腫瘤生物治療張

1、 腫瘤生物治療 2001/4/5張叔人一 腫瘤生物治療發(fā)展概況早期的腫瘤免疫治療多采用非特異性免疫增強(qiáng)劑。如卡介苗（BCG）和小棒狀桿菌（C. Parvum）菌苗。膀胱癌80年代初期，Rosenburg應(yīng)用LAK過(guò)繼免疫治療晚期癌癥病人取得明顯療效，再次掀起免疫治療的高潮。（TIL CIK生物導(dǎo)彈）90年代，比利時(shí)Thierry Boon 首先應(yīng)用T細(xì)胞克隆的方法找到了人類腫瘤抗原。SEREX法發(fā)現(xiàn)了一批腫瘤抗原。DC腫瘤抗原肽腫瘤基因治療。P53 Rb針對(duì)阻止腫瘤血管生成治療腫瘤。近幾年隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，在腫瘤抗原、抗原遞呈和T細(xì)胞識(shí)別等方面均有了突破性進(jìn)展，對(duì)于腫瘤的免疫效應(yīng)機(jī)制，以及

2、腫瘤的免疫逃逸機(jī)理有了深入的認(rèn)識(shí)。眾多腫瘤免疫療法如雨后春筍般應(yīng)運(yùn)而生。腫瘤免疫治療與手術(shù)、放療、化療三大常規(guī)療法有明顯的互補(bǔ)性，在控制腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移方面展示良好前景。生物治療：應(yīng)用生物的組織、細(xì)胞、蛋白質(zhì)、多糖、基因等生物制劑 治療疾病。腫瘤的生物療法的策略：調(diào)節(jié)強(qiáng)化抗腫瘤免疫、祛除免疫抑制、直接殺傷或誘導(dǎo)腫瘤凋亡、促腫瘤分化、阻斷腫瘤營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)、提高腫瘤被殺傷的敏感性。二 腫瘤的免疫治療策略：去除免疫抑制、提高免疫原性、增強(qiáng)宿主免疫細(xì)胞的反應(yīng)性 以及免疫導(dǎo)向。1 過(guò)繼免疫治療(adoptive immunotherapy)：LAK, TIL,CIK（1） 淋巴因子活化的殺傷細(xì)胞（Lymph

3、okine Activated Killer）：制備：IL-2； 測(cè)定：51Cr釋放法、乳酸脫氫酶（LDH）釋放法National Biotherapy Study Group interleukin-2Trials: Tumor Response According to Type of Cancer Response Disease CR PR MR SD PD Total (CR+PR) % Melanoma 5 28 24 58 73 33/188 18 Lung 1 7 3 18 22 8/51 16 Breast 1 4 1 13 15 5/34 15 Renal 3 10 11

4、76 67 13/167 8 Colon 0 1 6 36 33 1/76 1 Other 0 12 4 47 59 12/122 10 Total 10 62 49 248 269 72/638 11 CR:complete response; PR:partial response, MR:mixed or minor response SD:stable disease: PD: progressive disease.rIL-2：半衰期短，給藥方式：皮內(nèi)、瘤內(nèi)、腔內(nèi)、淋巴管內(nèi)、吸入副作用：寒戰(zhàn)、發(fā)熱、惡心、乏力、心律失常、神經(jīng)異常、毛細(xì)血 管滲漏綜合癥（Capillary leak s

5、yndrome，CLS），肺水腫預(yù)防和處理：地塞米松、消炎痛、安定類、吸氧（2）其他非MHC限制性過(guò)繼免疫治療 粘附MNC A-LAK + 抗CD3 CD3AKLAK（MNC + IL-2） + 抗CD3 + IFN-g + IL-1 CIK + MEP（TCR-Vg9、Vd2） gdT MonoethylpospateLAK、CD3AK、CIK細(xì)胞活性及增殖數(shù)量 (李殿俊) LU/106 cells Cell num. x 106 Total LU LAK 23 8 104CD3AK 18 87 1566 CIK 26 78 2028TAK ： IL-2 + 抗CD3 + Tu-Ag （2）

6、 腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞 富含腫瘤細(xì)胞 1.055 - 富含TIL 1.077 -（Tumor-infiltrating lymphocyte，TIL）制備：腫瘤組織®消化（透明脂酸酶、膠原酶、DNA酶）®單細(xì)胞®密度梯度分離®富含TIL+IL-2/抗CD3/100Gy自體腫瘤標(biāo)志：CD3+/CD8+®CD3+/CD4+NK、LAK、TIL 之間的區(qū)別 NK LAK TIL來(lái)源 外周血，脾 外周血，脾 腫瘤區(qū)域抗原致敏 - - +產(chǎn)生條件 自然存在 IL-2 IL-2、Ag、抗CD3選擇性殺瘤能力 + + +抗瘤譜 窄 廣 窄MHC限制 - - +

7、體內(nèi)增殖能力 差 弱 強(qiáng)聚集腫瘤部位 差 差 強(qiáng)免疫記憶 - - +LGL 特征 + + -CD3 - -/+ +TIL和LAK體內(nèi)抗腫瘤效力的比較回輸TIL或LAK 早期荷瘤小鼠肺轉(zhuǎn)移抑制率%數(shù)量X106 TIL+IL-2 LAK+IL-20.40.5 16±812 74±12 45 96±4810 10030 12±160 28±4100 59±26200 97±2腫瘤照射滅活裂解+DC注入淋巴結(jié)區(qū)域 腹股溝取淋巴結(jié)CTL克隆擴(kuò)增回輸2 腫瘤疫苗：(1) 細(xì)胞瘤苗a.細(xì)菌或病毒佐劑瘤苗：BCG NDV b.轉(zhuǎn)基因細(xì)胞瘤苗

8、：細(xì)胞因子(IL-2 GM-CSF) MHC (class I II B7) 共刺激分子 (B7) c. 基于DC的瘤苗：負(fù)載多肽導(dǎo)入腫瘤抗原基因d.紅細(xì)胞瘤苗：RBC-唾液酸酶e.細(xì)胞融合瘤苗：腫瘤細(xì)胞B細(xì)胞DC(2)亞細(xì)胞瘤苗：exosome（外泌小體）近期發(fā)現(xiàn)DC分泌的exosome屬于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，具有多種抗原遞呈分子和T細(xì)胞共刺激分子。腫瘤抗原肽刺激的DC產(chǎn)生的exosome能夠呈遞腫瘤抗原，活化CTL，抑制和根除已建立的小鼠腫瘤，所以exosome瘤苗極具發(fā)展?jié)摿Α?3)多肽分子瘤苗：腫瘤提取抗原多肽（酸洗脫），病毒成分（HPV16-E6、E7）合成腫瘤抗原多肽，HSP(4)多糖瘤苗

9、：MUC-1(5)基因瘤苗：CEA-痘苗V、HPV、erbB2/neu3 基于抗體的免疫治療： Ag 抗體 抗抗體（1） 激活效應(yīng)細(xì)胞（抗CD3Ab®CIK，TIL，抗4-1BB®T）（2） idiotype-抗抗體 瘤苗（3） 抗腫瘤相關(guān)抗原抗體，體內(nèi)應(yīng)用直接產(chǎn)生抗瘤作用。Trustuzumab (Herceptin) anti-HER2 VL linker VH VL VH VLN VHC PP VHN VLC Base-loop L H H L K G G K 鼠Fab 人Fc(4)抗體導(dǎo)向治療¬對(duì)抗體改造 克服HAMA反應(yīng) a.小分子抗體： Single

10、chain Fv (ScFv) 1/6 Disulfide-stabilized Fv(DsFv) Permutated Fv (pFv) b.雙功能抗體（Bispecific Ab） l 雜化雜交瘤技術(shù)輕重鏈無(wú)改變 X 2 重鏈不變 X 4 重、輕鏈均變 X 4l 化學(xué)交聯(lián) Fabl 基因重組 兩套重輕鏈基因 c.嵌合抗體 (chimeric Ab) Fc d.人源化抗體 （humannized Ab） 重構(gòu)抗體, VH,VL區(qū)6個(gè)CDR移植, 骨架區(qū)的一些氨基酸同時(shí)移植 e.人源抗體：利用基因工程技術(shù)構(gòu)建的小鼠XenoMouse，產(chǎn)生抗EGFr單抗，在裸鼠模型顯示很強(qiáng)的抑瘤作用。 FcR

11、ScFv AgT cell Tumor FcR ScFv f.T-body :T細(xì)胞表達(dá)的嵌合受體（Fv或ScFv為胞外區(qū)與Fcreceptor和鏈鉸鏈區(qū)重組）。不受MHC限制，殺傷腫瘤或半抗原修飾的腫瘤。­毒素分類： 雙鏈毒素：Abrin,Ricin,Modeccin, 植物毒素 Viscumin 單鏈毒素：PAP,SAP,Lonin,Monoridin,內(nèi)化毒素 Triuchosanthin 細(xì)菌毒素：Diptheria toxin(DT),Pseudomonas exotoxin(PE), 膜活性毒素：staphylococcal a-hemolysin(aHL),strept

12、olysin O, E.coli a-hemolysin, pneumolysin, aerolysin, perferins, eqinatoxinsa.毒素改造：l PE664E(將結(jié)合細(xì)胞能力的DIa中Lys57,His246,Arg247, 和His249誘變?yōu)镚lu,使其失去結(jié)合能力）l PE40(缺失DIa，剩40KD)l PE38(從PE40的DIb中去除365-380aa)l PE38KDEL(將PE38中DIII的C端Arg-Glu-Asp-Leu-Lys用 Lys-Asp-Glu-Leu,KDEL替代，提高IT跨膜效率） Reiter證明：ScFv-PE38KDEL較ScF

13、v-PE38對(duì)直腸癌多 種細(xì)胞系細(xì)胞毒活性高3-5倍，體內(nèi)高2倍。b.雜合毒素：植物與細(xì)菌毒素雜交 100-1000倍c.基因重組毒素：融合蛋白，必須存在與天然毒素一樣的蛋白水解 位點(diǎn)，使毒素與載體內(nèi)化時(shí)解離，便于進(jìn)入胞質(zhì)，發(fā)揮 殺傷效應(yīng)。d.膜活性毒素：不需內(nèi)化，殺傷力大，毒副作用大，需改造。® 靶向治療腫瘤相關(guān)的靶抗原¯ 抗體靶向治療的臨床研究l 淋巴瘤Kaminski: 1996 131I-抗CD20 鼠源， 頑固性非何杰金氏淋巴瘤75% 患者有效，分化低的>分化高的，化療不敏感的也取 得較好療效。 Knox:90Y(釔)-抗CD20對(duì)非何杰金氏淋巴瘤有效率72

14、%（治愈率 33%）。90Y-抗個(gè)體基因型治療B細(xì)胞淋巴瘤有效率近33% 白血病人源化抗CD33單抗M195治療急性髓樣白血病和急性早幼粒細(xì)胞白血病。131I-M195與白消安或環(huán)磷酰胺合用于骨髓移植(BMT),除去排異反應(yīng)的T細(xì)胞。131I抗CD54（ICAM-1）急性髓樣白血病或急性單核細(xì)胞增多型白血病的BMT，與傳統(tǒng)全身輻射除去T細(xì)胞對(duì)正常細(xì)胞毒性小。l 結(jié)直腸癌鼠源抗表皮粘附分子單抗17-1A，對(duì)DukeC期結(jié)腸癌死亡率和復(fù)發(fā)率分別降低了30%和27%，主要與低分化腫瘤結(jié)合，ADCC，80%產(chǎn)生HAMA，但未影響療效。人源化改造。放免治療： 131I-抗A33，與骨髓也有相當(dāng)數(shù)量的結(jié)合

15、，5/23有一定的療效。125I 與靶向抗體偶聯(lián)物易為腫瘤細(xì)胞內(nèi)吞。125I-抗A33，21例患者，10例顯效，而骨髓細(xì)胞很少與125I標(biāo)記抗體作用，被射線損傷機(jī)會(huì)少。近來(lái)證明：放射偶聯(lián)物離細(xì)胞核越近，細(xì)胞毒越強(qiáng)，并成指數(shù)增加。免疫毒素：LeY-Ab與PE化學(xué)偶聯(lián)，I期研究，5/38例好轉(zhuǎn)，正常組織表達(dá)同樣靶抗原，但未受損。但是，由于毒素的免疫原性強(qiáng)，再次使用應(yīng)有效果。l 乳腺癌l 腎癌131I標(biāo)記鼠源G250，由于HAMA反應(yīng)，二次使用則失效。131I-G250人鼠嵌合型， 腫瘤富集濃度 >0.1% （每克組織達(dá)到的注射計(jì)量，一般水平為0.001%-0.01%）, 16例中的2例有輕微

16、HACA反應(yīng)。ADCC 干擾素治療腫瘤 腫瘤 療效毛細(xì)胞白血病 60-90%緩解慢性白血病 50%PR淋巴瘤 37%PR+CRKaposi氏肉瘤 26%PR急性白血病 24%PR多發(fā)性骨髓瘤 20% PR+CR神經(jīng)膠質(zhì)瘤 17% PR+CR腎細(xì)胞癌 16% PR+CR黑色素瘤 10% PR+CR 局部應(yīng)用好卵巢癌 10%PR乳腺癌 10%PR4細(xì)胞因子治療（1） 干擾素（interferon,IFN）I型干擾素:細(xì)菌、病毒®白細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等，IFN-a 166-172aa(a1、a2亞族) 無(wú)糖基；IFN-b 166aa糖蛋白；廣譜抗病毒作用，促進(jìn)多數(shù)細(xì)胞MHC I類分子的表 達(dá)

17、，提高巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、CTL抗腫瘤作用。II型干擾素:IFN-g 成熟分子143aa的糖蛋白，同源雙體形式存在，活化T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生。它可上調(diào)多種細(xì)胞MHC I類分子、II類分子表達(dá)，上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞間粘附分子-1的表達(dá)。促轉(zhuǎn)移？（2） Interleukin, IL 白細(xì)胞介素 糖蛋白18種 IL 主要生物學(xué)活性1 促T細(xì)胞分化，增殖、CTL, NK活性2促T細(xì)胞分化，增殖、CTL, NK, LAK活性3多能干細(xì)胞、T細(xì)胞增殖4促B細(xì)胞增殖，產(chǎn)生Ig, DC5 促B細(xì)胞分化6促T、B、干細(xì)胞增殖，Ig, 巨核細(xì)胞分化7促T、B細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)LAK8趨化中性、嗜堿性粒細(xì)胞、T細(xì)胞9

18、T細(xì)胞生長(zhǎng)，協(xié)同IL-3刺激肥大細(xì)胞10抑制TH1，促胸腺和肥大細(xì)胞增殖11促Ig分泌，促血小板形成12協(xié)同IL-2促進(jìn)CTL、NK、LAK分化13 促B細(xì)胞增殖14促B細(xì)胞增殖15CTL, NK, LAK活性16促進(jìn)CD4+細(xì)胞增殖，抑制病毒復(fù)制（HIV）17促IL-6、IL-8、PGE2、MCP-1、G-CSF18NK、TIL-12：l 35KD、40KD異二聚體，激發(fā)NK、LAK、T細(xì)胞增值、分化；向腫瘤趨化；誘導(dǎo)IFN-g產(chǎn)生；促巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO；抑制腫瘤血管生成；有利于 TH1細(xì)胞分化。l 臨床研究：I期 美國(guó)遺傳研究所主持安全性和耐受性 II期 另一研究組， 腎癌17人中15人出現(xiàn)

19、嚴(yán)重副作用。胃腸 道出血，肝毒性和貧血，2人死亡。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明：第一次單計(jì)量注射兩周后再多次給藥可預(yù)防毒 性反應(yīng)。SC代替iv ，減少用藥次數(shù)，未出現(xiàn)毒性反應(yīng)。l 改進(jìn)：IL-12基因®自體纖維母細(xì)胞®擴(kuò)增®注入體內(nèi)（或與滅活的瘤細(xì)胞混合，作為瘤苗）CD4+,CD8+細(xì)胞浸潤(rùn)，出現(xiàn)大量并指狀細(xì)胞。對(duì)晚期腫瘤有效。（3） 腫瘤壞死因子TNF：分為兩種，TNF -a又稱為惡質(zhì)素；TNF-b又稱為淋巴毒素。兩者都是同源三聚體。炎癥因子，與敗血癥休克、發(fā)熱、多器官衰竭、惡病質(zhì)有關(guān)。體內(nèi)外均能殺死某些類型的瘤細(xì)胞，或抑制其增殖，激活免疫細(xì)胞攻擊腫瘤，增強(qiáng)IL-2依賴的胸腺

20、細(xì)胞、T細(xì)胞增殖能力，促進(jìn)IL-2、CSF、IFN-g等淋巴因子產(chǎn)生，干擾腫瘤血液供應(yīng)。它的許多功能與IL-1相同。另一方面，腫瘤壞死因子又可促腫瘤有絲分裂、腫瘤擴(kuò)散、血管生成和惡液質(zhì)。毒性大，基因重組突變型（4） 血細(xì)胞生成因子G-CSF、GM-CSF、TPO、EPO、IL-6、SCF其他生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑： BCG、OK432、香菇多糖、中草藥（黃芪、女貞子對(duì)抗免疫抑制：PGE2-InM；Ts-CYC或低劑量輻射；反義RNA（TGF-b，IGF，IL-10）配體導(dǎo)向治療： IL-2/IL-2R、EGF/EGFR三、 抗血管生成 腫瘤長(zhǎng)至1-2mm3無(wú)新血管行成供應(yīng)營(yíng)養(yǎng)，則不能生長(zhǎng)。策略 Fou

21、r strategies (to design anti-angiogenesis agents)(1) Block the ability of the endothelial cells to break down the surrounding matrix. (2)Inhibit normal endothelial cells directly. (3)Block factors that stimulate angiogenesis. (4)Block the action of integrin, a molecule on the endothelial cell surfac

22、e.1 阻斷內(nèi)皮細(xì)胞降解周圍基質(zhì)的能力2 直接抑制正常內(nèi)皮細(xì)胞3 阻斷刺激血管生成的因子4 阻斷整合素的作用（內(nèi)皮細(xì)胞表面的分子）活化內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)的因子active endothelial cell growth and movement1 vascular endothelial growth factor (VEGF)2 fibroblast growth factor (FGF)3 angiogenin4 epidermal growth factor (EGF)5 scatter factor (SF)6 placental growth factor (PlGF)7 inter

23、leukin-8 (IL-8)8 tumor necrosis factor alpha (TNF-)天然抗血管因子naturally occurring inhibitors of angiogenesis1.Angiostatin 2.endostatin3.Interferons (IFN)4.platelet factor 4 (PF4)5.thrombospondin(凝血栓蛋白)6.transforming growth factor beta(TGF-b)7.16Kd fragment of prolactin8.tissue inhibitor of metalloprotei

24、nase-1, -2, and -3 (TIMP-1, TIMP-2 and TIMP-3) l Angiostatin血管抑素：1994年OReily研究轉(zhuǎn)移癌抑制機(jī)制時(shí)從Lewis肺癌鼠血清和尿中提取38Kda蛋白，親肝素和賴氨酸，抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)和新的血管形成。是纖溶酶原的酶解產(chǎn)物。l endostandin內(nèi)皮抑素：1997年從血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清中發(fā)現(xiàn)，20kDa，膠原XVIII的酶解產(chǎn)物，原核表達(dá)無(wú)天然折疊，可溶性差，體外無(wú)活性。皮內(nèi)注射出現(xiàn)活性。l 抗腫瘤作用：手術(shù)、放療、化療、免疫治療各有其局限性，腫瘤生長(zhǎng)嚴(yán)格依賴血管形成。腫瘤長(zhǎng)至1-2mm3無(wú)新血管行成供應(yīng)營(yíng)養(yǎng)，則不能生長(zhǎng)。

25、通過(guò)抑制血管形成對(duì)各種實(shí)體瘤均有效。血管內(nèi)皮細(xì)胞為新生血管前體，很少發(fā)生變異，治療效果穩(wěn)定不易產(chǎn)生耐藥性。對(duì)正常靜止的血管內(nèi)皮細(xì)胞無(wú)抑制作用。OReily稱其為休眠療法（dormancy therapy）。真核表達(dá)的血管抑制素有種屬差異。小鼠實(shí)驗(yàn)中達(dá)同樣抗腫瘤效果，人血管抑制素用量100mg/kg.d,小鼠血管抑制素為6mg/kg.dl 基因重組內(nèi)皮抑素皮下注射已長(zhǎng)至小鼠體重3%的多種腫瘤都縮小至鏡下可見(jiàn)水平。凋亡率是對(duì)照組的7倍之多。接種 3% endostandin endostandin ® ® ° ® ® ° 2-6個(gè)周期l

26、andostandin + Angiostatin ® 腫瘤不復(fù)發(fā)l 非實(shí)體瘤白血病血管形成在骨髓，血管形成抑制劑同樣有效。l 優(yōu)越性；¬幾乎對(duì)所有的原發(fā)和轉(zhuǎn)移瘤都有效。­不產(chǎn)生耐藥性。®無(wú)毒副作用。¯給藥途徑方便（SC）l 問(wèn)題：¬長(zhǎng)期應(yīng)用對(duì)人類能否產(chǎn)生副作用。­對(duì)自發(fā)性人類腫瘤的療效是否與小鼠實(shí)驗(yàn)效果相同。四 基因治療1 策略: 基因置換、基因修正、基因修飾、基因失活內(nèi)容：直接攻擊腫瘤（誘導(dǎo)凋亡和直接殺傷）、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、 對(duì)抗腫瘤血管生成、修飾保護(hù)正常細(xì)胞2 載體：retrovirus(RV)、adenovirus(A

27、dV)、adenoasociated virus(AAV)、herpes simpex virus(HSV)、Epstein-Barr virus(EBV)、vaccinia virus(VV)、其他真核表達(dá)質(zhì)粒 各種病毒載體的特點(diǎn) RV AdV AAV HSV類型 雙鏈RNA 雙鏈DNA 單鏈DNA 雙鏈DNA整合與細(xì)胞染色體 隨機(jī)整合 不整合 定點(diǎn)19號(hào)短臂 可整合產(chǎn)生感染病毒條件缺陷病毒穿梭載體復(fù)制：輔助缺陷病毒包裝細(xì)胞缺陷病毒病毒AdV, VV包裝細(xì)胞PA317(gag 包裝細(xì)胞 HSV或(早期病毒Pol, env) 293(E1) UV, -射線基因IE3)外源基因裝載容量 8kb

28、35kb 4.9kb >30kb感染細(xì)胞譜 廣譜，分裂期 廣譜 廣譜,輔助病毒 神經(jīng)和上皮類細(xì)胞制備效價(jià)(PFU/ml) 106-107 1012 1012 1011-1012感染效率 較低 高 高 高安全性 有風(fēng)險(xiǎn) 安全* 安全 有風(fēng)險(xiǎn)3 基因?qū)敕椒ǎ翰《靖腥?、脂質(zhì)體（圖）、電穿孔、基因槍（圖）、 裸基因注射、基因縫線等基因縫線:湯健 縫線直接涂抹DNA或通過(guò)polylysine偶聯(lián)到縫線上 血管、骨骼肌、心肌比單純注射表達(dá)率高5-10倍。尿激 酶基因縫線®微小動(dòng)脈縫合®防止吻合口血栓形成和狹窄?；蜥槪河胮olylysine將基因粘附在不銹鋼針上（75-100m

29、g DNA） ®刺入肌肉（0.2V,1mA,直流脈沖，DNA為負(fù)極無(wú)關(guān)電極為 正)®電針30分鐘®第3天表達(dá)®14天達(dá)高峰®持續(xù)一個(gè) 月。針刺捻轉(zhuǎn)為電針效率的1/3-1/5。基因球囊和支架：外源基因（反義N-ras）在冠狀動(dòng)脈中表達(dá)，抑制損傷造成的血管內(nèi)膜下增生和狹窄血管外基因轉(zhuǎn)移： a 外科切開(kāi)蘸有基因的濾紙貼于血管外膜b 可溶性纖維蛋白DNA血管周圍注射凝血酶組織凝血因子網(wǎng)狀不溶性纖維蛋白DNA復(fù)合物>天纖溶酶作用降解4 腫瘤基因治療的靶向性和組織特異性表達(dá)（1）病毒：l RV： IL-2替代其env N端部分 IL-2-Env

30、74;淋巴細(xì)胞膠聯(lián) EGF、Ab 有待評(píng)價(jià)l AdV：Ad5-纖維蛋白的糖基，經(jīng)化學(xué)修飾與一種血清類粘蛋白（ASOR）和多聚賴氨酸連接物共價(jià)連接®與ASOR+細(xì)胞結(jié)合l HSV：具有嗜神經(jīng)性，改造成只感染分裂相膠質(zhì)瘤細(xì)胞，而腦內(nèi)正常細(xì)胞不受影響。l EBV：EBNA-1是EBV復(fù)制所需唯一的反式激活因子。存在于所有的EBV轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中。pFR-tk-Zta質(zhì)粒中溶細(xì)胞性復(fù)制周期反式蛋白Zta是依賴EBV激活。（HBV-嗜肝性）（2）脂質(zhì)體：特異性配基（抗體、凝集素、病毒表面的糖蛋白） EGF p-Lys DNA + + + - - - （3）受體介導(dǎo)： 轉(zhuǎn)鐵蛋白-多聚賴氨酸/DNA&

31、#174;K562 EGF-多聚賴氨酸/DNA®K562（5） 腫瘤組織特異性表達(dá)： 組織特異性啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、反式作用因子調(diào)控表達(dá)。 AFP啟動(dòng)子/增強(qiáng)子-TK5 目的基因及其應(yīng)用（1） 抗癌基因：P53(50%人類腫瘤伴P53基因突變)，、RB、WT-1MD安德森癌癥研究中心，直接瘤內(nèi)注射P53-rAdV (106-1011PFU/3次/w x2/月 x7個(gè)月), 安全和效果，以及3天前注射順鉑80mg/m2。雖然每例患者均出現(xiàn)抗AdV抗體，但不影響轉(zhuǎn)染效率和治療效果。 33例復(fù)發(fā)性頭頸癌，2 PR，1 CR。Wild type P53產(chǎn)物也可用作腫瘤疫苗。（2） 免疫細(xì)胞因子基

32、因：IFN、IL、GM-CSF、TNF（3） 抗血管生成因子； angiostatin、endostatin（4） 轉(zhuǎn)化預(yù)施藥物的酶類：virus-directed enzyme prodrug therapy 無(wú)毒 胞嘧啶脫氨酶(CD) 有毒5-氟胞嘧啶（5-FC） 5-氟尿嘧啶(5-FU) AFP調(diào)控-胸腺嘧啶核苷激酶（TK） 6-甲氧基嘌呤阿拉伯糖（araM） 腺嘌呤阿拉伯糖苷三磷酸（araATP）（5） 膜抗原：MHC、B7、異種MHC class I > 同種MHC class I Allovectin（HLA-B7/b2m，質(zhì)粒DNA陽(yáng)離子脂質(zhì)體）瘤內(nèi)注 射，9例放化療無(wú)效的

33、頭頸鱗癌，4例PR，1例活17個(gè)月。6 反義核酸： 作用機(jī)制：¬與靶基因正義RNA形成復(fù)合物而被核酶剪切降解； ­結(jié)合到靶基因的mRNA與5非編碼區(qū)，抑制RNA與40S核糖體 亞單位的結(jié)合；®結(jié)合到靶基因前mRNA上，影響前mRNA的有效 拼接；¯結(jié)合到已經(jīng)拼接的mRNA上，影響其從胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到胞漿； °影響細(xì)胞內(nèi)RNA產(chǎn)生和降解的一系列程序；±針對(duì)靶基因5 非編碼區(qū)調(diào)控序列（啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄因子）阻止靶基因轉(zhuǎn)錄。l 癌基因作靶基因： c-myc,細(xì)胞分裂進(jìn)入S期所必需的。腫瘤廠伴有表達(dá)失控。 22號(hào)染色體bcr與9號(hào)染色體c-abl交互易

34、位®bcr-abl®致癌 （慢性粒細(xì)胞白血病的治療和骨髓凈化） Bcl-2，腫瘤過(guò)渡表達(dá)Bcl-2抑制正常的凋亡途徑。 Ha-ras,膀胱癌Ha-ras第12號(hào)密碼子突變（G®T），針對(duì)突變 其他：從c-jun、c-myb、N-ras、c-fos、c-sis、c-erbB2、l 生長(zhǎng)因子及其受體基因作靶基因：腫瘤長(zhǎng)生某些生長(zhǎng)因子及其受體高表達(dá)，（自分泌和旁分泌）促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)IGF-1R，其反義核酸抑制腫瘤增殖比抗IGF-1R抗體有效bFGF，神經(jīng)膠質(zhì)瘤高表達(dá)TGF-a/EGF-R，促細(xì)胞轉(zhuǎn)化，增殖VEGFl 細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)相關(guān)物質(zhì)的基因PKA/Ria，腫瘤高表達(dá)

35、（結(jié)腸癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、乳癌、胃癌）l 細(xì)胞周期調(diào)控物質(zhì)的基因細(xì)胞周期蛋白cyclin D1-細(xì)胞增殖“油門”、“加速器”：其反義核酸抑制細(xì)胞G1向S期轉(zhuǎn)換，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)，惡性表型逆轉(zhuǎn)。l 酶類基因作靶點(diǎn)參與DNA合成與復(fù)制的酶：胸苷酸激酶、胸苷酸合成酶、核糖核酸還原酶、二氫葉酸還原酶；DNA聚合酶、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II-a亞基。許多化療藥物以此為靶點(diǎn)。l 其他：多藥耐藥基因mdr1、CD44（粘附分子，腫瘤轉(zhuǎn)移）l 理想反義核酸治療靶基因的條件：a 腫瘤發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用，而不是部分作用。b 只在腫瘤表達(dá)，正常組織不表達(dá)。（近期，端粒酶，除生殖腺細(xì)胞以外，正

36、常組織均為陰性。）7 基因治療的問(wèn)題和發(fā)展方向：（1） 構(gòu)建更為安全的病毒載體 （2）腫瘤特異性導(dǎo)向 （3） 腫瘤特異性表達(dá) （4）高效載體系統(tǒng)（5）載體的可控性 （6）多基因轉(zhuǎn)導(dǎo)協(xié)同效應(yīng)（7）新的目的基因 （8）與其他治療手段有機(jī)結(jié)合五、增殖病毒治療腫瘤 1根據(jù)病毒在腫瘤內(nèi)特異性增殖機(jī)制分三大類：¬ 選擇進(jìn)入細(xì)胞: 有些病毒具有組織親和性®改變結(jié)合蛋白®與特 定腫瘤組織結(jié)合。尚無(wú)重大進(jìn)展。­ 選擇性轉(zhuǎn)錄病毒增殖必須基因：腫瘤特異性啟動(dòng)子或增強(qiáng)子插入病毒增殖必須基因的上游。Johns Hopkins大學(xué) 治療前列腺癌I期 PG-P （前列腺素特異性啟動(dòng)子

37、） AdV P E1A P PG-P E1A另：人腺血管舒緩啟動(dòng)子控制E1B，該病毒殺傷前列腺癌細(xì)胞比殺傷正常細(xì)胞高10000倍。二軍大EB病毒潛伏感染細(xì)胞特異性激活的增強(qiáng)子和啟動(dòng)子控制AdV的E1A、E1B殺傷EBV感染的細(xì)胞和瘤細(xì)胞。（鼻咽癌、淋巴瘤、胃癌）® 將病毒在正常細(xì)胞中復(fù)制所必須,而在腫瘤細(xì)胞中非必須的病毒基因選擇性缺失AdV® 正常細(xì)胞®激活P53®APO®AdV復(fù)制終止 E1B55kd (-) AdV增殖復(fù)制®細(xì)胞溶解®再感染 AdV ®腫瘤: P53突變或缺失AdV 缺失E1B55kd 

38、4; 正常細(xì)胞®激活P53®APO®AdV復(fù)制終止 腫瘤細(xì)胞®AdV增殖復(fù)制®細(xì)胞溶解®再感染®消滅腫瘤美國(guó)ONYX生化制藥公司:缺失E1B55kd的AdV 命名為ONYX-015。對(duì)5株正常細(xì)胞無(wú)明顯殺傷。最近數(shù)個(gè)研究小組的結(jié)果認(rèn)為：ONYX-015作用機(jī)制與P53突變無(wú)關(guān)。I期臨床:5例復(fù)發(fā)新頭頸鱗癌（1次/4w）瘤內(nèi)注射，3例PR； 9例（1次/日，x5, 4x109-5x1010PFU）5例多療程， 6例腫瘤壞死（30-90%）3例PR，3例MRII期臨床:常規(guī)治療無(wú)效的頭頸部腫瘤 ONYX-015 + 化療PR 6

39、3%, CR 27% 明顯優(yōu)于單純化療組(1999.9.開(kāi)始III期)Georgetown大學(xué)將HSV復(fù)制必須的基因核糖核酸還原酶活T脫氧核糖核苷酶（MSV-TK）失活，只能在含有上述酶豐富的、分裂迅速的細(xì)胞內(nèi)增殖，在正常CNS細(xì)胞不能增殖（治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤）。為安全剔除的致腦炎病毒基因，稱G207,幾乎對(duì)所有實(shí)體瘤有效。2其他幾種特異性殺傷腫瘤病毒l 呼吸道腸道過(guò)濾性病毒（reovirus）®感染后早期病毒基因轉(zhuǎn)錄®激活雙鏈RNA激活蛋白激酶（PKR）®抑制病毒其他基因轉(zhuǎn)錄®抑制病毒有效復(fù)制。 癌®Ras激活®抑制PKR®病

40、毒有效復(fù)制®殺瘤加拿大Calgary大學(xué)用該病毒治療Ras高表達(dá)人膠質(zhì)瘤SCID小鼠模型，65%-80% 腫瘤明顯縮小或消退。對(duì)乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌同樣有效。將進(jìn)入臨床。l NDV，自主小病毒3增殖病毒關(guān)注的幾個(gè)研究方向¬ 增殖病毒攜帶目的基因：IL-2、HSV-tk、CD（胞嘧啶脫氨酶）， 增強(qiáng)抗腫瘤作用。­ 減少病毒的免疫原性：更換不同血清型的AdV；IL-12、IFN-g抑 制中和抗體產(chǎn)生。® 尋找腫瘤特異性增強(qiáng)子、啟動(dòng)子，控制病毒增殖必須基因，產(chǎn)生 新型腫瘤特異性增殖病毒。4 選擇增殖病毒時(shí)，病毒應(yīng)有以下特征： ¬ 必須能在腫瘤內(nèi)選

41、擇性增殖，并溶解瘤細(xì)胞； ­ 病毒所導(dǎo)致的人類疾病必須是輕微的，已熟知的。如有致病性 需有有效抗病毒治療方法； ® 該病毒增殖和治病的基因均已清楚； ¯ 具有遺傳穩(wěn)定性極少能恢復(fù)為野生型病毒； ° 不整合到人的基因組； ± 容易產(chǎn)生高滴度的病毒，易于生產(chǎn)純化； ² 體內(nèi)能感染多種組織及細(xì)胞； ³ 有理想的動(dòng)物模型進(jìn)行臨床前毒性研究。六抗端粒酶治療腫瘤1 端粒、端粒酶與腫瘤的關(guān)系（1）端粒和端粒酶l 三四十年代，染色體末端存在一種維持染色體穩(wěn)定和完整的特殊結(jié)構(gòu)端粒（telomere）,它能防止染色體DNA降解、末端融合、缺失和

42、非正常重組。l 八十年代，端粒結(jié)構(gòu)：端粒DNA-端粒結(jié)構(gòu)蛋白。人和脊椎動(dòng)物端粒DNA均為（TTAGGG）nDNA 5 3 3 RNA 5 端粒DNA l 1985年，四膜蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)端粒酶（telomerase）。1998年，耶魯大學(xué)Morin從人宮頸癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)人端粒酶。端粒酶：是一種核糖核蛋白，由蛋白質(zhì)和與端立互補(bǔ)的RNA組成，它能以自身RNA為膜板合成端粒DNA，本質(zhì)上屬你轉(zhuǎn)錄酶。 端粒酶 RNA 蛋白質(zhì) 端粒 DNA尖毛蟲(chóng)屬（2） 腫瘤的“端粒-端粒酶”假說(shuō) 1991年，Harley提出“端粒-端粒酶”假說(shuō)。他認(rèn)為：端?？赡苁羌?xì)胞有絲分裂的計(jì)時(shí)鐘（mitotic clock）。細(xì)胞在有絲分裂中，端粒DNA不斷丟失，使端?？s短。縮短到一定程度時(shí)可能觸發(fā)某種信號(hào)，退出細(xì)胞周期而老化，死亡。此階段端粒酶被激活，恢復(fù)端粒的功能，使細(xì)胞逃避死亡而獲得永生化（腫瘤）。（3） 端粒酶與腫瘤的關(guān)系 “端