肪比蘇丹染色的脂肪比蘇丹法染的顏色要深，法染的顏色要深，對(duì)微小的脂滴易于顯示，而且沉淀較少。對(duì)微小的脂滴易于顯示，而且沉淀較少。w 1010中性甲醛溶液的配制中性甲醛溶液的配制pH 7.0pH 7.0：量取量取37374040甲醛甲醛20mL20mL，蒸餾水，蒸餾水180mL180mL，加入，加入0.8g 0.8g 磷酸磷酸二氫鈉二氫鈉NaHNaH2 2POPO4 4HH2 2OO、1.3g 1.3g 磷酸氫二鈉磷酸氫二鈉NaNa2 2HPOHPO4 4，配制成，配制成200mL 10200mL 10中性甲醛溶液

29、，中性甲醛溶液，密封備用。密封備用。w 免疫熒光染色法免疫熒光染色法w 原理：將已知抗體或抗原標(biāo)記熒光素，用此特異性試劑，原理：將已知抗體或抗原標(biāo)記熒光素，用此特異性試劑，浸染含有相應(yīng)抗原或抗體的組織細(xì)胞標(biāo)本，借助抗原抗體的浸染含有相應(yīng)抗原或抗體的組織細(xì)胞標(biāo)本，借助抗原抗體的特異性結(jié)合，于抗原或抗體的存在部位呈現(xiàn)熒光，從而可以特異性結(jié)合，于抗原或抗體的存在部位呈現(xiàn)熒光，從而可以定位標(biāo)本內(nèi)的抗原或抗體。定位標(biāo)本內(nèi)的抗原或抗體。w 免疫酶染色法免疫酶染色法w 原理：原理：ABCABC免疫酶染色法即卵白素免疫酶染色法即卵白素- -生物素生物素- -酶復(fù)合物法，酶復(fù)合物法，是目前最敏感的免疫細(xì)胞化學(xué)染

30、色法之一。其基本原理是將是目前最敏感的免疫細(xì)胞化學(xué)染色法之一。其基本原理是將特異性第一抗體與組織細(xì)胞相應(yīng)抗原結(jié)合后，通過(guò)生物素化特異性第一抗體與組織細(xì)胞相應(yīng)抗原結(jié)合后，通過(guò)生物素化橋抗體與第一抗體結(jié)合，借助卵白素與生物素的天然親和性橋抗體與第一抗體結(jié)合，借助卵白素與生物素的天然親和性將生物素化辣根過(guò)氧化酶連接為復(fù)合物，通過(guò)酶促反應(yīng)，顯將生物素化辣根過(guò)氧化酶連接為復(fù)合物，通過(guò)酶促反應(yīng)，顯示組織細(xì)胞相應(yīng)的抗原。示組織細(xì)胞相應(yīng)的抗原。三、細(xì)胞生長(zhǎng)狀況有關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)方法三、細(xì)胞生長(zhǎng)狀況有關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)方法w 細(xì)胞計(jì)數(shù)法細(xì)胞計(jì)數(shù)法w 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線細(xì)胞生長(zhǎng)曲線w 細(xì)胞分裂指數(shù)細(xì)胞分裂指數(shù)w 克隆形成率克隆形

31、成率1、細(xì)胞計(jì)數(shù)法、細(xì)胞計(jì)數(shù)法 細(xì)胞計(jì)數(shù)法是用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液中的細(xì)胞計(jì)數(shù)法是用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)目，以測(cè)定細(xì)胞增殖和調(diào)整細(xì)胞濃度。細(xì)胞數(shù)目，以測(cè)定細(xì)胞增殖和調(diào)整細(xì)胞濃度。 臺(tái)盼藍(lán)染色法用于檢測(cè)存活細(xì)胞數(shù)。臺(tái)盼藍(lán)染色法用于檢測(cè)存活細(xì)胞數(shù)。 注：臺(tái)盼藍(lán)染色注：臺(tái)盼藍(lán)染色排除檢測(cè)法，排除檢測(cè)法，由于死細(xì)胞的細(xì)由于死細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，染料可大量進(jìn)入?yún)s不能被排胞膜通透性發(fā)生改變，染料可大量進(jìn)入?yún)s不能被排出，因而細(xì)胞被染色；而活細(xì)胞能排出細(xì)胞內(nèi)的染出，因而細(xì)胞被染色；而活細(xì)胞能排出細(xì)胞內(nèi)的染料，因而不易著色。料，因而不易著色。Trypan blue staining o

32、f adult rat cardiac myocytes in primary culture. Live cells exclude the blue dye, and so appear clear. Dead cells take up the dye and appear blue.結(jié)果分析結(jié)果分析w細(xì)胞密度細(xì)胞密度 細(xì)胞數(shù)細(xì)胞數(shù)/ml/ml（4 4大格細(xì)胞數(shù)之和大格細(xì)胞數(shù)之和/ 4 / 4 ）10104 4稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)w細(xì)胞存活百分率細(xì)胞存活百分率 細(xì)胞活力（）未著色細(xì)胞數(shù)細(xì)胞活力（）未著色細(xì)胞數(shù)總細(xì)胞數(shù)總細(xì)胞數(shù)1001002 2、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線w細(xì)胞生長(zhǎng)曲線是細(xì)胞培

33、養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中最基本的指標(biāo)，是細(xì)胞生長(zhǎng)曲線是細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中最基本的指標(biāo)，是觀察同一代細(xì)胞的增殖過(guò)程。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線分觀察同一代細(xì)胞的增殖過(guò)程。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線分析細(xì)胞增殖析細(xì)胞增殖w方法一：方法一：在同一規(guī)格的培養(yǎng)瓶中，接種同等量的同在同一規(guī)格的培養(yǎng)瓶中，接種同等量的同一代細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)后每隔一代細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)后每隔24h24h取出幾瓶細(xì)胞進(jìn)行計(jì)取出幾瓶細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，不同時(shí)刻的細(xì)胞數(shù)為縱數(shù)，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，不同時(shí)刻的細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，即為該細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。坐標(biāo)，即為該細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。w方法二：方法二：四氮唑鹽（四氮唑鹽（MTTMTT）比色法）比色法3 3、細(xì)胞分裂指數(shù)、細(xì)胞分裂指

34、數(shù)w細(xì)胞分裂指數(shù)是表示細(xì)胞增殖旺盛程度的指標(biāo)；以被測(cè)1000個(gè)細(xì)胞中的分裂細(xì)胞數(shù)來(lái)計(jì)算。w方法：染色后血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù) 細(xì)胞分裂指數(shù)細(xì)胞分裂相數(shù)/細(xì)胞總數(shù)（1000）1004、克隆形成率、克隆形成率w克隆形成率所計(jì)數(shù)的細(xì)胞必為貼壁和有增殖能力的克隆形成率所計(jì)數(shù)的細(xì)胞必為貼壁和有增殖能力的細(xì)胞，反映細(xì)胞群體依賴性和增殖能力。細(xì)胞，反映細(xì)胞群體依賴性和增殖能力。w各種細(xì)胞克隆形成率差別很大，一般初代細(xì)胞克隆各種細(xì)胞克隆形成率差別很大，一般初代細(xì)胞克隆形成率弱，傳代細(xì)胞系強(qiáng)；二倍體細(xì)胞克隆形成率形成率弱，傳代細(xì)胞系強(qiáng)；二倍體細(xì)胞克隆形成率弱，轉(zhuǎn)化細(xì)胞系強(qiáng)；正常細(xì)胞克隆形成率弱，腫瘤弱，轉(zhuǎn)化細(xì)胞系強(qiáng)；

35、正常細(xì)胞克隆形成率弱，腫瘤細(xì)胞強(qiáng)。細(xì)胞強(qiáng)。w方法方法 克隆形成率克隆數(shù)克隆形成率克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)接種細(xì)胞數(shù)100w注意：細(xì)胞要分散好，不能有細(xì)胞團(tuán)，接種密度不注意：細(xì)胞要分散好，不能有細(xì)胞團(tuán)，接種密度不要過(guò)大。要過(guò)大。 四、細(xì)胞生物活性的化學(xué)檢測(cè)法四、細(xì)胞生物活性的化學(xué)檢測(cè)法w 四氮唑鹽（四氮唑鹽（MTTMTT）比色法）比色法w 細(xì)胞蛋白質(zhì)含量測(cè)定法細(xì)胞蛋白質(zhì)含量測(cè)定法w 細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的3 3H-H-亮氨酸摻入試驗(yàn)亮氨酸摻入試驗(yàn)w 細(xì)胞細(xì)胞DNADNA合成的合成的3 3H-TdRH-TdR摻入試驗(yàn)摻入試驗(yàn)1 1、四氮唑鹽（、四氮唑鹽（MTTMTT）比色法）比色法w原理：原理：活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能將活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能將MTTMTT黃黃色溶液色溶液還原成不溶性的還原成不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物藍(lán)紫色結(jié)晶物，并沉積于細(xì)，并沉積于細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。二甲基亞砜（胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。二甲基亞砜（DMSODMSO）和酸化的異丙醇或酸化的和酸化的異丙醇或酸化的SDSSDS等均能溶解細(xì)胞中的等均能溶解細(xì)胞中的紫藍(lán)色結(jié)晶物，用酶聯(lián)免疫檢