流式細(xì)胞術(shù)在微生物快速檢測(cè)領(lǐng)域的研究進(jìn)展-

1、2010年第3期9月出版摘要概述了流式細(xì)胞術(shù)的發(fā)展歷史、工作原理及其在微生物快速檢測(cè)方面的應(yīng)用。關(guān)鍵詞流式細(xì)胞術(shù);微生物;快速檢測(cè)Abstract The development history,detecting princi-ple,and its application of Flow Cytometry (FCM in rapid detecting microorganisms were reviewed.keywords flow cytometry ;microorganisms ;rapid detection隨著市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和生活水平的提高,特別是加入WTO 后,消費(fèi)者

2、對(duì)食品安全更加關(guān)注,食品安全與食品貿(mào)易的關(guān)系更為密切,提高我國(guó)食品安全水平的要求越來越迫切。為確保食品安全與食品貿(mào)易,降低細(xì)菌、真菌等微生物對(duì)食品安全和口味的影響,需要大力加強(qiáng)食品檢驗(yàn)的力度。于是,ATP 熒光法、紙片法、疏水柵格濾膜法、流式細(xì)胞術(shù)等快速檢測(cè)方法被采納應(yīng)用到微生物檢測(cè)行業(yè),其中流式細(xì)胞術(shù)是一門綜合了光學(xué)、電子學(xué)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、免疫學(xué)、激光和計(jì)算機(jī)等多門學(xué)科和技術(shù)性的先進(jìn)方法。流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry ,FCM 是一種在功能水平上對(duì)單個(gè)細(xì)胞或其他生物粒子進(jìn)行定量分析和分選的檢測(cè)手段。他能高速分析上萬個(gè)細(xì)胞,并能同時(shí)測(cè)量細(xì)胞的物理或化學(xué)性質(zhì),如粒子的大小、體積

3、、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNA 、RNA 、蛋白質(zhì)、抗原等,進(jìn)行多信息分析。他集電子技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、激光技術(shù)、流式理論于一體,被譽(yù)為實(shí)驗(yàn)室里的“CT ”。如今,他正成功的運(yùn)用于免疫學(xué)、遺傳學(xué)、血液學(xué)、腫瘤學(xué)、病理學(xué)、放射生物學(xué)等,并在其中交叉滲透,逐漸形成了獨(dú)立的學(xué)科分支。1FCM 的發(fā)展歷史1930年,Casperrsson 和Thorell 開始致力于細(xì)胞的計(jì)數(shù)。1934年,Moldaven 是世界上最早設(shè)想使細(xì)胞檢測(cè)自動(dòng)化的人,他試圖用光電儀記錄流過1根毛細(xì)管的細(xì)胞數(shù)量。1936年,Caspersson 等引入顯微光度術(shù)。1940年,Coons 提出用結(jié)合熒光素的抗體去標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的特定蛋白。194

4、7年,Guclcer 運(yùn)用層流和湍流原理研制煙霧微粒計(jì)數(shù)器。1949年,Coulter 提出在懸液中計(jì)數(shù)粒子的方法并獲得專利。1950年,Caspersson 用顯微分光光度計(jì)在紫外(UV 和可見光光譜區(qū)檢測(cè)細(xì)胞。1953年,Croslannd2Taylor 應(yīng)用分層鞘流原理,成功地設(shè)計(jì)紅細(xì)胞光學(xué)自動(dòng)計(jì)數(shù)器。1953年,Parker 和Hutcheon 描述一種全血細(xì)胞計(jì)數(shù)器裝置,成為流式細(xì)胞儀的雛形。1954年,Beirne 和Hutchcon 發(fā)明光電粒子計(jì)數(shù)器。1959年,B 型Coulter 計(jì)數(shù)器問世;1965年,Kamemtsky 等提出兩個(gè)設(shè)想:用分光光度計(jì)定量細(xì)胞成分;結(jié)合測(cè)量

5、值對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分類。1967年,Kamemtsky 和Melamed 在Moldaven 的方法基礎(chǔ)上提出細(xì)胞分選的方法。1969年,Van Dilla Fulwyler 及其同事們?cè)贚osALmos ,NM (即現(xiàn)在的National Flow Cytometry Resource Labs 發(fā)明第一臺(tái)熒光檢測(cè)細(xì)胞計(jì)。1972年,Herzenberg 研制出一個(gè)細(xì)胞分選器的改進(jìn)型,能夠檢測(cè)出經(jīng)熒光標(biāo)記抗體染色的細(xì)胞的較弱的熒光信號(hào)。1975年,Kochler 和Milstein 提出單克隆抗體技術(shù),為細(xì)胞研究中大量的特異性免疫試劑的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。張峻峰*劉道亮趙占民孫曉霞胡連霞(河北出入境檢驗(yàn)

6、檢疫局,石家莊050050流式細(xì)胞術(shù)在微生物快速檢測(cè)領(lǐng)域的研究進(jìn)展ZHANG Jun-feng *LIU Dao-liangZHAO Zhan-minSUN Xiao-xiaHU Lian-xia(Hebei Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau ,Shijiazhuang 050050,China*張俊峰,男,1981年出生,2004年畢業(yè)于浙江大學(xué)生物技術(shù)專業(yè),工程師。收稿日期:2010-06-19食品工程FOOD ENGINEERINGResearch development on flow cytometry in the rapid

7、detection of microorganisms192010年第3期9月出版2流式細(xì)胞儀的工作原理流式細(xì)胞儀主要由流動(dòng)室及液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)、激光光源及光束形成系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)、信號(hào)檢測(cè)與存儲(chǔ)、顯示分析系統(tǒng)、細(xì)胞分選系統(tǒng)5個(gè)部分組成。待測(cè)細(xì)胞被制成單細(xì)胞懸液,經(jīng)不同的熒光染料染色后加入樣品管,在氣壓推動(dòng)下,進(jìn)入流動(dòng)室,流動(dòng)室內(nèi)的鞘液包繞著樣品。此時(shí),細(xì)胞在鞘液的約束下單行排列,依次通過檢測(cè)區(qū),被熒光染料染色的細(xì)胞受到強(qiáng)烈的激光照射,產(chǎn)生散射光和熒光信號(hào)。散射光分為前向角散射(Forward Scatter,FS和側(cè)向角散射或90°散射(Side Scatter, SS。前者主要反映被測(cè)

8、細(xì)胞的大小,后者主要反映其胞質(zhì)、胞膜、核膜的折射等以及細(xì)胞內(nèi)顆粒的性狀。光信號(hào)通過波長(zhǎng)選擇通透性濾片后,經(jīng)光電倍增管接受轉(zhuǎn)為電信號(hào),再經(jīng)數(shù)/模轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換為可被計(jì)算機(jī)識(shí)別的數(shù)學(xué)信號(hào),以一維直方圖或二維位圖及數(shù)據(jù)表或三維圖形顯示出。流式細(xì)胞儀具有高分辨能力,主要表現(xiàn)在五個(gè)方面:測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的DNA的變異系數(shù)最小,一般為1%2%;正確分辨二倍體、四倍體、近二倍體和非整倍體,可用于細(xì)胞周期分析;利用特配的激光熒光染料進(jìn)行蛋白質(zhì)、核酸染色及熒光分析,可以敏感的鑒別細(xì)胞上熒光量的差異;能夠選擇地對(duì)某個(gè)細(xì)胞群進(jìn)行分析;盡管對(duì)單細(xì)胞懸液植被要求嚴(yán)格、操作復(fù)雜,但檢測(cè)客觀,總分析數(shù)多,統(tǒng)計(jì)結(jié)論可靠。3FCM在微生

9、物快速檢測(cè)中的應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)最初主要應(yīng)用于科學(xué)研究和臨床檢驗(yàn),在微生物學(xué)方面的應(yīng)用則發(fā)展相對(duì)較晚。近20年來,國(guó)內(nèi)外專家學(xué)者使用FCM在微生物學(xué)上做了不少的研究和應(yīng)用工作,已經(jīng)成為高水平病原微生物研究中不可缺少的技術(shù),可用于微生物基因組及功能基因組學(xué)、生理生化學(xué)、臨床微生物學(xué)、抗感染免疫學(xué)、藥物學(xué)等領(lǐng)域。實(shí)際上,微生物學(xué),尤其是細(xì)菌學(xué)當(dāng)前面臨的一些問題,特別是需要對(duì)大數(shù)量細(xì)菌進(jìn)行逐個(gè)的快速多參數(shù)精確測(cè)量時(shí),流式細(xì)胞術(shù)很適合解決此類問題。已發(fā)表的論文多數(shù)是針對(duì)酵母菌和各類細(xì)菌的測(cè)量與分析。酵母菌的測(cè)量在技術(shù)上比較簡(jiǎn)單,他自身體積大,其DNA 含量約為人類二倍體細(xì)胞DNA含量的1/200。在工業(yè)中

10、,流式細(xì)胞術(shù)可用于快速微生物鑒定,如對(duì)飲用水及原油中的微生物學(xué)鑒定與控制。因此,流式細(xì)胞術(shù)在液態(tài)商品的微生物檢測(cè)方面的應(yīng)用越來越受到人們的關(guān)注。近年來,FCM與熒光染料的聯(lián)合運(yùn)用可判斷細(xì)菌的活力和功能狀態(tài),由于檢測(cè)速度快,周期短,已經(jīng)被應(yīng)用于食品加工業(yè)、化妝品加工業(yè)、制藥業(yè)和水質(zhì)監(jiān)測(cè)等行業(yè)。3.1在食品加工業(yè)中的應(yīng)用3.1.1在食品發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用1990年Day首次將FCM應(yīng)用于酒類釀造之后,該技術(shù)在國(guó)外被廣泛運(yùn)用于面包發(fā)酵、釀酒等行業(yè)。1999年Srienc對(duì)同步化酵母細(xì)胞發(fā)酵液中CO2的產(chǎn)量與細(xì)胞周期進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)同步化酵母細(xì)胞數(shù)量最大時(shí),CO2的產(chǎn)量最高,即細(xì)胞活性最高。在國(guó)內(nèi),

11、肖安風(fēng)等利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)PI染色的畢赤酵母細(xì)胞活性。目前國(guó)內(nèi)啤酒制造行業(yè),FCM 方法主要應(yīng)用于對(duì)啤酒中活細(xì)菌數(shù)量檢測(cè)監(jiān)測(cè)并且控制生產(chǎn)流程中啤酒酵母的數(shù)量。啤酒酵母的活性和數(shù)量對(duì)優(yōu)化發(fā)酵和產(chǎn)品質(zhì)量非常重要,同時(shí)死亡的酵母細(xì)胞由于細(xì)胞膜不完整而導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)的流出,會(huì)對(duì)啤酒口感產(chǎn)生嚴(yán)重影響,因此快速檢測(cè)啤酒中的酵母等微生物項(xiàng)目,便于隨時(shí)了解啤酒生產(chǎn)流程中酵母數(shù)量的變化,并可以及時(shí)調(diào)整發(fā)酵罐中各成分的配比,對(duì)于啤酒生產(chǎn)有著重大意義。3.1.2在乳制品加工中的應(yīng)用目前,在乳制品加工過程中,流式細(xì)胞術(shù)主要應(yīng)用于生乳中微生物指標(biāo)的檢測(cè)和UHT奶的無菌監(jiān)測(cè)。生乳(raw milk是從健康奶畜擠下的常乳,僅經(jīng)

12、過冷卻,可能經(jīng)過過濾,但未經(jīng)過任何殺菌處理。生乳中微生物數(shù)量會(huì)影響產(chǎn)品的質(zhì)量、貨架期及生產(chǎn)流程的安全性。用FCM法代替應(yīng)用最廣泛的平皿計(jì)數(shù)法,極大的縮短了檢測(cè)時(shí)間,而且流式細(xì)胞術(shù)可以區(qū)分具有生命活力的細(xì)菌和已經(jīng)死亡的細(xì)菌,并可以同時(shí)進(jìn)行多個(gè)樣品的處理,能夠滿足大量樣品在線檢測(cè)的要求。3.1.3在飲料類食品加工行業(yè)中的應(yīng)用UHT奶、巴氏奶、軟飲料、礦物質(zhì)水、果汁及水果濃縮汁等液體飲料富含營(yíng)養(yǎng)成分,一旦被微生物污染,極易腐敗變質(zhì),因此在最終產(chǎn)品放行之前,對(duì)其在生產(chǎn)過程中進(jìn)行快速實(shí)時(shí)無菌監(jiān)測(cè),使生產(chǎn)過程中微生物的污染得到及時(shí)有效控制。另食品工程202010年第3期9月出版張峻峰,等:流式細(xì)胞術(shù)在微生

13、物快速檢測(cè)領(lǐng)域的研究進(jìn)展外,在酸奶的生產(chǎn)工程中,FCM方法還被應(yīng)用于檢測(cè)其中添加的有益的乳酸菌的數(shù)量。3.2制藥業(yè)FCM方法可以通過熒光染料標(biāo)記來檢測(cè)病原菌、毒素和血清抗體,因此可用于抗生素敏感性試驗(yàn),并對(duì)抗生素后效應(yīng)、細(xì)菌耐藥的異質(zhì)性等進(jìn)行分析。一方面,在藥物制造過程中,注射用水和純凈水的檢測(cè),需要對(duì)可見的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、微生物芽胞、酵母菌和霉菌進(jìn)行間個(gè)細(xì)胞檢測(cè),FCM方法在2h 內(nèi)提供結(jié)果,不需要細(xì)胞的增長(zhǎng),且敏感性高,而且有非常廣泛的應(yīng)用功能。由于能夠快速、準(zhǔn)確的提供實(shí)時(shí)的趨勢(shì)分析,這使管理者對(duì)非正常結(jié)果能及時(shí)做出快速反應(yīng)。另一方面,人們通常在食品中添加一些消毒防腐劑,以便更安全、更長(zhǎng)久地保存

14、食品。季胺類藥物由于具有一定的表面活性、無腐蝕且毒性低等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛地用于食品保鮮和臨床環(huán)境的防腐消毒。但隨著他的使用,許多國(guó)家已發(fā)現(xiàn)金葡菌和凝固酶陰性葡萄球菌對(duì)季胺類藥物產(chǎn)生耐藥性。因此,為了防止耐藥菌的流行,有必要對(duì)耐藥菌進(jìn)行調(diào)查和監(jiān)測(cè)。3.3水質(zhì)檢測(cè)20世紀(jì)80年代流式細(xì)胞術(shù)被引入水生生態(tài)系統(tǒng)研究以來,該技術(shù)正以其樣品制備簡(jiǎn)單、可進(jìn)行快速多參數(shù)數(shù)據(jù)采集、精確測(cè)定、不易受溶解有機(jī)物的干擾、可進(jìn)行多元數(shù)據(jù)分析及具分選功能等優(yōu)越性引起愈來愈多研究者的關(guān)注,從而成為水生和環(huán)境微生物學(xué)研究中的一項(xiàng)重要工具。之后的20多年里,流式細(xì)胞術(shù)在國(guó)外蓬勃發(fā)展,在環(huán)保領(lǐng)域,Yamaguchi等應(yīng)用FCM測(cè)定了

15、細(xì)菌在污染和未污染河水中呼吸及酶活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn),細(xì)菌的酯酶活性比率與河水污染程度直接相關(guān),這一比率可作為評(píng)價(jià)水環(huán)境污染程度的指標(biāo)。Coskuner等鑒定了活性污泥中硝化細(xì)菌群落的組成和分布,為研究污水處理中氮素循環(huán)提供了重要信息。在水生生物學(xué)研究領(lǐng)域,Fushs等采用流式細(xì)胞儀與熒光原位雜交技術(shù)及變性梯度凝膠電泳結(jié)合的方法來研究浮游細(xì)菌的分類鑒定;在海洋環(huán)境中,海洋細(xì)菌,即異養(yǎng)細(xì)菌在物質(zhì)循環(huán)和能量循環(huán)中扮演著重要角色,他能分解海水中的有機(jī)質(zhì)并將營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)提供給上一級(jí)浮游植物,從而完成物質(zhì)循環(huán),是海洋生物鏈中不可或缺的重要組成部分,Olson R J、Grégori G等利用FCM技術(shù)對(duì)

16、海洋細(xì)菌在海洋生態(tài)中的作用以及在極端環(huán)境中特殊功能展開了大量的研究。近幾年,國(guó)內(nèi)也加強(qiáng)了在這些方面的研究,主要集中于水體中的浮游植物,包括對(duì)淡水湖富營(yíng)養(yǎng)化、赤潮等的研究,潘洛安等也曾用SYBR Green I染料對(duì)自然水樣進(jìn)行染色,再結(jié)合FCM來計(jì)數(shù)其中的異養(yǎng)細(xì)菌。3.4化妝品檢驗(yàn)化妝品衛(wèi)生質(zhì)量長(zhǎng)期以來一直被人們所重視,尤其是微生物學(xué)檢驗(yàn)指標(biāo)與方法不斷被研究。最近幾年化妝品行業(yè)檢驗(yàn)水平逐漸提高,流式細(xì)胞儀也被引入到化妝品中微生物的檢驗(yàn)。對(duì)于香水類的化妝品,香水中的酒精濃度本可有效抑制霉菌和酵母菌的生長(zhǎng)。但在酒精含量降低、污染量大、菌株耐酒精作用強(qiáng)時(shí),香水類化妝品可有霉菌和酵母菌生長(zhǎng)。所以,在日

17、常監(jiān)測(cè)中, FCM方法被用來監(jiān)控其中的活菌的生長(zhǎng)情況。對(duì)于含抗菌劑化妝品,防腐效力檢驗(yàn)是化妝品被審批時(shí)必須做的檢測(cè)。一方面,FCM方法用于檢測(cè)其中的微生物含量,以檢驗(yàn)化妝品防腐劑抑菌效果;另一方面化妝品中各種不同的化學(xué)成分對(duì)防腐劑的抑菌效果會(huì)產(chǎn)生不可知的影響,所以FCM方法也適合于測(cè)定化學(xué)成分對(duì)防腐劑的影響效果。4FCM的發(fā)展前景和問題近年來,隨著各項(xiàng)科學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展,多學(xué)科之間的相互結(jié)合成為大的趨勢(shì),與生物醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等相關(guān)學(xué)科的結(jié)合已成為流式細(xì)胞技術(shù)發(fā)展的必然方向,例如,將生物芯片技術(shù)和FCM有機(jī)結(jié)合在一起,把不同生物探針(核酸、蛋白等標(biāo)記在各種有熒光的微球上,以熒光標(biāo)記

18、微球作為反應(yīng)載體在液相系統(tǒng)中完成生物學(xué)反應(yīng),即為流式細(xì)胞術(shù)液相芯片技術(shù),他可以在同一液相中同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目的分子,完成多組分的快速檢測(cè)。同時(shí),流式細(xì)胞儀的功能不斷完善、各種功能強(qiáng)大的分析軟件的開發(fā)、多參數(shù)分析技術(shù)的發(fā)展等,為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的提高和分析能力的擴(kuò)展提供了保障,并使儀器不斷向小型化,操作自動(dòng)化,簡(jiǎn)單化方向發(fā)展。可以預(yù)見,在未來微生物快速檢測(cè)領(lǐng)域,流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用范圍會(huì)進(jìn)一步擴(kuò)大,應(yīng)用深度會(huì)進(jìn)一步加強(qiáng)。當(dāng)然,流式細(xì)胞技術(shù)完全應(yīng)用于微生物快速檢212010年第3期9月出版測(cè)還有很多問題亟待解決,首先是在國(guó)內(nèi)尚無標(biāo)準(zhǔn)可循;其次,流式細(xì)胞儀的前期成本投入較大,運(yùn)行操作的費(fèi)用較高;再次

19、,流失細(xì)胞技術(shù)可應(yīng)用的樣品種類太少,暫時(shí)只能應(yīng)用于液態(tài)商品,而且,不同液態(tài)商品中不同的基質(zhì)對(duì)熒光染料的標(biāo)記和熒光信號(hào)的收集都可能產(chǎn)生未知的影響,如何提高特異性,還需要我們研究解決。參考文獻(xiàn)1楊懷德,張才軍,李秀義,等.流式細(xì)胞術(shù)在微生物學(xué)中的應(yīng)用J.醫(yī)學(xué)綜述,2006,12(13:825-827.2左連富.流式細(xì)胞術(shù)與生物醫(yī)學(xué)M.沈陽(yáng):遼寧人民出版社,1996:129-422.3沈關(guān)心,周汝麟.現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)M武漢:湖北科學(xué)技術(shù)出版社,2002:226-230.4魏熙胤,牛瑞芳.流式細(xì)胞儀的發(fā)展歷史及其原理和應(yīng)用進(jìn)展J.現(xiàn)代儀器,2006(4:8-11.5M AECKER HT.Cytok

20、ine flow cytometry methodsJ.M olBiol,2004,263:95-108.6張藝.流式細(xì)胞儀構(gòu)成與工作原理J醫(yī)療設(shè)備信息,2005,20(8:25-26.7王菊香,裴士庚,陳文弦.流式細(xì)胞儀及其在科研及醫(yī)療上的應(yīng)用J.邯鄲醫(yī)專學(xué)報(bào),1996,9(3:241-243.8曾令武.流式細(xì)胞術(shù)J.微生物與感染,2008,3(2:125-126.9SHERRIF F.IBRAHIM L,GER VAN DEN ENGH.Flowcto-metry and Cell SortingJ.Adv Biochem Engin/Biotechnol.2007,106:19-39.1

21、0JOHN P.NOLAN,LORETTAYANG.The flow of cytometryinto systems biology Briefings in functional genomics andproteomicsJ.2007,6(2:81-90.11閆虹,流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用J.現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2007,22(5:93-95.12DAY A,M EYLING J C.Practical experience with rapidmethods ofdetectingyeasts in breweriesJ.J Inst Brew,1990,89:204-206.13SRIEN

22、C F.Cytometric data as the basis for rigorous models ofcell population dynamicsJ.J Biotechnol,1999,71:233-238.14肖安風(fēng),周祥山,周利,等.應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)畢赤酵母的細(xì)胞活性J.微生物學(xué)通報(bào),2006,33(6:22-26.15張波,陳君,盧啟威,等.應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)啤酒酵母在含油酸培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的定量研究J.現(xiàn)代儀器,2008(2:16-20.16王寧,劉寧.流式細(xì)胞術(shù)快速檢測(cè)生乳中細(xì)菌總數(shù)J.食品工業(yè)科技,2007,28(9:197-200.17LAPLACE-BUILHE,C H

23、AHNE,K HUNGER,et al.Application of flow cytometry to rapid microbial analysis infood and drinks industriesJ.Biol Cell,1993,78:123-128. 18李慶,馬筱玲,李柏青,.流式細(xì)胞術(shù)在臨床細(xì)菌學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用J.國(guó)外醫(yī)學(xué)臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè),2002,23(6:344-345.19D.L.JONES,M.A.BRAILSFORD,J-L.DROCOURT SOLID-PHASEK.aser-scanningcytometry:a newtwo-Hour methodf

24、or the enumeration ofmicroorganisms in pharmaceutical waterJ.Pharmacopeial Forum,1999,25(1:7626-7645.20華德興,錢元恕.細(xì)菌的消毒防腐劑耐藥基因研究進(jìn)展J.中國(guó)抗生素雜志,2008,33(9:513-519.21ROBERTSONBR,BUTTONDK,KOCH AL.Determinationof the biomasses of small bacteria at low concentrations in amixture of species with forward light sc

25、atter measurements byflow cytometryJ.Appl Environ M icrobiol,1998,64(10:3900-3909.22YAM AGUCHI N,NASU M.Flowcytometric analysis of bac-terial respiratory and enzymatic activity in the natural aquaticenvironmentmJ.Appl M icrobiol,1997,83(1:43-52. 23COSKUNER G,CURTIS T P.In situ characterization ofnitrifiersinan activated sludge plant:detection of nitrobactersppJ.Journal