動(dòng)物生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)（Word）

1、動(dòng)物生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)（修訂版）武漢工業(yè)學(xué)院1 / 23生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室規(guī)則1每個(gè)同學(xué)都應(yīng)該自覺遵守課堂紀(jì)律，維護(hù)課堂秩序，不遲到，不早退，不大聲談笑。2實(shí)驗(yàn)前必須認(rèn)真預(yù)習(xí)，熟悉本次實(shí)驗(yàn)的目的、原理、操作步驟，懂得每一操作步驟的意義和了解所用儀器的使用方法，否則不能開始實(shí)驗(yàn)。3實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要聽從教師的指導(dǎo)，嚴(yán)肅認(rèn)真地按操作規(guī)程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并把實(shí)驗(yàn)結(jié)果和數(shù)據(jù)及時(shí)、如實(shí)記錄在實(shí)驗(yàn)記錄本上，文字要簡(jiǎn)練、準(zhǔn)確。完成實(shí)驗(yàn)后經(jīng)教師檢查同意，方可離開實(shí)驗(yàn)室。4實(shí)驗(yàn)臺(tái)面應(yīng)隨時(shí)保持整潔，儀器、藥品擺放整齊。公用試劑用完后，應(yīng)立即蓋嚴(yán)放回原處。勿使試劑、藥品灑在實(shí)驗(yàn)臺(tái)面和地上。實(shí)驗(yàn)完畢，儀器洗凈放好，將實(shí)驗(yàn)臺(tái)面抹拭干凈，

2、才能離開實(shí)驗(yàn)室。5使用儀器、藥品、試劑和各物品必須注意節(jié)約。洗滌和使用儀器時(shí)，應(yīng)小心仔細(xì)，防止損壞儀器。使用貴重精密儀器時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，發(fā)現(xiàn)故障須立即報(bào)告教師，不得擅自動(dòng)手檢修。6實(shí)驗(yàn)室內(nèi)嚴(yán)禁吸煙！加熱用的電爐應(yīng)隨用隨關(guān)，嚴(yán)格做到：人在爐火在，人走爐火關(guān)。乙醇、丙酮、乙醚等易燃品不能直接加熱，并要遠(yuǎn)離火源操作和放置。實(shí)驗(yàn)完畢，應(yīng)立即撥去電爐開關(guān)和關(guān)好水籠頭，拉下電閘。離開實(shí)驗(yàn)室以前應(yīng)認(rèn)真、負(fù)責(zé)地進(jìn)行檢查水電，嚴(yán)防發(fā)生安全事故。7廢液體可倒入水槽內(nèi)，同時(shí)放水沖走。強(qiáng)酸、強(qiáng)堿溶液必須先用水稀釋。廢紙屑及其他固體廢物和帶渣滓的廢物倒入廢品缸內(nèi)；不能倒入水槽或到處亂扔。8要精心使用和愛護(hù)儀器，

3、如使用分光光度計(jì)時(shí)，不能將比色杯直接置于分光光度計(jì)上，并注意拿放比色杯時(shí)，不要打碎。儀器損壞時(shí)，應(yīng)如實(shí)向教師報(bào)告，并填寫損壞儀器登記表，然后補(bǔ)領(lǐng)。9實(shí)驗(yàn)室內(nèi)一切物品，未經(jīng)本室負(fù)責(zé)教師批準(zhǔn)，嚴(yán)禁帶出室外，借物必須辦理登記手續(xù)。實(shí)驗(yàn)一 唾液淀粉酶活性的觀察原理酶是指化學(xué)本質(zhì)為大分子的生物催化劑。在一定條件下，酶促化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行的能力即酶活性。影響酶活性的因素是多方面的，如溫度、pH及某些化學(xué)物質(zhì)等都會(huì)影響酶的催化活性。在一定條件下，能使酶活性達(dá)到最高時(shí)的溫度即酶的最適溫度，而能使酶活性達(dá)到最高時(shí)的PH即酶的最適PH。例如，唾液淀粉酶的最適溫度是37，而其最適PH是6.8。能增高酶活性的物質(zhì)稱為酶的激

4、活劑，能降低酶活性卻又不使酶變性的物質(zhì)叫酶的抑制劑。凡能使蛋白質(zhì)變性的因素都可以使酶因變性而喪失活性。酶活性通常是通過(guò)測(cè)定酶促化學(xué)反應(yīng)的底物或產(chǎn)物量的變化來(lái)進(jìn)行觀察的。本實(shí)驗(yàn)用唾液淀粉酶為材料來(lái)觀察酶活性受理化因素影響的情況，唾液中含有唾液淀粉酶，唾液淀粉酶的底物是淀粉。淀粉在該酶的催化作用下會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而出現(xiàn)不同程度的水解，從而得到各種糊精乃至麥芽糖、少量葡萄糖等水解產(chǎn)物。而碘液能指示淀粉的水解程度淀粉遇碘呈紫色、暗褐色與紅色，而麥芽糖與葡萄糖遇碘則不呈顏色反應(yīng)，如圖所示：淀 粉 淀粉酶 糊 精 淀粉酶 麥芽糖+少量葡萄糖加碘后： （藍(lán)色） （紫紅色、暗褐色或紅色等） （棕黃色、碘本身顏

5、色）試劑及器材：1.試劑（1）0.5%（w/v）淀粉溶液：稱取0.5g可溶性淀粉，加少量預(yù)冷的蒸餾水，在研缽中調(diào)成糊狀，再徐徐倒入約90mL沸水，同時(shí)不斷攪拌，最后加水定容為100mL即成。要求新鮮配制。（2）稀碘溶液：稱取1.2g I2、2g KI，加少量蒸餾水溶解后，再加蒸餾水至200mL。保存于棕色瓶中，用前5倍稀釋。（3）不同pH溶液：A液-0.2mol/L Na2HPO4溶液：稱取35.62g Na2HPO4.12H2O，將之溶于蒸餾水后定容至1000Ml。B液-0.1mol/L檸檬酸溶液：稱取19.212g無(wú)水檸檬酸，將之溶于蒸餾水后定容至1000Ml。 pH5.0緩沖液-取A液1

6、0.3ml、B液9.7mL混合而成。 pH6.8緩沖液-取A液14.55ml、B液5.45mL混合而成。 PH8.0緩沖液-取A液19.45ml、B液0.55mL混合而成。配好緩沖液后應(yīng)用酸度計(jì)驗(yàn)證。（4）0.5%（w/v）蔗糖溶液：稱取蔗糖0.5g，將之溶于蒸餾水后定容至100mL。（5）斑氏試劑：A液-稱取無(wú)水CuSO417.4g，將之溶于100mL預(yù)熱的蒸餾水中，冷卻后用蒸餾水稀釋至150ml。B液-稱取檸檬酸鈉173g、Na2CO3100g，再加蒸餾水600mL，加熱溶解后冷卻，用蒸餾水稀釋至850mL。將A液與B液混合即得斑氏試劑。（6）1%（w/v）NaCl溶液：稱取NaCl 1g

7、，將之溶解后用蒸餾水稀釋至100mL。（7）1%（w/v）CuSO4溶液：稱取無(wú)水CuSO41g，將之溶解后用蒸餾水稀釋至100Ml。2.器材（1）白瓷板（或比色板）（2）恒溫水浴鍋（3）電爐操作1、唾液淀粉酶應(yīng)用液的制備（1） 每人取一個(gè)干凈的飲水杯，裝上蒸餾水。（2） 先用蒸餾水漱口，將口腔的食物殘?jiān)宄蓛?。?） 口含約20mL蒸餾水，做咀嚼動(dòng)作1-2分鐘，以分泌較多的唾液。然后將口腔中的唾液吐入一個(gè)干凈的小燒杯中。（4） 取一塊干凈的白瓷板，按表1-1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。表1-1穴號(hào)試劑（滴）1234567蒸餾水222222棄去唾液2222220.5%淀粉222222碘液（滴）111111結(jié)果

8、（顏色）以呈棕紅色者濃度為準(zhǔn)，稀釋原唾液作應(yīng)用液。2、溫度對(duì)酶活性的影響（1） 取3支試管，按表1-2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。表1-2試管編號(hào)1230.5%淀粉（mL）555PH6.8緩沖液（mL）0.50.50.5稀釋唾液（mL）0.50.50.5不同溫度（）置冰水浴中置37水浴中置沸水浴中將各管中的試劑加好后混勻，然后及時(shí)在上述溫度下分別進(jìn)行處理。（1） 在干凈的比色板上，于各孔穴中分別滴加2滴碘液。（2） 每隔1分鐘從第2支試管取反應(yīng)液1滴，與比色板孔穴中的碘液混合，觀察顏色的變化。（3） 待第2支試管中的反應(yīng)液與比色板孔穴中的碘液混合后顏色不再變化時(shí)，取出試管，并將在沸水浴中處理的試管用冷水冷卻，然

9、后向各試管中滴加碘液1-3滴。搖勻后觀察并記錄各管顏色，比較各管中淀粉水解的程度，說(shuō)明溫度對(duì)酶活性的影響。3、pH對(duì)酶活性的影響（1） 取3支試管，按表1-3編號(hào)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。表1-3管號(hào)0.5%淀粉（mL）123222不同濃度pH緩沖液（mL）PH5.02-PH6.8-2-PH8.0-2稀釋唾液（滴）101010搖勻后，將各管置于37水浴中處理。（2） 每隔1分鐘從pH6.8的試管中取出1滴反應(yīng)液滴于白瓷板上，隨后滴加稀碘液1滴，觀察其顏色變化。（3） 待顏色呈棕色時(shí)，向各管中加稀碘液1-3滴。觀察各管顏色，比較各管中淀粉水解的程度，解釋pH對(duì)酶活性的影響。4、酶反應(yīng)的特異性（1） 取2支試管

10、，按表1-4編號(hào)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。表1-4試管號(hào)120.5%淀粉（mL）2-0.5%蔗糖（mL）-2稀釋唾液（mL）11（2） 搖勻后，將各管置于37水浴中處理10min。（3） 取出試管，分別加入斑氏試劑2mL，混勻。（4） 將各管置于沸水浴煮沸2-5min。觀察并解釋結(jié)果。5、激活劑與抑制劑對(duì)酶活性的影響（1）取3支試管，按下表編號(hào)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。試管號(hào)1230.5%淀粉1.51.51.5PH6.8緩沖液（ml）0.250.250.251%NaCl溶液（ml）0.51%CuSO40.5蒸餾水（ml）0.5稀釋唾液0.50.50.5搖勻后，將各管置于37水浴中處理。（2）每隔1分鐘從第1支試管中取出1

11、滴反應(yīng)液滴于白瓷板上，隨后滴加稀碘液1滴，觀察其顏色變化。（3）待顏色呈棕色時(shí)，取出3支試管，向各管中加稀碘液1-3滴。觀察各管顏色，并解釋之。實(shí)驗(yàn)二 血清總蛋白的含量測(cè)定原理本法所用試劑因能與雙縮脲(H2NOCNH-CONH2)產(chǎn)生紫紅色反應(yīng)而被稱為雙縮脲試劑。實(shí)際上凡分子內(nèi)含有兩個(gè)氨基甲?；?-CONH2)的化合物，不論是直接相連或是通過(guò)一個(gè)氮或碳原于間接連接，均能與雙縮脲試劑發(fā)生反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子內(nèi)含有許多肽鍵(CONH)，因此可用雙縮脲法作比色測(cè)定。不含CONH2，但含有-CSNH2、-C(NH)NH2或CH2NH2等基團(tuán)而具類似結(jié)構(gòu)的化合物對(duì)雙縮脲試驗(yàn)亦呈陽(yáng)性，所以本反應(yīng)并非為蛋白質(zhì)所

12、特有。但在體液中，除蛋白質(zhì)外實(shí)際上不存在可與雙縮脲試劑顯色的物質(zhì)。各種血漿蛋白質(zhì)，包括病理的和正常的，呈色的程度基本相同，因此在血漿蛋白的比色測(cè)定中，雙縮脲反應(yīng)是較為理想的方法。  紫紅色銅雙縮脲復(fù)合物分子結(jié)構(gòu)為： 試劑和器材 一、試劑 雙縮脲試劑：稱取硫酸銅(CuSO4·5H2O，AR或CP)150g、酒石酸鉀鈉(NaKC4H406·4H2O， AR或CP)6.0g，分別用蒸餾水約250ml溶解后，全部轉(zhuǎn)移于1L容量瓶中，混和，再加入10氫氧化鈉溶液300ml，隨加隨搖勻。最后用蒸餾水稀釋至1L。保存于塑料試劑瓶中或內(nèi)壁涂一層純凈石

13、蠟的普通試劑瓶中。如無(wú)紅色或黑色沉淀出現(xiàn)，此試劑可長(zhǎng)期使用。 二、標(biāo)準(zhǔn)和待測(cè)蛋白質(zhì)溶液1. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液10mg/ml牛血清白蛋白溶液或相同濃度的酪蛋白溶液（用0.05mol/L氫氧化鈉溶液配制）。作為標(biāo)準(zhǔn)用的蛋白質(zhì)要預(yù)先用微量克氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，根據(jù)其純度稱量，配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液。2. 待測(cè)蛋白質(zhì)溶液血清（稀釋10倍）。測(cè)試其他蛋白質(zhì)樣品應(yīng)稀釋適當(dāng)倍數(shù)，使其濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)試范圍內(nèi)。 三、器材試管，試管架，恒溫水浴，721型分光光度計(jì)。 操作方法1、取7只試管，按下表加入試劑： 管號(hào)0123456酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)液/ml 0.20.40.60.8

14、1.0-蛋白濃度/(mg/ml) 2.04.06.08.010.0-未知樣品液（ml）-1.0蒸餾水/ml1.00.80.60.40.20.0-雙縮脲試劑/ml4.04.04.04.04.04.04.02、搖勻，室溫（1525）下，放置30min。3、以0管調(diào)零，在540nm波長(zhǎng)處將各管溶液進(jìn)行比色，讀取各管光密度值（重復(fù)三次）。4、取測(cè)定的A540值的平均值，即A540為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。5、6號(hào)管從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出待測(cè)樣品蛋白質(zhì)含量，即為樣品液的蛋白質(zhì)含量（mg/ml）。  注意事項(xiàng)（1）本實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定范圍110mg蛋白質(zhì)。（2）須于顯色

15、后30min內(nèi)比色測(cè)定。30min后，可有霧狀沉淀發(fā)生。各管由顯色到比色的時(shí)間應(yīng)盡可能一致。（3）有大量脂肪性物質(zhì)同時(shí)存在時(shí)，會(huì)產(chǎn)生渾濁的反應(yīng)混合物，這時(shí)可用乙醇或石油醚使溶液澄清后離心，取上清液再測(cè)定。實(shí)驗(yàn)三 氨基酸的紙上層析與氨基酸移換作用原理層析分離技術(shù)是一種物理的分離法。利用待分析混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)（如吸附力、分子形狀和大小、分子極性、分子親和力、分配系數(shù)等）的差別，使各組分以不同程度分布在兩相中。所謂“相”是指一個(gè)系統(tǒng)中的某一均勻部分。一般來(lái)說(shuō)，其中一相是固定的，稱為固定相，另一相是流動(dòng)的液體或氣體，稱為流動(dòng)相，兩相互相接觸。待分析混合物的各組分以不同的速度移動(dòng)，從而分離。

16、紙上層析是以濾紙作為支持物，濾紙總保持一些水分（約2030），使水稱為層析中的“固定相”。另一種和固定相不能混合或部分混合的溶劑則為“移動(dòng)相”。把欲分離的物質(zhì)加在紙的一端，并使流動(dòng)相借重力及濾紙的毛細(xì)現(xiàn)象移動(dòng)，此時(shí)，待分離溶質(zhì)因分配系數(shù)不同而逐漸分布于濾紙的不同部位。層析結(jié)束時(shí)，用顯色劑使被分離的物質(zhì)顯出顏色，成為一個(gè)個(gè)色斑。分配在固定相中趨勢(shì)較大的成分在紙上隨流動(dòng)相移行的速度就小，色斑距原點(diǎn)的位置就較近。反之，分配在固定相內(nèi)趨勢(shì)較小的成分移行就遠(yuǎn)，色斑位置離原點(diǎn)也遠(yuǎn)。溶質(zhì)在紙上的移動(dòng)速率可用比移（Rf）表示之。 各種氨基酸在一定的溶劑、一定的紙質(zhì)及其他有關(guān)條件（濕度、PH等）固定情況下，各有

17、其特有的，不變的Rf值。氨基酸紙上層析常用的溶劑系統(tǒng)是：水和酚，水和乙酸-丁醇，或水和二甲基吡啶等。決定各氨基酸在兩相溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)的是氨基酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)。例如，水是極性溶劑，而酚、丁醇或二甲基吡啶則是極性較低的溶劑。因此，極性基團(tuán)較多的氨基酸（如二羧基氨基酸）或極性基在整個(gè)分子中占比例較大的氨基酸和水的親和力大，移動(dòng)較慢，非極性基（如烴基、芳香基）所占比例較大的則和酚、丁醇等的親和力大，移動(dòng)也較快。同一氨基酸在不同的溶劑系統(tǒng)中Rf值也不同，因此為了徹底分離某一混合氨基酸溶液，常用更換溶劑系統(tǒng)或雙向?qū)游龅姆椒?。氨基酸一般為無(wú)色物質(zhì)，所以通常在層析結(jié)束后，用茚三酮使之顯色。將色斑圖譜及Rf值

18、或標(biāo)準(zhǔn)的層析圖譜及Rf值比較，可確定所分離氨基酸的種類。如欲做定量測(cè)定，可把色斑剪下，溶于適當(dāng)?shù)娜芤褐杏跇?biāo)準(zhǔn)比色，也可直接在紙上用光密度計(jì)讀數(shù)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合轉(zhuǎn)氨基作用來(lái)觀察氨基酸的紙上層析。轉(zhuǎn)氨基作用是氨基酸代謝的一個(gè)重要反應(yīng)。在轉(zhuǎn)氨酶作用下，將氨基酸的氨基轉(zhuǎn)移到-酮酸上。每種轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)均由專一的轉(zhuǎn)氨酶催化。轉(zhuǎn)氨酶廣泛分布于機(jī)體各器官、組織，例如肝細(xì)胞中存在的谷丙轉(zhuǎn)氨酶，能催化-酮戊二酸與丙氨酸之間的轉(zhuǎn)氨基作用。試劑和器材1、試劑 0.01mol/L pH7.4磷酸緩沖液：0.2mol/L Na2HPO4溶液81ml與0.2mol/L NaH2PO4溶液19ml混勻，蒸餾水稀釋20倍。 0.1m

19、ol/L丙氨酸溶液：稱取丙氨酸0.819克先溶于少量0.01mol/L pH7.4磷酸緩沖液中，以1mol/L NaOH仔細(xì)調(diào)節(jié)pH至7.4后，用磷酸緩沖液加至100ml。 0.1mol/L-酮戊二酸溶液：稱取-酮戊二酸1.461克先溶于少量0.01mol/L pH7.4 0.1mol/L谷氨酸溶液：稱取谷氨酸0.735克先溶于少量0.01mol/L pH7.4磷酸緩沖液中，以1mol/L NaOH仔細(xì)調(diào)節(jié)pH至7.4后，用磷酸緩沖液加至50ml。 層析溶劑：正丁醇:水:冰乙酸=4:3:1 0.1%的茚三酮的無(wú)水丙酮溶液。2、器材 瓷研缽 小試管二支 刻度吸管 層析濾紙 毛細(xì)吸管 培養(yǎng)皿，小表

20、面皿 電吹風(fēng) 剪刀、鑷子 圓規(guī)、直尺、鉛筆（學(xué)生自備）操作1、肝勻漿的制備：稱取新鮮的兔子肝臟1克，在研缽中用剪刀盡量剪碎，加入1ml預(yù)冷的0.01mol/L pH7.4磷酸緩沖液，將肝組織研磨制成勻漿，再加入8ml 上述磷酸緩沖液，混勻。2、保溫：取干燥試管兩支，分別標(biāo)明測(cè)定管與對(duì)照管，按下表操作：試劑測(cè)定管對(duì)照管肝勻漿（ml） 0.1mol/L丙氨酸（ml）0.1mol/L-酮戊二酸（ml）0.01mol/L pH7.4磷酸緩沖液（ml）237預(yù)熱2分鐘0.50.51.52沸水浴5分鐘0.50.51.5 兩管混勻后，置37水浴保溫3040分鐘。保溫完畢，立即將測(cè)定管在火

21、焰上加熱煮沸2分鐘終止反應(yīng)。冷卻后，分別取兩管的上層清液于白瓷比色盤小池中。3、層析：取直徑12cm的圓形層析濾紙一張，用圓規(guī)作半徑1cm的同心圓，通過(guò)圓心作兩條垂線，用鉛筆在交點(diǎn)處輕輕作一點(diǎn)樣記號(hào)（見圖）。在1，3兩點(diǎn)處分別點(diǎn)測(cè)定管和對(duì)照管上清液各56滴，在2，4兩點(diǎn)處分別點(diǎn)0.1mol/L丙氨酸和0.1mol/L谷氨酸各1滴。注意點(diǎn)樣斑點(diǎn)不可太大（一般直徑為0.20.5cm）。吸取層析劑，加入直徑35的表面皿中，再將表面皿置于一直徑為10cm的培養(yǎng)皿正中。 在點(diǎn)樣后的層析濾紙圓心處打一小孔，直徑約為0.3cm。另取同樣濾紙一小片（約1×2 cm2），下一半用剪刀剪成須狀

22、，卷成圓筒如燈芯，插入小孔中固定（勿突出濾紙平面）。將濾紙平放在培養(yǎng)皿中，燈芯浸入層析溶劑中，反蓋上另一培養(yǎng)皿。這時(shí)可見層析溶劑沿?zé)粜旧仙綖V紙上，再向四周擴(kuò)散。層析約30分鐘后，將濾紙取出，用鉛筆在溶劑前緣處輕輕作一記號(hào)，用電吹風(fēng)將濾紙吹干。4、顯色：將上述濾紙用噴霧器噴上0.1%的茚三酮溶液，再用電吹風(fēng)吹干，此時(shí)可見紫紅色同心圓弧色斑出現(xiàn)。計(jì)算各色斑的Rf值，將測(cè)定液和對(duì)照液中各色斑的Rf值與標(biāo)準(zhǔn)品的Rf值進(jìn)行比較分析。 實(shí)驗(yàn)四 血糖的測(cè)定 原理葡萄糖在熱醋酸溶液中與鄰甲苯胺縮合生成蘭綠色西夫氏堿（Schiff base），其顏色的深淺與葡萄糖含量成正比。與同樣處理的葡

23、萄糖標(biāo)準(zhǔn)液比色（或根據(jù)其光密度查標(biāo)準(zhǔn)曲線）可求得待檢血樣品中葡萄糖的含量。 試劑和器材1、試劑 鄰甲苯胺試劑：稱取硫脲（A·R）2.5g，溶于冰醋酸（A·R）750ml中。將此溶液轉(zhuǎn)移入1L容量瓶?jī)?nèi)，加鄰甲苯胺150ml，2.4%硼酸溶液100ml，再加冰醋酸至1L刻度，置棕色瓶中，至少可應(yīng)用兩個(gè)月。 葡萄糖貯存標(biāo)準(zhǔn)液（50mmol/L）：將少量無(wú)水葡萄糖（A·R或C·P）置于硫酸干燥器內(nèi)一夜。精確稱取此葡萄糖0.900g，以飽和苯甲酸溶液溶解并轉(zhuǎn)移入100ml容量瓶?jī)?nèi)，再以飽和苯甲酸溶液稀釋至100ml刻度。置冰箱中可長(zhǎng)期保存。 葡萄糖應(yīng)用標(biāo)

24、準(zhǔn)液(1.25mmol/L)：準(zhǔn)確吸取葡萄糖貯存標(biāo)準(zhǔn)液2.5ml，置100ml容量瓶?jī)?nèi)，以飽和苯甲酸溶液稀釋100ml刻度。 飽和苯甲酸溶液：稱取苯甲酸2.5g，加入蒸餾水1L中，煮沸使溶解。冷后盛于試劑瓶中。 2、器材 試管及試管架 吸量管 水浴鍋 721型分光光度計(jì) 方格坐標(biāo)紙標(biāo)準(zhǔn)曲線和回收試驗(yàn)1、標(biāo)準(zhǔn)曲線：配制一系列已知不同濃度的測(cè)定物標(biāo)準(zhǔn)溶液，按樣品測(cè)定同樣的方法處理顯色，分別測(cè)得它們的光密度，再以光密度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，在方格坐標(biāo)紙上作圖，所得的曲線即標(biāo)準(zhǔn)曲線。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的意義在于：（1）作為校正曲線，從濃度光密度的直線特性，可判斷某方法中化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的顏色物質(zhì)是否符合或遵守

25、朗伯特比爾定律。（2）可判斷在測(cè)定操作過(guò)程中，操作、儀器等誤差的大小，從而確定方法的可靠性。（3）作為工作曲線，在大量進(jìn)行樣品中測(cè)定物含量分析時(shí)，通常用作計(jì)算的基礎(chǔ)，即從曲線上可直接找到測(cè)定液的光密度所相當(dāng)?shù)臐舛取?、回收試驗(yàn)：比色法中測(cè)定液除含待測(cè)成分外，還含有許多非測(cè)定成分而與標(biāo)準(zhǔn)液不一致，它們是否影響顯色反應(yīng)引起誤差，常借回收試驗(yàn)來(lái)檢查。在待測(cè)樣品中加入已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，在按樣品測(cè)定的條件和方法進(jìn)行測(cè)定，然后計(jì)算測(cè)出標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量占加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量的百分率，這種試驗(yàn)即回收試驗(yàn)，算出的百分率即回收率。回收率愈接近100%愈好，一般認(rèn)為達(dá)到100±5%即較為理想?；厥章实暮脡脑谝欢ǔ潭?/p>

26、上說(shuō)明測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度，也可反映干擾物質(zhì)存在與否，影響程度如何，以及這種影響與濃度有無(wú)關(guān)系；此外，還可以檢查操作誤差和儀器誤差。 操作取潔凈干燥試管8支，編號(hào)，按下表操作：試 劑（ml）空白管（1）標(biāo)準(zhǔn)管（2） （3） （4） （5） （6）測(cè)定管 （7） 回收管（8）血漿（或血清） 0.050.05葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液(1.25mmol/L)0.1 0.2 0.3 0.4 0.50.2蒸餾水0.60.5 0.4 0.3 0.2 0.10.550.35鄰甲苯胺試劑5.05.0 5.0 5.0 5.0 5.05.05.0混勻后置沸水浴中加熱15分鐘。取出，用流水或冷水浴冷卻。用630nm波長(zhǎng)進(jìn)

27、行比色，以空白管校正光密度到零點(diǎn)，讀取各管光密度讀數(shù)。計(jì)算及作圖1、選擇與測(cè)定管接近的標(biāo)準(zhǔn)管的光密度值，列出計(jì)算公式，計(jì)算出血漿（或血清）中葡萄糖的含量（mmol/L）。2、將以上各標(biāo)準(zhǔn)管的光密度值為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的各標(biāo)準(zhǔn)管的葡萄糖的濃度（依次相當(dāng)于2.5mmol/L， 5.0mmol/L， 7.5mmol/L， 10.0 mmol/L， 12.5mmol/L）為橫坐標(biāo)，在座標(biāo)紙上作圖，繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。3、從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出血漿或血清的葡萄糖含量，并與計(jì)算結(jié)果作比較。4、回收率的計(jì)算： 選擇與回收管接近的標(biāo)準(zhǔn)管的光密度值，列出計(jì)算公式，計(jì)算出回收管的葡萄糖含量（mmol/L）。 計(jì)算回收量：回收量

28、（mmol/L）=回收管葡萄糖含量（mmol/L）測(cè)定管葡萄糖含量（mmol/L） 計(jì)算回收率：注：加入量在本次實(shí)驗(yàn)中為5.0mmol/L。正常值3.89mmol/L 5.89mmol/L 臨床意義血糖超過(guò)正常最高值，稱為高血糖癥，常由糖尿病、甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)、腦垂體前葉機(jī)能亢進(jìn)、腎上腺皮質(zhì)和髓質(zhì)機(jī)能亢進(jìn)等疾病引起。血糖低于正常最低值，稱為低血糖癥，多見于胰島素分泌過(guò)多、腎上腺機(jī)能減退、腦垂體機(jī)能減退、甲狀腺機(jī)能減退等。實(shí)驗(yàn)五 組織DNA與RNA的分離和提純一、原理脫氧核糖核蛋白(DNP)在0.14 mol/L NaCl中溶解度很低，而核糖核蛋白(RNP)卻較易溶解，故用0.14 mo

29、l/L NaCl洗滌組織勻漿，可得到DNP，再用氯仿-異戊醇除蛋白即可得到DNA。RNA的分離提純目前多用苯酚法。組織勻漿在酚與十二烷基硫酸鈉存在下，RNA與蛋白質(zhì)分離。酚使蛋白質(zhì)變性凝固，RNA溶解在水相中，用乙醇使RNA從水相中沉淀而達(dá)到分離。二、操作(一)DNA的提純1.取小鼠剪斷頸動(dòng)脈，放血處死。立即開腹，取其脾臟及兩腎臟(約0.3 g)，浸于預(yù)冷至0的0.14 mol/L NaCl-0.01 mol/L EDTA中，洗去其血液，剝?nèi)ブ車闹炯敖Y(jié)締組織，用濾紙吸干水分。2.將組織剪碎，轉(zhuǎn)入玻璃勻漿器中，加入0.14 mol/L NaCl-0.01 mol/L EDTA液7 ml，旋轉(zhuǎn)

30、上下勻漿，至絕大部分細(xì)胞破碎為止。3.離心，2 500 r/min，15 min。吸棄上層液體，向沉淀中再加0.14 mol/L NaCl-0.01 mol/LEDTA液混勻，離心洗滌之(如欲獲取摻雜RNA較少的純DNA時(shí)，此步離心洗滌應(yīng)重復(fù)多次)。4.經(jīng)洗滌后的沉淀，加入3 ml 0.14 mol/L NaCl-0.01 mol/L EDTA，在攪拌下緩緩滴入250g/L SDS 0.4 ml，轉(zhuǎn)入勻漿器內(nèi)勻漿，使沉淀懸浮均勻，再加入2 mol/L NaCl 4 ml，這時(shí)由于大分子脫氧核糖核蛋白的溶出，溶液粘度驟然升高，再勻漿一次，使之均勻。5.轉(zhuǎn)入三角燒瓶，加等容積的氯仿-異戊醇8 ml

31、，劇烈振搖10 min。將此混合液離心3 000r/min，10 min。上層為水液，下層為氯仿，變性蛋白質(zhì)在氯仿與水層的界面上。吸出上層水液(如欲獲取摻雜蛋白質(zhì)較少的DNA，此氯仿振搖、離心的操作可重復(fù)多次，直至界面完全見不到變性蛋白層為止)。氯仿層液體不要廢棄，可倒入收集瓶?jī)?nèi)，以便蒸餾回收再用。6.上層水液邊搖邊加入等積95%乙醇，即可見有長(zhǎng)纖維線狀DNA析出，用玻棒攪之，DNA纖維即粘纏在玻璃棒上，在玻璃壁上盡量將水分?jǐn)D干。7.纏在玻璃棒上的DNA纖維溶于1 ml 0.1 mol/LNaCl溶液中留作定量、電泳用。(二)RNA的提取1.饑餓一日的小白鼠，放血處死。立即剖腹，取出其肝臟，浸

32、于預(yù)冷至0的0.05 mol/L醋酸鈉緩沖液(pH5.0)中，剝?nèi)ジ伍T處的結(jié)締組織，洗去血液，用濾紙將水分吸干，稱取0.3g。2.取0.3 g肝臟，加入0.05mol/L醋酸緩沖液(pH5.0)3 ml、250 g/L SDS 0.5 ml，移入勻漿管，勻漿后，再加入等體積80%酚，再勻漿一次。3.移入三角燒瓶?jī)?nèi)，置65水浴中繼續(xù)振搖58 min。取出流水冷卻。4.離心，3 000 r/min，1015 min，上層為稍混濁含有RNA的水相，中層為變性蛋白質(zhì)，下層為酚液，管底殘?jiān)蠨NA。吸出上層水液(若要提高RNA的收獲量，可向中、下層液中再加1/2體積的醋酸緩沖液，同樣在65水浴中振搖提

33、取一次，離心后所收得上層水液，可與上述水液合并)。5.用量筒測(cè)水液的量，加入1/10體積的2 mol/L醋酸鈉，混勻。再加入2.5倍體積預(yù)冷的95%乙醇，混勻，冷處放置至絮狀沉淀充分形成。6.離心，3 000 r/min，10 min。傾出上清(不要廢棄，可倒入收集瓶中，作蒸餾回收乙醇用)。離心管倒置濾紙片上，盡量使液體流干。7.沉淀用蒸餾水1ml溶解(慢慢向沉淀中加蒸餾水，至沉淀完全溶解即可)，再作定量及電泳用。三、注意事項(xiàng)1.在DNA和RNA的提取操作中，有條件應(yīng)在04進(jìn)行。2.手指上有RNA酶，在提取RNA的過(guò)程中應(yīng)盡量避免RNA酶污染。3.酚有腐蝕性，操作時(shí)應(yīng)小心，若沾灑在皮膚上立即用

34、水或用70%酒精棉球擦洗。4.提取DNA時(shí)，須待纖維狀DNA大分子充分析出后，再用玻棒輕輕將其纏撈出來(lái)四、試劑和器材1. 0.14 mol/L NaCl-0.01 mol/L EDTA: 稱NaCl 8.18 g，乙二胺四醋酸二鈉鹽3.72 g，加蒸餾水溶解，調(diào)pH至7，稀釋至1 000 ml，貯放冰箱中。2. 250 g/L SDS: 稱取十二烷基硫酸鈉25 g，溶于50%乙醇中至100 ml，室溫存放。3. 2 mol/L NaCl: 稱11.7 g NaCl，用蒸餾水配成100 ml溶液。4. 氯仿-異戊醇: 氯仿24份與異戊醇1份混合。5. 80%酚: 取苯酚80份，加蒸餾水20份，混

35、勻后裝棕色瓶中。6. 0.05 mol/L醋酸緩沖液(pH5.0):0.5 mol/L醋酸鈉35 ml，0.2 mol/L醋酸15 ml，加蒸餾水稀釋至1 000 ml，混勻后測(cè)pH應(yīng)為5.0。7. 2 mol/L醋酸鈉: 取無(wú)水醋酸鈉16.4 g，用蒸餾水溶解后配成100 ml。8. 95%乙醇9. 器材 超低溫冰箱，生物安全柜，電熱恒溫水槽，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)實(shí)驗(yàn)六 紫外分光光度法定量檢測(cè)DNA與RNA 一、原理具有共軛雙鍵的有機(jī)分子，對(duì)紫外光有強(qiáng)烈的吸收，核酸分子中的堿基就有共軛雙鍵，因此也強(qiáng)烈吸收紫外光。核酸的最大吸收波長(zhǎng)為260 nm，吸收低谷在230 nm。核酸的這一物理特性為測(cè)定

36、核酸溶液的濃度提供了基礎(chǔ)。在波長(zhǎng)為260 nm的光程為，一個(gè)吸收單位(1A 260)相當(dāng)于雙鏈DNA濃度為50g/ml，單鏈DNA為33g/ml，單鏈RNA為40g/ml，寡核苷酸為2030g/ml。所以測(cè)出核酸溶液的A260值后，即可據(jù)此計(jì)算出它的濃度。二、試劑和器材超純水紫外可見光分光光度計(jì)三、操作待測(cè)核酸以水為溶劑并作適當(dāng)稀釋，使用1 cm光程的石英比色杯，以水調(diào)好儀器的零點(diǎn)，然后測(cè)定并記錄樣品液的A 260值。根據(jù)上述核酸的吸收系數(shù)，計(jì)算出樣品液中核酸的濃度。計(jì)算(RNA定量舉例)RNA樣品體積:100l稀釋:10lRNA樣品+490l蒸餾水(50倍稀釋)稀釋后樣品的A 260值(1

37、cm光程)=0.55 RNA濃度=40g/ml×A 260×稀釋倍數(shù)=40g/ml×0.55×50=1100g/ml RNA總量=濃度×樣品體積(ml)=1=100g/ml×0.1 ml=110g RNA。四、注意事項(xiàng)1.待測(cè)核酸樣品，必須是純凈(即無(wú)顯著的蛋白質(zhì)、酚、瓊脂糖或其他核酸、核苷酸等污染物)的制品。若樣品中有污染物，則無(wú)法用紫外分光光度法測(cè)準(zhǔn)其濃度。要使用與樣品相同的溶劑調(diào)儀器的零點(diǎn)，樣品讀數(shù)應(yīng)在0.11.0之間，以保證讀數(shù)的可靠性。2.前述吸收系數(shù)是以水為溶劑的。以緩沖液為溶劑的吸收系數(shù)可能與以水為溶劑時(shí)略有不同。3.測(cè)

38、定RNA濃度時(shí)，要確保比色杯無(wú)RNase污染。為此可用0.1mol/LNaOH-1mmol/LEDTA液清洗比色杯，然后以無(wú)RNase的蒸餾水淋洗。4.為判斷核酸的純度，可在低鹽緩沖液中，測(cè)定A260/A280的比值。在緩沖溶液中，可獲得比在水中更為正確、可靠的測(cè)定值，這是因?yàn)锳260/A280比值受pH的影響很大，pH較低時(shí)引起A260/A280值的降低，并且降低了對(duì)蛋白污染的靈敏度。純DNA在pH8.5的10mmol/LTris·Cl中，其A260/A280比值為1.82.0。純RNA在pH7.510mmol/LTris·Cl中，其A260/A280比值為1.92.1。

39、5.如在280nm有強(qiáng)吸收則A260/A280比值降低，表明有污染物(如蛋白質(zhì))的存在;270275nm的強(qiáng)吸收，提示有污染的酚存在。實(shí)驗(yàn)七 DNA的瓊脂糖凝膠電泳原理瓊脂糖凝膠電泳以瓊脂（糖)為電泳支持物。天然瓊脂（agar）是一種多聚糖。主要由瓊臘糖（agarose，約占80）及瓊脂膠（agaropectin）組成。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷。而瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強(qiáng)酸性多糖，由于這些基團(tuán)帶有電荷，在電場(chǎng)作用下能產(chǎn)生較強(qiáng)的電滲現(xiàn)象，加之硫酸根可與某些蛋白質(zhì)作用而影響電泳速度及分離效果。DNA的瓊脂糖凝膠電泳多采用平板型水平電泳裝置。其特點(diǎn)是制膠、電泳、染色等

40、操作簡(jiǎn)單方便、省時(shí)、樣品用量少、分離效果好，電泳時(shí)，常用溴酚藍(lán)（在1%膠中遷移率與 500 bp的DNA相當(dāng)）和（或）二甲苯青臨（在1膠中遷移率相當(dāng)于200bp的DNA）為指示劑。通常用EB染色，可以在凝膠中加人終濃度為0.5g/mL的EB，或電泳結(jié)束后將凝膠浸入0.5g/mL EB的水溶液中染色10min，電泳結(jié)果可在紫外燈照射下觀察和拍照。試劑和器材1.試劑（1）5×TBE：54g Tris、27.5g硼酸、4.65gEDTANa2·H2O溶于水，定容至 100 mL，pH8.3，用時(shí)稀釋10倍。（2）溴酚藍(lán)指示劑：50g溴酚藍(lán)溶于100 mL 50甘油中。（3）EB:

41、 EB 10mg加水2mL成5mg/mL水溶液，EB為強(qiáng)致癌物，配制時(shí)要戴一次性手套。（4）標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)分子質(zhì)量DNA；（5）樣品DNA：25mg DNA溶于100mL 0.5×TBE。2.器材 水平電泳槽，多功能電泳儀，微量加樣器，層析冷柜，凝膠成像系統(tǒng)含工作站操作（l）洗凈有機(jī)玻璃制膠內(nèi)槽，兩端用膠帶封嚴(yán)，置水平位置備用。（2）根據(jù)制膠槽大小，稱取一定量的瓊脂糖。置三角瓶中，按1的濃度加入0.5×TBE。三角瓶口上倒扣1個(gè)小燒杯，置微波爐加熱使瓊脂糖溶解，冷卻至約60時(shí)，加入EB液，使EB終濃度為0.5g/mL（戴手套?。?，將之倒入制膠模糟，厚度一般為35mm，放好梳子，排

42、除梳齒間或梳齒下的氣泡（一般輕輕抖動(dòng)梳子即可）。（3）室溫下置3040min使瓊脂糖完全凝固，小心取出梳子，撤除膠槽兩端膠帶，將膠槽置于電泳槽中，加入0.5×TBE，使液面高于膠面1mm。注意，電泳槽中緩沖液和配制凝膠的緩沖液應(yīng)完全一致，最好為同一次配制的溶液。（4）樣品液和標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)分子質(zhì)量DMA各40g，加入10L溴酚藍(lán)指示劑，混勻后，用微量加樣器（移液槍或注射器）將樣品加入樣品孔中，槍頭不可碰孔壁。0.5cm×0.5cm×0.15 cm的標(biāo)準(zhǔn)孔最大上樣容積為37.5L，單一分子DNA每孔可加DNA100500ng，DNA的混合物每孔可加2030ug，測(cè)相對(duì)分子

43、質(zhì)量時(shí)，兩側(cè)均應(yīng)加標(biāo)準(zhǔn)DNA，鹽分過(guò)高的樣品需脫鹽。（5）接通電泳槽和電泳儀，注意DNA向正極移動(dòng)，加樣端要接負(fù)極。電壓選擇為 15 Vcm，溴酚藍(lán)移動(dòng)到距膠板正極端約1cm時(shí)停止電泳。（6）在254nm紫外光燈下觀察電泳結(jié)果，并可將凝膠置于紫外透射儀的玻板上，打開紫外燈，用配有近攝接圈和紅色濾光片的照相機(jī)，采用全色膠卷，5060cm距離，5.6光圈，根據(jù)條帶深淺，曝光 1020 s。有條件時(shí)，可用凝膠自動(dòng)成像儀處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果。注意：EB為強(qiáng)致癌劑，使用時(shí)一定要戴手套。加在凝膠中的EB電泳時(shí)向負(fù)極移動(dòng)，使DNA遷移率下降約15，對(duì)帶型有一定的影響。故可在凝膠中不加EB。電泳結(jié)束后，將凝膠置于0.

44、5ug/mL的EB中染色30min。EB廢液要經(jīng)過(guò)處理才能丟棄，較容易的方法是：用水將EB濃度稀釋至0.5gmL以下，加入1倍體積0.5mol/L KMnO4混勻，再加1體積2.5mol/L HCl混勻，室溫放置數(shù)小時(shí)，再加入1倍容積的2.5mol/L NaOH混勻即可廢棄。實(shí)驗(yàn)八 血漿IgG的分離制備一、血液樣品的處理血液是生化分析中十分重要的樣品之一。血液中各成分的生化分析結(jié)果是了解機(jī)體代謝變化的重要指標(biāo)。為此，必需掌握正確處理血液樣品的方法。（一）血液的采取 動(dòng)物采血法 采集血液是進(jìn)行常規(guī)檢查或某些生物化學(xué)分析的需要，采血方法的選擇，主要決定于實(shí)驗(yàn)的目的、所需血量及動(dòng)物種類。凡用血量較少

45、的檢驗(yàn)可刺破組織取毛細(xì)血管的血。當(dāng)需血量較多時(shí)可作靜脈采血。靜脈采血時(shí)，若需反復(fù)多次，應(yīng)自遠(yuǎn)心端開始，以免發(fā)生栓塞而影響整條靜脈。常見動(dòng)物的全身總血量和一次允許采血量見表3。 表3 動(dòng)物血容量和允許采血量單位：mL/kg 動(dòng)物小鼠大鼠家兔雞貓狗猴豬山羊綿羊乳牛馬V74.558.069.495.584.692.675.069.471.058.057.472.0v7.75.57.79.97.79.96.66.66.66.67.78.8注：V全血量平均值，v一次最大安全采血量 兔的采血 方法有多種，需血量較少時(shí)可從耳緣靜脈采血，需血量在幾毫升可從耳中央動(dòng)脈采血，更多時(shí)用頸靜脈采血

46、或心臟采血。耳緣靜脈采血方法是：將兔固定，拔（或剪）去耳緣靜脈局部的被毛，消毒，用手指輕彈兔耳，使靜脈擴(kuò)張，用針頭刺入耳緣靜脈末端，血液即流出。耳緣靜脈采血為兔最常用的采血方法，可多次重復(fù)使用。手術(shù)法分離頸靜脈，可用注射器直接采血，或安置導(dǎo)管，反復(fù)采血。耳中央動(dòng)脈采血：在兔耳中央有一條較粗的、顏色較鮮紅的中央動(dòng)脈。用左手固定兔耳，右手持注射器，在中央動(dòng)脈的末端，沿著與動(dòng)脈平行的向心方向刺入動(dòng)脈，即可見血液進(jìn)入針管。由于兔耳中央動(dòng)脈容易痙攣，故抽血前必須讓兔耳充分充血，采血時(shí)動(dòng)作要迅速。采血所用針頭不要太細(xì)，一般用6號(hào)針頭，針刺部位從中央動(dòng)脈末端開始，不要在近耳根部采血。心臟采血：將兔仰臥保定，

47、穿刺部位在第三肋間胸骨左緣3cm處，選心跳最明顯的部位把注射針刺入心臟，血液即流入針管。穿刺部位也可以選在左側(cè)面水平方向進(jìn)針，左手在胸骨兩側(cè)向下按壓，使心臟位置受限，右手持注射器在兔胸腔前后壁中點(diǎn)的第三肋間刺入。心臟采血時(shí)所用的針頭應(yīng)細(xì)長(zhǎng)些，以免發(fā)生采血后穿刺孔出血。也可從胸骨劍突尾端和腹部平面成30°角向頭端刺入。由于血液中許多化學(xué)成分在血漿（清）和血細(xì)胞內(nèi)的分布不同，有的差別很大，因而在血液分析中常需分別測(cè)定血漿（清）和血細(xì)胞中的成分含量。為此，在采血時(shí)要避免溶血，因?yàn)槿苎斐沙煞只祀s，引起測(cè)定誤差。為避免溶血，在采血時(shí)所用的注射器、針頭及盛容器要干燥清潔；采出的血液要沿管壁慢慢

48、注入盛容器內(nèi)。若用注射器取血時(shí)，采血后應(yīng)先取下針頭，再慢慢注入容器內(nèi)。推動(dòng)注射器時(shí)速度切不可太快，以免起氣泡造成溶血。盛血的容器不能用力搖動(dòng)。（二）血清的制備1.血清的制備：血清是全血不加抗凝劑自然凝固后析出淡黃清亮液體。其所含成分接近于組織間液，代表著機(jī)體內(nèi)環(huán)境的物理化學(xué)性狀，比全血更能反映機(jī)體的狀態(tài)，所以血清是常用的血液樣品。操作 將剛采集的血液直接注入試管，將試管傾斜放置，使血液形成一斜面。夏季于室溫下放置，待血液凝固后，即有血清析出；冬季，因室溫較低，室溫下放置時(shí)血液凝固緩慢，不易析出血清，故需將血液置于37水浴或溫箱中促進(jìn)血清析出。血清析出后，用吸管吸取上層血清置于另一試管，若不清亮

49、或帶有血細(xì)胞，應(yīng)離心，將上清移于另一試管中，加蓋冷藏備用。二、免疫球蛋白的提取原理 IgG是免疫球蛋白的主要成分之一，分子量約為15萬(wàn)16萬(wàn)，沉降系數(shù)約為7s。IgG是動(dòng)物和人體血漿的重要成分之一。血漿蛋白質(zhì)的成分多達(dá)70余種，要從血漿中分離出IgG，首先要進(jìn)行盡可能除去其他蛋白質(zhì)成分的粗分離程序，使IgG在樣品中比例大為增高，然后再純化而獲得IgG。鹽析法是粗分離蛋白質(zhì)的重要方法之一。許多蛋白質(zhì)在純水或低鹽溶液中溶解度較低，若稍加一些無(wú)機(jī)鹽則溶解度增加，這種現(xiàn)象稱為“鹽溶”。而當(dāng)鹽濃度繼續(xù)增加到某一濃度時(shí)，蛋白質(zhì)又變得不溶而自動(dòng)析出，這種現(xiàn)象稱為“鹽析”。由于各種蛋白質(zhì)分子所帶的電荷數(shù)目不同

50、，它們?cè)诘鞍踪|(zhì)表面上分布情況也不一樣，因此將不同蛋白質(zhì)“鹽析”出來(lái)所需的鹽濃度也各異，鹽析所需的最小鹽量稱為鹽析濃度。鹽析法就是通過(guò)控制鹽的濃度，使蛋白質(zhì)混合溶液中的各個(gè)成分分步“鹽析”出來(lái)，達(dá)到分離目的蛋白質(zhì)。鹽析法所使用的鹽有硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉和硫酸銨等中性鹽，其中運(yùn)用最廣的是硫酸銨。因?yàn)榱蛩徜@有許多其他鹽所不具備的優(yōu)點(diǎn)，如在水中化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定；溶解度大，25時(shí)能達(dá)到4.1mol/L的濃度；溶解度的溫度系數(shù)變化小，在030范圍內(nèi)溶解度變化不大，如，25時(shí)飽和溶解度為4.12mol/L，即767g/L，0時(shí)飽和溶解度為3.9 mol/L，即676 g/L。而且硫酸銨廉價(jià)易得，分段效

51、果比其他鹽好，性質(zhì)溫和，即使?jié)舛群芨邥r(shí)也不會(huì)影響蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性。因此，現(xiàn)在所指的鹽析法實(shí)際上多為硫酸銨鹽析法。用硫酸銨分級(jí)鹽析蛋白質(zhì)時(shí)，鹽析出某種蛋白質(zhì)成分所需的硫酸銨濃度一般以飽和度來(lái)表示。實(shí)際工作中將飽和硫酸銨溶液的飽和度定為100或1。鹽析某種蛋白質(zhì)成分所需的硫酸銨數(shù)量折算成100或1飽和度的百分之幾，即稱為該蛋白鹽析的飽和度。飽和度可以根據(jù)情況用下述兩種方法計(jì)算。飽和硫酸銨溶液法 在蛋白質(zhì)溶液的總體積不大，要求達(dá)到的飽和度在50%以下時(shí)，可選用此方法。在已知鹽析出某種蛋白質(zhì)成分所要達(dá)到的飽和度時(shí)，可按下列公式計(jì)算出應(yīng)加入飽和硫酸銨溶液的量：V=V0（C2-C1）/(100-C2)

52、或V=V0（C2-C1）/(1-C2)式中 V0蛋白質(zhì)溶液的原始體積； C2所要達(dá)到的硫酸銨飽和度； C1原來(lái)溶液的硫酸銨飽和度； V應(yīng)加入飽和硫酸銨溶液的體積。將計(jì)算所得體積的飽和硫酸銨溶液加入到混合蛋白質(zhì)溶液中，即可達(dá)到鹽析的目的。嚴(yán)格講，混合兩種不同溶液時(shí)，混合后的總體積并不等于前兩種體積之和，而上式中按相等于計(jì)算的，所以會(huì)產(chǎn)生誤差。但試驗(yàn)證明所造成的誤差一般小于20，故可忽略不計(jì)。試劑與器材（1） 飽和硫酸銨溶液：取化學(xué)純（NH4）2SO4800g,加蒸餾水1000ml，不斷攪拌下加熱至50-60，并保持?jǐn)?shù)分鐘，趁熱過(guò)濾，濾液在室溫中過(guò)夜，又結(jié)晶析出，即達(dá)到100飽和度，試驗(yàn)時(shí)用濃NH

53、4OH調(diào)至pH7.0。（2） 0.01mol/L，pH7.0，磷酸鹽緩沖溶液：取0.2 mol/L Na2HPO4溶液61.0ml與0.2 mol/L NaH2PO4溶液39.0ml，混合，用酸度計(jì)檢查pH應(yīng)為7.0。取該混合液50ml，加入7.5gNaCl，用蒸餾水稀釋至1000ml。（3） 0.0175 mol/L，pH6.7，磷酸鹽緩沖溶液：取0.2 mol/L Na2HPO4溶液43.5ml與0.2 mol/L NaH2PO4溶液56.5ml相混合，用酸度計(jì)檢查pH應(yīng)為6.7。取該混合液87.5ml，用蒸餾水稀釋至1000ml。操作（1） 在1支離心管中加入5ml血漿和5ml0.01 mol/L，pH7.0磷酸鹽緩沖液，混習(xí)。用皮頭滴管吸取飽和硫酸銨溶液，邊滴加邊攪拌于血漿溶液中，使溶液的最終飽和度為20（應(yīng)加入飽和硫酸銨溶液多少毫升？），用滴管邊加邊攪拌，是為防止飽和硫酸銨溶液1次性加入和攪拌不均勻造成局部過(guò)飽和的現(xiàn)象，使鹽析達(dá)不到預(yù)期的飽和度，得不到目的的蛋白質(zhì)。攪拌時(shí)不要過(guò)急以免產(chǎn)生過(guò)多泡沫，致使蛋白質(zhì)變性。加完后應(yīng)在4放置15min，使之充分鹽析（蛋白質(zhì)樣品量大時(shí)，應(yīng)放置過(guò)夜）。然后以3000r/min離心10min。棄去沉淀（沉淀為纖維蛋白質(zhì)），在上清液中為清蛋白、球蛋白。（2） 量取上清液的體積，置于另一離心管中，用滴管