動物科學微生物實驗指導（Word）

1、 動物微生物學實驗指導1 / 69目 錄實驗1細菌的簡單染色和革蘭氏染色實驗2細菌的芽胞、莢膜、鞭毛染色及運動性觀察實驗3 微生物細胞形態(tài)及菌落特征觀察實驗4培養(yǎng)基制作、滅菌消毒及無菌操作接種技術實驗5微生物的分離純化與稀釋平板菌落計數(shù)實驗6微生物細胞大小測定及顯微鏡直接計數(shù)附錄1 常用培養(yǎng)基配方附錄2 常用染色液的配制附錄3 常用試劑和指示劑的配制參考書目實驗1細菌的簡單染色和革蘭氏染色一、實驗目的1、 學習細菌的簡單染色法和革蘭氏染色法；2、 學習顯微鏡油鏡觀察的方法；二、實驗內(nèi)容1、 細菌的簡單染色；2、 細菌的革蘭氏染色；三、實驗原理簡單染色法是一種最基本的染色方法，是只用一種染料使細

2、菌著色以顯示其形態(tài)的方法。因細菌蛋白質(zhì)等電點較低，當它生長于中性、堿性或弱酸性的溶液中時常帶負電荷，而堿性染料的離子帶正電荷，能和帶負電荷的物質(zhì)結(jié)合。所以通常采用堿性染料（如美藍、結(jié)晶紫、堿性復紅、孔雀綠或蕃紅）等進行染色，當這類染料解離后，染料離子帶正電荷，使菌體著色。簡單染色一般難于辨別細菌細胞的構(gòu)造。革蘭氏染色法是細菌學中廣泛使用的重要鑒別染色反應。通過革蘭氏染色法可將所有的細菌區(qū)分為革蘭氏陽性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G）兩大類。這是因為兩類菌的細胞壁結(jié)構(gòu)和成分的不同，G菌的細胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質(zhì)，而且肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低，故用乙醇或丙酮脫色時溶解了類脂質(zhì)，增加了細胞壁

3、的通透性，使初染的結(jié)晶紫和碘復合物易于滲出，結(jié)果細菌就被脫色，再經(jīng)過蕃紅復染后就成紅色。G+菌細胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細菌仍保留初染時的顏色，即紫色。四、實驗材料1、活材料：培養(yǎng)1216h的蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis）、枯草桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），培養(yǎng)24h 的大腸桿菌（Escherichia coli）。2、染色液和試劑：結(jié)晶紫、盧哥氏碘液、95%酒精、蕃紅、復紅、二甲苯、香柏油。五、實驗用品廢液缸、洗

4、瓶、載玻片、接種杯、酒精燈、擦鏡紙、吸水紙、滴管、玻片擱架、鑷子、無菌水、75%乙醇浸泡的消毒棉球、盛有75%乙醇的玻片回收缸、生物顯微鏡等。六、實驗方法（一）簡單染色1、涂片：用消毒棉球擦拭雙手，用鑷子取干凈載玻片一塊，在載玻片的左、右兩端各加一滴蒸餾水，按無菌操作法取菌涂片，左邊涂蘇云金芽胞桿菌，右邊涂大腸桿菌，做成濃菌懸液。再取干凈載玻片一塊，挑剛制成的蘇云金芽胞桿菌濃菌懸液23環(huán)涂在左邊制成薄的涂面，將大腸桿菌的濃菌液取23環(huán)涂在右邊制成薄涂面。亦可直接在載玻片上制薄的涂面，注意取菌不要太多。2、晾干：讓涂片自然晾干或者在酒精燈火焰上方用文火烘干。是否還有其它方法？3、固定：手執(zhí)玻片一

5、端，讓菌膜朝上，通過火焰23次固定，以不燙手為宜。為什么要進行該步驟？4、染色：用將固定過的涂片放在廢液缸上的擱架上，加復紅染色12min。5、水洗：水洗去涂片上的染色液。6、干燥：將洗過的涂片放在空氣中晾干或用吸水紙吸干，勿將菌體擦掉。7、鏡檢：先低倍觀察，再高倍觀察，并找出適當?shù)囊曇昂?，將高倍鏡轉(zhuǎn)出，在涂片上加香柏油一滴，將油鏡頭浸入油滴中仔細調(diào)焦觀察細菌的形態(tài)。怎樣操作才能做到既快而又不易損壞玻片地調(diào)準焦距？（二）革蘭氏染色1、涂片：涂片方法與簡單染色涂片法相同。涂片厚薄對結(jié)果有影響嗎？2、晾干：與簡單染色法相同。3、固定：與簡單染色法相同。4、結(jié)晶紫初染色：將玻片置于廢液缸玻片擱架上，

6、加適量的結(jié)晶紫染色液染色1min，以蓋滿細菌涂面為宜。之后傾去染色液，用水小心地沖洗。 5、碘液媒染：滴加盧哥氏碘液，媒染1min后用水洗去碘液。此步可否省去？ 6、脫色：將玻片傾斜，連續(xù)滴加95%乙醇，脫色2025s至流出液無色，立即水洗。為什么要立即水洗？7、復染：滴加蕃紅復染25min，然后用水洗去涂片上的番紅染色液。 8、晾干：將染好的涂片放空氣中晾干或者用吸水紙吸干。9、鏡檢：鏡檢時先用低倍，再用高倍，最后用油鏡觀察，并判斷菌體的革蘭氏染色反應性。10、實驗完畢后的處理 將浸過油的鏡頭按下述方法擦試干凈:先用擦鏡紙將油鏡頭上的油擦去；用擦鏡紙沾少許二甲苯將鏡頭擦23次；再用干凈的擦鏡

7、紙將鏡頭擦23次，注意擦鏡頭時向一個方向擦試。 觀察后的染色玻片用廢紙將香柏油擦干凈，并放入盛有75%乙醇溶液的回收缸中。 顯微鏡復原并做好使用情況登記。七、作業(yè)與思考（一）、繪圖1、 簡單染色后繪出蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis）、枯草桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大腸桿菌（Escherichia coli）的形態(tài)圖。2、 革蘭氏染色后繪圖并注明金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大腸桿菌（Escherichia coli）兩菌的革蘭氏染色的反應性。（二）思考題

8、1、 在取菌涂片的過程中怎樣操作才能保證斜面菌種不受到污染？2、 革蘭氏染色反應成敗的關鍵操作是哪一步？為什么？3、 為什么革蘭氏染色法要選用幼齡菌種？實驗2細菌的芽胞、莢膜、鞭毛染色及運動性觀察一、實驗目的1、 學習并掌握細菌芽胞染色法，初步了解芽胞桿菌的形態(tài)特征；2、 學習并掌握細菌莢膜染色法；3、 學習并初步掌握細菌鞭毛染色法，觀察細菌鞭毛的形態(tài)特征；4、 學習用壓滴法和懸滴法觀察細菌的運動性。二、實驗內(nèi)容1、 細菌芽胞染色；2、 細菌莢膜染色；3、 細菌鞭毛染色；4、 細菌的運動性觀察。三、實驗原理細菌的芽胞壁較細胞壁厚而致密，透性低，不易著色，也不易脫色，若用一般染色法只能使菌體著色

9、而芽胞不著色，芽胞呈無色透明狀。芽胞染色法就是基于細菌的芽胞和菌體對染料的親和力不同，用不同的染料進行著色，使芽胞和菌體呈現(xiàn)不同的顏色而加以區(qū)別。所有的芽胞染色法都基于同一個原則：除了用著色力強的染料外，還需要加熱，以促進芽胞著色。當芽胞著色時，菌體也會著色，然后水洗，芽胞染上的顏色難以滲出，而菌體會脫色。再用對比度強的染料對菌體復染，使菌體和芽胞呈現(xiàn)出不同的顏色，形成鮮明的對照，便于觀察。莢膜是包在細菌細胞壁外面的一層黏膠狀或膠質(zhì)狀物質(zhì)，成分為多糖、糖蛋白或多肽，與染料間的親和力弱，不易著色，故通常采用負染色法染莢膜，即設法使菌體和背景著色而莢膜不著色，從而使莢膜在菌體周圍呈一淺色或無色的透

10、明圈。由于莢膜的含水量在90%以上，故染色時一般不加熱固定，以免莢膜皺縮變形，影響觀察結(jié)果。細菌的鞭毛極細，直徑一般為1020nm ,超過了普通光學顯微鏡的分辨力，只有用電子顯微鏡才能觀察到。但是，如采用特殊的染色法，將鞭毛直徑加粗，則在普通光學顯微鏡下也能看到它。鞭毛染色的方法很多，但其基本原理相同，即在染色前先用媒染劑處理，讓它沉積在鞭毛上，使鞭毛直徑加粗，然后再進行染色。常用的媒染劑由丹寧酸和氯化高鐵或鉀明礬等配制而成。細菌是否具有鞭毛是細菌分類鑒定重要特征之一。采用鞭毛染色法雖能觀察到鞭毛的形態(tài)、著生位置和數(shù)目，但此法既費時又麻煩。如果只需查清供試菌是否有鞭毛，可采用懸滴法或水封片法即

11、壓滴法，直接在光學顯微鏡下檢查活細菌是否具有運動能力，以此來判斷細菌是否有鞭毛。此法較快速、簡便。懸滴法就是將菌液滴加在潔凈的蓋玻片中央，在其周邊涂上凡士林，然后將它倒蓋在有凹槽的載玻片中央，即可放置在普通光學顯微鏡下觀察。水封片法是將菌液滴在普通的載玻片上，然后蓋上蓋玻片，置顯微鏡下觀察。細菌依賴鞭毛的運動方式，與鞭毛的排列形式和數(shù)目有關，但根據(jù)細菌的運動方式，對鞭毛的數(shù)目和排列方式只能作大致判斷。單毛菌和叢毛菌多做直線運動，周毛菌多做翻轉(zhuǎn)運動。依賴鞭毛的運動稱為真性運動。無鞭毛細菌做左右顫動而不改變其位置，這種運動稱為非真性運動，亦稱布朗運動。四、實驗材料1、活材料：培養(yǎng)36h的蘇云金芽胞

12、桿菌（Bacillus thuringiensis）或者枯草桿菌（Bacillus subtilis）；培養(yǎng)35d的膠質(zhì)芽胞桿菌（Bacillus mucilaginosus，俗稱“鉀細菌”），該菌在甘露醇作碳源的培養(yǎng)基上生長時，莢膜豐厚；培養(yǎng)1216h 的水稻黃單胞菌（Xanthomonas oryzae ），黏質(zhì)賽氏桿菌（Serratia marcescens ）或熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens ）斜面菌種；培養(yǎng)1216h的枯草桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）以及熒光假單胞菌（Pseudo

13、monas Fluorescens）。2、染色液和試劑：5%孔雀綠水溶液、0.5%番紅水溶液；Tyler法染色液、用濾紙過濾后的繪圖墨水、復紅染色液、黑素、6%葡萄糖水溶液、1%甲基紫水溶液、甲醇、20%CUSO4水溶液；硝酸銀染色液（包括A液和B液，）、Leifson 染色液；香柏油、二甲苯。五、實驗用品小試管（75mm×10mm）、燒杯（300mL）、載玻片、凹載玻片、蓋玻片、滴管、廢液缸、玻片擱架、接種環(huán)、擦鏡紙、吸水紙、鑷子、記號筆、洗瓶、凡士林、無菌水、水浴鍋、生物顯微鏡等。 六、實驗方法（一）細菌芽胞染色1、改良的Schaeffer和Fulton氏染色法制備菌液：加12滴

14、無菌水于小試管中，用接種環(huán)從斜面上挑取23環(huán)菌體于試管中并充分打勻，制成濃稠的菌液。為什么要制成濃稠的菌液？加染色液：加5%孔雀綠水溶液23滴于小試管中，用接種環(huán)攪拌使染料與菌液充分混合。加熱：將此試管浸于沸水浴，加熱1520min。涂片：用接種環(huán)從試管底部挑數(shù)環(huán)菌液于潔凈的載玻片上，做成涂面，晾干。固定：將涂片通過酒精燈火焰3次。脫色：用水洗直至流出的水中無孔雀綠顏色為止。復染：加番紅水溶液染色5min后，傾去染色液，不用水洗，直接用吸水紙吸干。鏡檢：先低倍，再高倍，最后用油鏡觀察。結(jié)果：芽胞呈綠色，芽胞囊和菌體為紅色。2、Schaeffer與Fulton氏染色法涂片：按常規(guī)方法將待檢細菌制

15、成一薄的涂片。晾干固定：待涂片晾干后在酒精燈火焰上通過23次。染色：加染色液：加5%孔雀綠水溶液于涂片處（染料以鋪滿涂片為度），然后，將涂片放在銅板上，用酒精燈火焰加熱至染液冒蒸汽時開始計算時間，約維持1520min。加熱過程中要隨時添加染色液，切勿讓標本干涸。加熱時溫度可否太高？水洗：待玻片冷卻后，用水輕輕地沖洗，直至流出的水中無染色液為止。復染：用番紅液染色5min。水洗、晾干或吸干。鏡檢：先低倍、再高倍，最后在油鏡下觀察芽胞和菌體的形態(tài)。結(jié)果：芽胞呈綠色，菌體為紅色。（二）細菌莢膜染色細菌莢膜染色方法很多，其中以濕墨水方法較簡便，并且適用于各種有莢膜的細菌。如用相差顯微鏡檢查則效果更佳。

16、1、負染色法制片：取潔凈的載玻片一塊，加蒸餾水一滴，取23環(huán)菌體放入水滴中混勻并涂布。干燥：將涂片放在空氣中晾干或用電吹風冷風吹干。為什么不能在火焰上方烘干？染色：在涂面上加復紅染色液染色23min。水洗：用水洗去復紅染液。干燥：將染色片放空氣中晾干或用電吹風冷風吹干。涂黑素：在染色涂面左邊加一小滴黑素，用一邊緣光滑的載玻片輕輕接觸黑素，使黑素沿玻片邊緣散開，然后向右一拖，使黑素在染色涂面上成為一薄層，并迅速風干。鏡檢：先低倍鏡，再高倍鏡觀察。結(jié)果：背景灰色，菌體紅色，莢膜無色透明。2、濕墨水法制菌液：加1滴墨水于潔凈的載玻片上，挑23環(huán)菌體與其充分混合均勻。加蓋玻片：放一清潔蓋玻片于混合液上

17、，然后在蓋玻片上放一張濾紙，向下輕壓，吸去多余的菌液。加蓋玻片時勿留氣泡，以免影響觀察。鏡檢：先用低倍鏡、再用高倍鏡觀察。結(jié)果，背景灰色，菌體較暗，在其周圍呈現(xiàn)一明亮的透明圈即為莢膜。3、干墨水法制菌液：加1滴6%葡萄糖液于潔凈載玻片一端，挑23環(huán)膠質(zhì)芽胞桿菌，與葡萄糖液充分混合，再加1環(huán)墨水，充分混勻。為什么加6%葡萄糖液？制片：左手執(zhí)玻片，右手另拿一邊緣光滑的載玻片，將載玻片的一邊與菌液接觸，使菌液沿玻片接觸處散開，然后以30度角，迅速而均勻地將菌液拉向玻片的一端，使菌液鋪成一薄膜。干燥：空氣中自然干燥。固定：用甲醇浸沒涂片，固定1min，立即傾去甲醇。干燥：在酒精燈上方，用文火干燥。染色

18、：用甲基紫染12min。水洗：用自來水輕洗，自然干燥。鏡檢：先用低倍鏡觀察，再用高倍鏡觀察。結(jié)果：背景灰色，菌體紫色，莢膜呈一清晰透明圈。4、Tyler法涂片：按常規(guī)法涂片，可挑23環(huán)菌體與水充分混合，并將黏稠的菌液盡量涂開，但涂布的面積不宜過大。干燥：在空氣中自然干燥。染色：用Tyler染色液染57min。脫色：用20%CUCO4水溶液洗去結(jié)晶紫，脫色要適度，沖洗2遍即可。用吸水紙吸干，并立即加12滴香柏油于涂片處，以防止CUCO4結(jié)晶的形成。為什么是用20%CUCO4脫色，而不是用水洗脫色？鏡檢：先用低倍鏡觀察，再用高倍鏡觀察。觀察完畢后注意用二甲苯擦去鏡頭上的香柏油。結(jié)果：背景藍紫色，菌

19、體紫色，莢膜無色或淺紫色。（三）細菌鞭毛染色1、鍍銀法染色清洗玻片選擇光滑無裂痕的玻片，最好選用新的。為了避免玻片相互重迭，應將玻片插在專用金屬架上，然后將玻片置洗衣粉過濾液中，洗衣粉煮沸后用濾紙過濾，以除去粗顆粒，煮沸20min。取出稍冷后用自來水沖洗、晾干，再放入濃洗液中浸泡56天。濃洗液的成分是：重鉻酸鉀60g ,濃硫酸460mL ,水300mL；配制方法是：重鉻酸鉀溶解在溫水中，冷卻后再徐徐加入濃硫酸。使用前取出玻片，用自來水沖去殘酸，再用蒸餾水洗。將水瀝干后，放入95%乙醇中脫水。菌液的制備及制片菌齡較老的細菌容易脫落鞭毛，所以在染色前應將待染細菌在新配制的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面上連

20、續(xù)移接35代，要求培養(yǎng)基表面濕潤，斜面基部含有冷凝水，以增強細菌的運動力。最后一代菌種放恒溫箱中培養(yǎng)1216h。然后，用接種環(huán)挑取斜面與冷凝水交接處的菌液35環(huán)，移至盛有12mL無菌水的試管中，使菌液呈輕度混濁。將該試管放在37恒溫箱中靜置10min。放置時間不宜太長，否則鞭毛會脫落，讓幼齡菌的鞭毛松展開。然后，吸取少量菌液滴在潔凈玻片的一端，立即將玻片傾斜，使菌液緩慢地流向另一端，用吸水紙吸去多余的菌液。讓涂片自然干燥。用于鞭毛染色的菌體也可用半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)。方法是將0.30.4%的瓊脂牛肉膏培養(yǎng)基熔化后倒入無菌平皿中，待凝固后，在平板中央點接活化了34代的細菌，恒溫培養(yǎng)1216h后，取擴

21、散菌落邊緣的菌體制作涂片。染色滴加A液，染46min。用蒸餾水充分洗凈A液。用B液沖去殘水，再加B液于玻片上，在酒精燈火焰上加熱至冒氣，約維持0.51min，加熱時應隨時補充蒸發(fā)掉的染料，不可使玻片出現(xiàn)干涸區(qū)。用蒸餾水洗，自然干燥。鏡檢：先低倍，再高倍，最后用油鏡檢查。結(jié)果：菌體呈深褐色，鞭毛呈淺褐色。2、改良Leifson染色法清洗玻片法同前。配制染料：見附錄2-9。染料配好后要過濾1520次后染色效果才好。菌液的制備及涂片。菌液的制備同前。用記號筆在潔凈的玻片上劃分34個相等的區(qū)域。放1滴菌液于第一個小區(qū)的一端，將玻片傾斜，讓菌液流向另一端，并用濾紙吸去多余的菌液。干燥在空氣中自然干燥。染

22、色加染色液于第一區(qū)，使染料覆蓋涂片。隔數(shù)分鐘后再將染料加入第二區(qū)，依此類推，相隔時間可自行決定，其目的是確定最合適的染色時間，而且節(jié)約材料。水洗：在沒有傾去染料的情況下，就用蒸餾水輕輕地沖去染料，否則會增加背景的沉淀。干燥：自然干燥。鏡檢：先低倍觀察，再高倍觀察，最后再用油鏡觀察，觀察時要多找一些視野，不要指望在12個視野中就能看到細菌的鞭毛。結(jié)果：菌體和鞭毛均染成紅色。（四）細菌的運動性觀察1、制備菌液：在幼齡菌斜面上，滴加34mL無菌水，制成輕度混濁的菌懸液。2、涂凡士林：取潔凈無油的蓋玻片1塊，在其四周涂少量的凡士林。3、滴加菌液：加1滴菌液于蓋玻片的中央，并用記號筆在菌液的邊緣做一記號

23、，以便在顯微鏡觀察時，易于尋找菌液的位置。4、蓋凹玻片：將凹玻片的凹槽對準蓋玻片中央的菌液，并輕輕地蓋在蓋玻片上，使兩者粘在一起，然后翻轉(zhuǎn)凹玻片，使菌液正好懸在凹槽的中央，再用鉛筆或火柴棒輕輕壓蓋玻片，使玻片四周邊緣閉合，以防菌液干燥（圖2-1）。若制水浸片，在載玻片上滴加一滴菌液，蓋上蓋玻片后即可置顯微鏡下觀察。圖2-1 懸滴標本的制備（自黃秀梨）5、鏡檢：先用低倍鏡找到標記，再稍微移動凹玻片即可找到菌滴的邊緣，然后將菌液移到視野中央高倍鏡觀察。由于菌體是透明的，鏡檢時 可適當縮小光圈或降低聚光器以增大反差，便于觀察。鏡檢時要仔細辨別是細菌的運動，還是分子作布朗運動，前者在視野下可見細菌自一

24、處游動至它處，而后者僅在原處左右擺動。細菌的運動速度依菌種不同而異，應仔細觀察。結(jié)果：有鞭毛的枯草桿菌和假單胞菌可看到活躍的活動，而無鞭毛的金黃色葡萄球菌不運動。七、作業(yè)與思考（一）繪圖：繪出所用材料的芽胞和菌體的形態(tài)圖；繪出Bacillus mucilaginosus的莢膜和菌體形態(tài)圖，并注明各部位的名稱；繪出鞭毛菌的形態(tài)圖；繪出所看到的細菌的形態(tài)圖，并用箭頭表示其運動方向。（二）思考題1、用簡單染色法能否觀察到細菌的芽胞？2、若涂片中觀察到的只是大量游離芽胞，很少看到芽胞囊及營養(yǎng)細胞，你認為這是什么原因？3、通過莢膜染色法染色后，為什么被包在莢膜里的菌體著色而莢膜不著色？4、用鞭毛染色法準

25、確鑒定一株細菌是否具有鞭毛，要注意哪些環(huán)節(jié)？5、懸滴法中，為什么要涂凡士林？為什么加的菌液不能太多？如果發(fā)現(xiàn)顯微鏡視野內(nèi)大量細菌向一個方向流動，你認為是什么原因造成的？實驗3 微生物細胞形態(tài)及菌落特征觀察一、實驗目的1、學習用放線菌的玻璃紙培養(yǎng)物觀察放線菌的個體形態(tài)；2、學習插片培養(yǎng)法觀察放線菌形態(tài)；3、學習放線菌的印片染色法；4、學習自制水浸片觀察霉菌的形態(tài)；5、學習酵母菌子囊孢子的培養(yǎng)及觀察方法；6、初步掌握四大類微生物的菌落特征，學會從菌落特征識別四大類微生物的方法。二、實驗內(nèi)容1、 用玻璃紙瓊脂平板透析培養(yǎng)法觀察放線菌形態(tài)；2、 用插片培養(yǎng)法觀察放線菌形態(tài)；3、 放線菌的印片染色法；4

26、、 霉菌水浸標本片的制備與觀察；5、 酵母菌子囊孢子的培養(yǎng)與觀察；6、微生物菌落特征觀察微生物菌落特征觀察。三、實驗原理放線菌自然生長的個體形態(tài)觀察，目前多采用玻璃紙瓊脂透析培養(yǎng)法。玻璃紙具有半透膜特性，其透光性與載玻片基本相同，采用玻璃紙瓊脂平板透析培養(yǎng)，能使放線菌生長在玻璃紙上，然后將長菌的玻璃紙剪取小片，貼放在載玻片上，用顯微鏡鏡檢可觀察到自然生長的放線菌個體形態(tài)。另外，采用插片培養(yǎng)法也能觀察放線菌的個體形態(tài)。放線菌的孢子絲形狀和孢子排列情況是放線菌分類的重要依據(jù)，為了不打亂孢子的排列情況，常用印片法進行制片觀察?，F(xiàn)在，放線菌孢子的排列和孢子的表面形狀是用電子顯微鏡來進行觀察的。霉菌的營

27、養(yǎng)體是分枝的絲狀體。其個體比細菌和放細菌大得多，分為基內(nèi)菌絲和氣生菌絲。氣生菌絲中又可分化出繁殖菌絲，不同霉菌的繁殖菌絲可以形成不同的孢子。酵母菌的有性繁殖一般產(chǎn)生子囊孢子。其形成過程為：兩營養(yǎng)細胞各伸出一個小突起而相接觸，使兩個細胞結(jié)合起來，而后接觸處的細胞溶解，經(jīng)質(zhì)配和核配后，形成雙倍體核，原來的細胞形成合子。此雙倍體細胞可以進行芽殖。在適宜條件下，合子減數(shù)分裂，雙倍體核分裂成48個單倍體核，核外再圍以原生質(zhì)逐漸形成子囊孢子，子囊孢子包含在由母細胞壁演變而來的子囊即原來的二倍體細胞中。子囊孢子的形成與否及其數(shù)量和形狀，是鑒定酵母菌的依據(jù)之一。將釀酒酵母（Saccharomyces cere

28、visiae）從營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上移植到含有醋酸鈉和葡萄糖或棉籽糖的產(chǎn)孢培養(yǎng)基上，于適溫下培養(yǎng)，即可誘導其子囊孢子的形成。本實驗即以釀酒酵母為材料觀察酵母菌的子囊孢子。區(qū)分和識別各大類微生物通常包括菌落特征和個體形態(tài)的觀察。由于微生物個體形態(tài)結(jié)構(gòu)、分裂方式、運動能力、生理特征以及產(chǎn)生色素等能力的不同，因而在固體培養(yǎng)基上生長的菌落各有特點。微生物的個體形態(tài)是菌落特征的基礎，而菌落特征又是個體形態(tài)的集中反應。每一大類微生物都有其獨特的細胞形態(tài)，故它們在一定的培養(yǎng)條件下都有各自的菌落特征，即它們的菌落在形態(tài)、大小、色澤、透明度、粘稠度、邊緣情況等都有明顯的差異。一般根據(jù)這些差異就能識別四大類微生物。

29、此法簡便快速，在科研和生產(chǎn)中?？刹捎谩Ｋ?、實驗材料1、活材料：細菌：大腸桿菌（Escherichia coli），金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）；放線菌：灰色鏈霉菌（Streptomyces griseus ），培養(yǎng)57d 的紫色直絲鏈霉菌（Streptomyces uiolaceorectus），吸水鏈霉菌“5102”（Streptomyces hygroscopicus var. Yingchengensis（5102）；酵母菌：釀酒酵母（Saccharomyces cereuisiae），產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)；霉菌：桔青霉（Penic

30、illum citrinum）、黑曲霉（Aspergillus niger）等；2、培養(yǎng)基：高氏一號瓊脂培養(yǎng)基。馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基、克氏培養(yǎng)基或麥氏培養(yǎng)基的試管斜面、3、試劑：石炭酸復紅染色液、乳酸石炭酸棉藍染色液、50%酒精（V/V）、3%的酸性酒精、美藍染色液、50g/L的KOH溶液、碘液、1%碳酸氫鈉溶液、甲基綠。五、實驗用品無菌平皿、玻璃紙、9mL無菌水若干支、酒精燈、火柴、接種環(huán)、玻璃刮鏟、1mL無菌吸管、剪刀、小刀、有凹窩的載玻片、載玻片、蓋玻片、解剖針、鑷子、滴管、玻璃瓶、天平、pH試紙、試管、玻璃缸、培養(yǎng)皿、藥棉、放大鏡、生物顯微鏡等。六、實驗方法（一）用玻璃紙瓊脂平板透析培養(yǎng)法

31、觀察放線菌形態(tài)1、將玻璃紙剪成培養(yǎng)皿大小，用舊報紙隔層迭好后滅菌。2、將放線菌斜面菌種制成103的孢子懸液。3、將高氏一號瓊脂培養(yǎng)基熔化后在火焰旁倒入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿倒15mL左右，待培養(yǎng)基凝固后，在無菌操作下用鑷子將無菌玻璃紙覆蓋在瓊脂平板上即制成玻璃紙瓊脂平板培養(yǎng)基。4、分別用1mL無菌吸管取0.2mL吸水鏈霉菌“5102”孢子懸液、紫色直絲鏈霉菌孢子懸液分別滴加在兩個玻璃紙瓊脂平板培養(yǎng)基上，并用無菌玻璃刮鏟涂抹均勻。5、將接種的玻璃紙瓊脂平板置2830下培養(yǎng)。6、在培養(yǎng)至3d ，5d ，7d 時，從溫室中取出平皿。在無菌環(huán)境下。打開培養(yǎng)皿，用無菌鑷子將玻璃紙與培養(yǎng)基分離，用無菌剪刀取小

32、片置于載玻片上用顯微鏡觀察。可見到放線菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和孢子絲。（二）放線菌的插片培養(yǎng)法放線菌的插片培養(yǎng)是將放線菌菌種制成孢子懸液，濃度以102103為好，取0.2mL放在適合放線菌生長的平板培養(yǎng)基上，用玻璃刮鏟涂布均勻，然后將滅過菌的蓋玻片斜插入固體培養(yǎng)基中，置2832下培養(yǎng)，35d 后取出蓋玻片放在載玻片上鏡檢，可見自然生長的放線菌個體形態(tài)。可見到放線菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和孢子絲。（三）放線菌的印片染色法1、制片：取干凈載玻片一塊，用小刀切取放細菌培養(yǎng)體一塊，應帶培養(yǎng)基切下，放在載玻片上，用另一載玻片對準菌塊的氣生菌絲輕輕按壓，然后將載玻片垂直拿起。注意不要使培養(yǎng)體在玻片上滑動，否

33、則會打亂孢子絲的自然形態(tài)。2、固定：將印有放線菌的涂面朝上，通過酒精燈火焰23次加熱固定。3、染色：用石炭酸復紅染色液染色1min。然后水洗，晾干。可否用吸水紙吸干?4、鏡檢：先用低倍鏡，后用高倍鏡，最后用油鏡觀察，可見孢子絲、孢子的形態(tài)及孢子排列情況。（四）霉菌水浸標本片的制備與觀察在載玻片上滴加一滴乳酸石炭酸棉藍染色液或蒸餾水，用解剖針或鑷子從生長有霉菌的平板中挑取少量帶有孢子的霉菌菌絲，用50%的乙醇浸潤，再用蒸餾水將浸過的菌絲洗一下，然后放入載玻片上的液滴中，仔細地用解剖針將菌絲分散開來。蓋上蓋玻片，勿使產(chǎn)生氣泡，且不要再移動蓋玻片，先用低倍鏡觀察，必要時轉(zhuǎn)換高倍鏡鏡檢，并記錄觀察結(jié)果

34、。（五）酵母菌子囊孢子的培養(yǎng)與觀察1、子囊孢子的培養(yǎng)：將釀酒酵母用馬鈴薯培養(yǎng)基活化23代后，轉(zhuǎn)接于克氏或麥氏斜面培養(yǎng)基上，于25培養(yǎng)35d ，即可形成子囊孢子。2、制片與觀察：于載玻片上加蒸餾水一滴，取子囊孢子培養(yǎng)體少許放入水滴中制成涂片，干燥固定后用石炭酸復紅染色液加熱染色510min,不能沸騰，傾去染液，用酸性酒精沖洗3060s脫色，再用水洗去酒精，最后加美藍染色液染色，510s 后用水洗去染液，用吸水紙吸干后置顯微鏡下鏡檢。子囊孢子為紅色，菌體為青色。亦可不經(jīng)染色直接制水浸片觀察。水浸片中的酵母菌的子囊為圓形大細胞，內(nèi)有24個圓形的小細胞即為子囊孢子。（六）微生物菌落特征觀察1、已知菌落

35、的觀察與識別 細菌和酵母菌菌落的觀察和識別 細菌和酵母菌都是單細胞微生物，菌落由菌體堆積而成，有共同的特征，較濕潤、光滑、透明、易挑起，菌落的正反面、邊緣和中央顏色一致，質(zhì)地較均勻。但兩者也有區(qū)別，細菌的菌落較小、較薄、較透明、較濕潤、顏色多樣，較有“細膩”感。有鞭毛的細菌其菌落較扁平、邊緣不規(guī)則。有芽孢的細菌菌落粗糙、多皺、不透明。酵母的菌落比細菌的大、厚，外觀較稠、較不透明。 放線菌和霉菌菌落的觀察和識別 放線菌和霉菌的細胞都呈絲狀，在固體培養(yǎng)基上都有基內(nèi)菌絲即營養(yǎng)菌絲和氣生菌絲的分化，因此菌落由菌絲相互纏結(jié)而成，外觀干燥、不透明，呈蛛絲狀或絨毛狀，菌落與培養(yǎng)基結(jié)合緊密不易挑起。菌絲、孢子

36、常分泌不同色素，故使菌落的正反面、中央和邊緣表現(xiàn)不同的顏色。兩者也有區(qū)別：放線菌比霉菌菌絲細，生長后期分化的孢子絲有大量的孢子，因而它的菌落比霉菌小而緊密，表面呈干粉狀。霉菌的菌絲比放線菌粗長，菌絲生長快而松散，所以菌落大而疏松。按照“菌落形態(tài)觀察記錄表”的項目，認真觀察并比較四大類微生物的異同。1、認識未知菌落 認真觀察各編號的未知菌落的各項特征，運用區(qū)別各大類微生物的原則，分別歸入相應的大類中，并將鑒別的結(jié)果填入“微生物菌落形態(tài)觀察記錄表”中。微生物菌落形圖3-1 微生物菌落的形態(tài)（自趙斌）態(tài)參見圖3-1。 七、作業(yè)與思考（一）繪圖1、繪出吸水鏈霉菌“5102”和紫色直絲鏈霉菌自然生長的個

37、體形態(tài)圖；2、繪出吸水鏈霉菌“5102”和紫色直絲鏈霉菌的孢子絲和孢子的形態(tài)圖；3、 繪出根霉、青霉、曲霉的個體形態(tài)圖，并注明各部位名稱；4、繪出酵母菌的子囊、子囊孢子形態(tài)圖并注明各部位的名稱；4、 將各菌落的觀察結(jié)果記入下表3-1中，并報告各編號菌落的觀察、識別結(jié)果。（二）思考題1、為什么在培養(yǎng)基上放了玻璃紙后，放線菌仍能生長？2、印片法成敗關鍵在哪里？3、四大類微生物的菌落形態(tài)有何異同？為什么？4、從微生物菌落形態(tài)區(qū)分四大類微生物有何意義？表3-1 微生物菌落形態(tài)觀察記錄表大類菌名或編號大?。╩m）形成方式表面形態(tài)邊緣干濕顏色光澤厚度透明度細菌放線菌酵母菌霉菌未知菌12345實驗4培養(yǎng)基制

38、作、滅菌消毒及無菌操作接種技術一、實驗目的1、學習細菌、放線菌及真菌常規(guī)培養(yǎng)基的制備方法；2、學習微生物操作中常用的滅菌與消毒方法；3、掌握高壓蒸汽滅菌鍋的滅菌原理及使用方法；4、學習并掌握棉塞制作及常用器皿包扎的方法；5、學習并掌握無菌操作技術要點。二、實驗內(nèi)容1、 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的制備；2、 高氏一號合成培養(yǎng)基的制備；3、 馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基的制備；4、 棉塞的制作及玻璃器皿的包扎；5、 常用滅菌和消毒方法簡介；6、 用高壓蒸汽滅菌鍋對培養(yǎng)基和器皿進行滅菌；7、 微生物接種技術介紹。三、實驗原理培養(yǎng)基（culture medium）是指利用人工方法將適合微生物生長繁殖或積累代謝產(chǎn)物的

39、各種營養(yǎng)物質(zhì)混合配制而成的營養(yǎng)基質(zhì)，主要用于微生物的分離、培養(yǎng)、鑒定、菌種保藏或積累代謝產(chǎn)物等方面。其種類很多，依微生物的種類、營養(yǎng)類型以及研究目的的不同而異，實驗教學常用的有以下三種。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是細菌學研究最常用的天然培養(yǎng)基。在配方中不加瓊脂時稱之為肉湯培養(yǎng)基。加入瓊脂配制的固體培養(yǎng)基一般用于細菌的分離、培養(yǎng)和測數(shù)等。高氏一號培養(yǎng)基是一種合成培養(yǎng)基，常用于分離和培養(yǎng)放線菌。馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基是一種半合成培養(yǎng)基，常用于分離和培養(yǎng)多種真菌。四、實驗材料1、藥品和試劑：牛肉膏、蛋白胨、NaC1、10%NaOH溶液、10%鹽酸溶液；可溶性淀粉、K2HPO4、MgSO4·7H2O、KN

40、O3、NaCI、FeSO4·7H2O、瓊脂。2、材料：新鮮馬鈴薯、蔗糖或葡萄糖。五、實驗用品小鋁鍋、天平、牛角匙、1000mL刻度搪瓷杯、玻棒、pH試紙、分裝漏斗、衣棉、橡皮圈、100 mL燒杯、標簽紙、電爐、菜板、小刀、紗布、18mm×180mm試管。六、實驗方法（一）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的制備1、培養(yǎng)基配方牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、NaC1 5.0g、瓊脂20.0g、自來水1000 mL、pH7.0。2、操作步驟 在100 mL小燒杯中稱取牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g，加50 mL自來水，置電爐攪拌加熱至牛肉膏、蛋白胨完全溶解。 向小鋁鍋中加入500 mL自來

41、水，將溶解的牛肉膏、蛋白胨倒入鋁鍋中并用自來水洗23次。加入5.0gNaC1，在電爐上邊加熱邊攪拌。 加入洗凈的瓊脂條，繼續(xù)攪拌，加熱至瓊脂完全熔化，補足水量至1000 mL。 用玻棒沾少許液體，用pH試紙測定pH值。用NaOH或HC1調(diào)至pH7.0。 分裝漏斗分裝于18mm×180mm試管中，塞好棉塞，裝入小鐵絲筐，然后用舊報紙將棉塞部分包好。是否可以擱置幾天后進行滅菌？ 高壓蒸汽滅菌，121滅菌30min。 分裝到試管中的培養(yǎng)基滅菌后趁熱擺放斜面。（二）高氏一號合成培養(yǎng)基的制備1、 培養(yǎng)基配方可溶性淀粉20.0g、硝酸鉀1.0g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2

42、O 0.5g、氯化鈉0.5g、硫酸亞鐵0.01g、瓊脂20g、蒸餾水1000 mL、pH7.27.4。2、操作步驟 用搪瓷杯量取自來水500 mL置小鋁鍋中，在電爐上加熱。 根據(jù)培養(yǎng)基配方，依次稱取各種藥品加入搪瓷杯中，攪拌均勻。其中可溶性淀粉稱入100 mL燒杯中，加入50 mL自來水調(diào)成糊狀，待培養(yǎng)液沸騰時及如鋁鍋中，邊加邊攪拌，以防糊底。 加入20g浸洗過的瓊脂煮沸至熔化，補足1000 mL水量，調(diào)pH7.27.4。 趁熱分裝于18mm×180mm試管，斜面試管每管8 mL，若倒平板則每管裝15 mL，裝量根據(jù)需要而定。 塞好棉塞，裝入小鐵絲筐，并用舊報紙將棉塞部分包好，貼好標

43、簽。 高壓蒸汽滅菌，121滅菌30min。 若有斜面試管，在滅菌后及時擺放斜面。（三）馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基的制備1、培養(yǎng)基成分去皮的馬鈴薯200g 、蔗糖或葡萄糖20g、瓊脂20g、自來水1000 mL、pH 自然2、操作步驟 稱取去皮新鮮馬鈴薯200g 切成1cm 見方小塊放于小鋁鍋中，加1000m L 自來水，置電爐上煮沸20min 后，用雙層紗布過濾。濾液計量體積后倒入小鋁鍋中煮沸。 加入稱好的蔗糖、瓊脂，加熱攪拌至瓊脂完全熔化，并補足水量至1000m L。 趁熱用分裝漏斗分裝于18mm×180mm試管，斜面以8 m L為宜，柱狀15m L為宜。分裝完畢后做好棉塞，裝入小試管筐

44、并捆好，寫好標簽。 高壓蒸汽滅菌，121滅菌30min。若需擺斜面，滅菌后趁熱擺成斜面。（四）棉塞的制作及玻璃器皿的包扎圖4-1 棉塞的做法（自趙斌）(a)棉塞的制作過程；(b)正誤棉塞棉塞的作用有二：一是防止雜菌污染，二是保證通氣良好。因此棉塞質(zhì)量的優(yōu)劣對實驗的結(jié)果有很大的影響。正確的棉塞要求形狀，大小，松緊與試管口或三角瓶口完全適合，過緊則防礙空氣流通，操作不便；過松則達不到濾菌的目的。加塞時，應使棉塞長度的1/3在試管口外，2/3在試管口內(nèi)。如圖4-1(b)所示。做棉塞的棉花要選纖維較長的，一般不用脫脂棉做棉塞。因為它容易吸水變濕，造成污染，而且價格也貴。做棉塞過程如圖4-1（a）所示。

45、此外,現(xiàn)配現(xiàn)用的培養(yǎng)基和無菌水，還可使用硅膠橡膠塞或聚丙烯塑料試管帽。在微生物實驗和科研中，往往要用到通氣塞。所謂通氣塞就是幾層紗布，一般8層，相互重迭而成，或是在兩層紗布間均勻鋪一層棉花而成。這種通氣塞通常加在裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶口上。經(jīng)接種后，放在搖床上進行振蕩培養(yǎng)，以獲得良好的通氣促使菌體的生長或發(fā)酵。（五）常用滅菌和消毒方法采用強烈的理化因素使任何物體內(nèi)外所有的微生物永遠喪失其生長繁殖能力的措施稱之為滅菌（sterilization）。消毒（disinfection）則是用較溫和的物理或化學方法殺死物體上絕大多數(shù)微生物主要是病原微生物和有害微生物的營養(yǎng)細胞，實際上是部分滅菌。滅菌與

46、消毒方法有很多種，可分為物理法和化學法兩大類。實驗室最常用的滅菌方法是物理法，即利用高溫處理達到殺菌效果。高溫的致死作用，主要是是使微生物的蛋白蛋和核酸等重要生物大分子發(fā)生變性。高溫滅菌分為干熱滅菌和濕熱滅菌兩大類。濕熱滅菌的效果比干熱滅菌好。這是因為濕熱下熱量易于傳遞，更容易破壞保持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的氫鍵等結(jié)構(gòu)，從而加速其變性；過濾除菌、射線滅菌也是常見的物理法。此外，化學藥物滅菌和消毒等也是微生物學操作中不可缺少的常用方法。1、干熱滅菌火焰滅菌微生物接種工具如接種環(huán)、接種針或其它金屬用具等，可直接在酒精燈火焰上灼燒進行滅菌。這種方法滅菌迅速徹底。此外，接種過程中，試管或三角瓶口等，也可通過火焰

47、灼燒滅菌。干熱滅菌用干燥熱空氣殺死微生物的方法稱為干熱滅菌。通常將滅菌物品置于鼓風干燥箱內(nèi)，在160oC170oC加熱12h。滅菌時間可根據(jù)滅菌物品性質(zhì)與體積作適當調(diào)整，以達到滅菌目的。玻璃器皿（如吸管、培養(yǎng)皿等）、金屬用具等，凡不適于用其它方法滅菌而又能耐溫的物品都可用此法滅菌。但是，培養(yǎng)基、橡膠制品、塑料制品等不能使用干熱滅菌。干熱滅菌箱的構(gòu)造如圖4-2所示。 干熱滅菌操作步驟圖 4-2 干熱滅菌箱（自趙斌）1. 溫度計與排氣孔;2.溫度調(diào)節(jié)旋扭;3.指示燈;4.溫度調(diào)節(jié)器;5.鼓風扭裝箱：將準備滅菌的玻璃器材洗滌干凈、晾干，用錫箔紙包裹好或放入滅菌專用的鐵盒（或鋁盒）內(nèi)，放入干熱滅菌箱，

48、關好箱門。滅菌：接通電源，打開干熱滅菌箱排氣孔，待溫度升至80oC100oC時關閉排氣孔。繼續(xù)升溫至160oC170oC時，開始計時。恒溫12h。滅菌結(jié)束后，斷開電源，自然降溫至60oC，打開干熱滅菌箱門，取出物品放置備用。 注意事項滅菌的玻璃器皿切不可有水。有水的玻璃器皿在干熱滅菌中容易炸裂。滅菌物品不能堆得太滿、太緊，以免影響溫度均勻上升。滅菌物品不能直接放在電烘箱底板上，以防止包裝紙或棉花被烤焦。滅菌溫度恒定在160170 oC為宜。溫度超過180 oC，棉花、報紙會燒焦甚至燃燒。降溫時，需待溫度自然降至60oC以下才能打開箱門取出物品，以免因溫度過高而驟然降溫導致玻璃器皿炸裂。2、濕熱

49、滅菌濕熱滅菌法比干熱滅菌法更有效。濕熱滅菌是利用熱蒸氣滅菌。在相同溫度下，濕熱的效力比干熱滅菌好的原因是：熱蒸氣對細胞成分的破壞作用更強。水分子的存在有助于破壞維護蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的氫鍵和其它相互作用弱鍵，更易使蛋白質(zhì)變性。蛋白質(zhì)含水量與其凝固溫度成反比（表41）；熱蒸汽熱空氣穿透力強，能更加有效地殺滅微生物；蒸汽存在潛熱，當氣體轉(zhuǎn)變?yōu)橐后w時可放出大量，故可迅速提高滅菌物體溫度。多數(shù)細菌和真菌的營養(yǎng)細胞在60oC左右處理15min后即可殺后，酵母菌和真菌的孢子要耐熱些，要用80oC以上的溫度處理才能殺死，而細菌的芽胞更耐熱，一般要在120oC下處理15min才能殺死。濕熱滅菌常用的方法有常壓蒸汽

50、滅菌和高壓蒸汽滅菌。表41蛋白質(zhì)含水量與其凝固溫度的關系蛋白質(zhì)含水量/% 蛋白質(zhì)凝固點/oC50 5625 748018 80906 145常壓蒸汽滅菌（1）常壓蒸汽滅菌方法 常壓蒸汽滅菌是濕熱滅菌的方法之一，在不能密閉的容器里產(chǎn)生蒸汽進行滅菌。在不具備高壓蒸汽滅菌的情況下，常壓蒸汽滅菌是一種常用的滅菌方法。此外，不宜用高壓蒸煮的物質(zhì)，如糖液、牛奶、明膠等，可采用常壓蒸汽滅菌。這種滅菌方法所用的滅菌器有阿諾氏（Aruokd）滅菌器或特制的蒸鍋，也可用普通的蒸籠。由于常壓蒸汽的溫度不超過100oC，壓力為常壓，大多數(shù)微物的營養(yǎng)細胞能被殺死，但芽胞細菌卻不能在短時間內(nèi)死亡，因此必須采取間歇滅菌或持

51、續(xù)滅菌的方法，以殺死芽胞細菌，達到完全滅菌。巴氏消毒：是用于牛奶、啤酒、果酒和醬油等不能進行高溫滅菌的液體的一種消毒方法，其主要目的是殺死其中的無芽胞病原菌，如牛奶中的結(jié)核分枝桿菌或沙門氏菌，而又不影響其特有風味。巴氏消毒法是一種低溫消毒法，具體的處理溫度和時間各有不同，一般在6085oC下處理1530min。具體的方法可分兩類，第一類是較老式的，稱為低溫維持法，例如在63oC下保持30min可進行牛奶消毒；另一類是較新式的，稱為高溫快速，用于牛奶消毒時只要在85oC下保持5min即可。但是巴氏消毒法不能殺滅引起Q熱的病原體伯氏考克斯氏體（一種立克次氏體）。間歇滅菌法：又稱分段滅菌法。適用于不

52、耐熱培養(yǎng)基的滅菌。方法是：將待滅菌的培養(yǎng)基在100oC下蒸煮3060min，以殺死其中所有微生物的營養(yǎng)細胞，然后置室溫或2030oC下保溫過夜，誘導殘留的芽胞萌發(fā)，第二天再以同法蒸煮和保溫過夜，如此連續(xù)重復3天，即可在較低溫度下達到徹底滅菌的效果。例如，培養(yǎng)硫細菌含硫培養(yǎng)基就應用間歇滅菌法滅菌，因為其中的元素硫經(jīng)常規(guī)的高壓滅菌（121oC）后會發(fā)生熔化，而在100oC的溫度下則呈結(jié)晶狀。蒸汽持續(xù)滅菌法：微生物制品土法生產(chǎn)或食用菌菌種制備時常用這種方法。在容量較大的蒸鍋中進行。從蒸汽大量產(chǎn)生開始，繼續(xù)加大火力保持充足蒸汽，待鍋內(nèi)溫度達到100oC時，持續(xù)加熱36h，殺死絕大部分芽胞和全部營養(yǎng)體，

53、達到滅菌目的。以上三種方法通過是在無高壓蒸汽滅菌條件的地方（如農(nóng)村）使用。（2）滅菌過程中注意事項使用間歇法或持續(xù)法滅菌時必須在滅菌物里外都達到100oC后，開始計算滅菌時間，此時鍋頂上應有大量蒸汽冒出。為利于蒸汽穿透滅菌物，鍋內(nèi)或蒸籠上堆放物品不宜過滿過擠，應留有空隙。固體曲料大量滅菌時，每袋以1.52.0kg為宜，料袋在鍋內(nèi)用蓖子分層隔開，不能堆壓在一起。火大水足才能保證汽足，蒸鍋里應先把水加足。一次持續(xù)滅菌時，如鍋內(nèi)盛水量不能維持到底，應在蒸鍋側(cè)面安裝加水口，以便在蒸煮過程中添水。添水應用開水，以防驟然降溫。間歇法滅菌時應在每次加熱后，迅速降溫，然后在室溫放置24h，再第二次加熱。如果降

54、溫慢，往往使未殺死的雜菌大量滋長，反而導致滅菌物變質(zhì)，特別是固體曲料包裝過大時，靠近中心部分更易發(fā)生這種情況。從使用效果看，分裝試管、三角瓶或其它容器的培養(yǎng)基，因其體積小，透熱快，以用間歇法為佳。固體曲料，因其包裝較大，透熱慢，用間歇法容易滋生雜菌變質(zhì)或者水分蒸發(fā)過多，曲料變得不新鮮，影響培養(yǎng)效果，因此使用一次性持續(xù)滅菌法較好。高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌法是微生物學研究和教學中應用最廣、效果最好的濕熱滅菌方法。 滅菌原理高壓蒸汽滅菌是在密閉的高壓蒸汽滅菌器（鍋）中進行的，其原理是：將待滅菌的物體放置在盛有適量水的高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)。把鍋內(nèi)的水加熱煮沸，并把其中原有的冷空氣徹底驅(qū)盡后將鍋密閉。再繼續(xù)加熱就會使鍋內(nèi)的蒸汽壓逐漸上升，從而溫度也隨之上升到100oC以上。為達到良好的滅菌效果，一般要求溫度應達到121oC（壓力為0.1MPa），時間維持1530min。也可采用在較低的溫度（115oC，即0.075MPa）下維持35min的方法。為什么比濕熱滅菌的工藝指標低？此法適合于一切微生物學實驗室、醫(yī)療保健機構(gòu)或發(fā)酵工