生物化學簡明教程ppt第二章蛋白質.

1、第二章蛋白質蛋白質主要元素組成：c. H、0、N、S及P、Fe. Cu. Zn. Mo、I、Se 等微量元素。円首卜阿凱氏定第一節(jié)蛋白質的分類、根據(jù)分子形狀分類、根據(jù)分子組成分類中.純蛋白質（如淸蛋白等）結合蛋白質（如核蛋門等）三.根據(jù)功能分類催化蛋白調節(jié)蛋白結構蛋白運輸?shù)鞍踪A藏蛋白運動蛋白 防御蛋白 電子傳遞蛋白第二節(jié) 蛋白質的組成單位氨基酸J含芳香環(huán)及雜環(huán)R基：Phe、Trp. Pro不帶電荷的極性R基:Ser、Thr、Asn、Gin、Tyr、Cys極性R基氨基酸帶正電荷的極性R基：Lys、His、Arg帶負電荷的極竹H基：Asp、Glu2、按R基的化學結構不同來分類了 倉氨基 竣基的Gl

2、y、Ala、Vai、Leu、lie.中網啟酸：“、Met金片旱的氨基酸：Ser.Thr、脂肪族氨基酸含1O的氨基酸：Asn.Gin含氨基二竣基的Acnril,fim氮基酸：心、Glu1含二氨基一滋基的LvsAm輕奴基酸：廬、舊芳存族氨基酸：Phe、Tyr雜環(huán)族帆莊購：TrD、His、Pro三、氨基酸的理化性質1、一般物理性質2. 化學性質廠萬亞硝酸的反應(1)氨基參加的反W與甲醛的反應92, 4硝肚觸苯的反應與界硫機酸苯酯的反應/戈鹽和成脂反應(2) 竣基參加的反應T訛竣反應(3) 氨基和竣基共同參加的反應兩性解離(兩件離于、兩件解離、等電點)苗三酮反應I成肽反應（4）由側鏈慕團參加的反應雙縮

3、尿反應 黃蛋白反應 乙醛酸反應 坂口反應酚試劑反應米倫氏反應第三節(jié) 肽_、肽的結構幾個重要的概念：肽、肽鍵、氨味酸殘里、N端C端、多肽、.硫鍵、酰氨平面第四節(jié) 蛋白質的結構(一) 、蛋白質的一級結構定義 舉例：胰島素的級結構(二) 、空間結構包禽的內容1、蛋門質的二級結構(1)、定義a 螺旋結構(2) 、包含內容彳B折廉結構10轉角結構(3) 、超級結構:aa、 Pap.祁0、卩曲折、結構域2、蛋白質的三級結構舉例：兒纟I 丨的"3、蛋白質的四級結構舉例：血紅蛋I的四級結構（亞基）三、維持蛋白質構象的化7鍵1、共價鍵：肽鍵、二硫鍵2、非共價鍵：型也范徳華力、鹽鍵（離子鍵）、疏水鍵第五

4、節(jié)蛋白質結構與功能的關系一、蛋白質一級結構和功能的關系仁種屬差異2、分f病二、蛋口質的空間結構與功能的關系別構現(xiàn)象第六節(jié) 蛋白質的性質與分離.分析技術一、蛋白質的性質1、蛋白質的相對分子質量 沉降系數(shù)S2、蛋白質的兩性解離和等電點等電點isoelectric poirH:蛋白質分子所帶的 正電荷和負電荷相等時溶液的pH值.pl在有中性鹽時有明顯變化，因分子中某些 解離基團可與鹽的離子如Ca2+、Mg2+、Cl->HPO42-結合，觀察到的pl在一定程度上決定于介 質中離子的組成.pl是蛋白質的一個特征常數(shù).不同的蛋白質有不同的等電點等電點是蛋白質的一個特征常數(shù)，其等電點 是由可解離基團的

5、種類和數(shù)目決定的，而這在不 同的蛋右質中是不同的.不同蛋白質的酸性氨基酸殘基和堿性氨基酸 殘基的多少，直接影響蛋白質等電點的大小。蛋白質在等電點時的溶解度最小，因此不同 蛋白質的等電點不同來沉淀不同的蛋白質，分離 蛋白質混合物3、蛋白質的變性(1) 、變性的概念在變性因素作用下，天然蛋白質一級結構保 持不變，高級結構發(fā)生了異常的變化，由天然態(tài) 的折迭態(tài)變成了變性的伸展態(tài)，引起生物功能的 喪失，理化性質的改變的現(xiàn)象。氨基酸的甲醛滴定丄為aNib的反應B.莊常溫，中性條件.甲醛與a - MljIR快反應.生成輕甲基衍生物.釋放氫離子.氨基酸定量分析一甲醯滴定法（間接滴定） 兒直接滴定.終點pHit

6、高（12） 沒有適當指示劑. B與甲軽反應，滴定終點在9左右.可用酚釀作指示劑. C.釋放一個氫離子.相當于一個飢基（摩爾比1： 1）與異硫氣酸苯酯（PITC）的反應?。ū疆惔_鼠酸酯法）：由Edm&n于1950年首先提出，為a- NH2的反應，用于N末端分析，又稱 Ednmn降解法。此法的特點是能夠不斷重復循環(huán)，將 肽鏈N-端氨基酸殘基逐一進行標記和解離肽鏈（N«|氨基酸）與PITC偶聯(lián)，生成PTC肽環(huán)化斷裂：域確近PTC展的肽鍵斷裂，生成PTC氨堆酸和少一殘展的肽鏈，同時PTC 猱加酸壞化生成PTH似卑酸分離PTH氨基酸層析法鑒定 Edman-用DNS（-甲甲緊磺酰氯）測疋

7、N端氮基槪原理DNFB法相同但水解后的DNS氨肚酸不需分離，可直接用電泳或層析法 鑒定山于DNS臺強烈熒光，靈敏度比DNFB法髙100倍，比與2, 4-二硝基氟苯（DNFB）反應A. 為a- NR?的反應B. 氨基酸a- NH?的一個H原子可被炷基取代（鹵代炬）C在弱堿性條件下，與DNFB發(fā)生芳環(huán)取代，生成二硝基門月.鑒定多肽或蛋白質的N-末端氨基酸首先lllSanger應用，確定了胰島索的一級結構A. 肽分子與DNFB反應，得DNP肽B. 水解DNP肽，得DNPN端氨基酸及工他游離氨 基酸C. 分離DNP 姐荒酸D.層析法定性DNP-M基酸,得出N端氨基酸的種Corey & Paul

8、ing(Corey1897 1971Paulinga螺旋(ahelix)特征1、每隔3. 6個AA殘 基螺旋上升一圈，螺距 0.54nm;2. H旋體中所有氨基 酸殘基R側鏈都伸向外側， 鏈中的全部（工0和NH幾 乎都平行于II旋軸：3、每個氨基酸殘基的 N-H與前面第四個氨基酸殘 基的C=O形成氫仏 肽桂上 所有的肽鍵都參與氫犍的形 成.形成因素與AA組成和排 列順序直接相關.多態(tài)性多數(shù)為右手（較穩(wěn) 定），亦有少數(shù)左手螺旋存 在（不穩(wěn)定X存在尺寸不網 的媒瓠*影響a -螺旋形成的因素氨基酸組成和序列？R基團？脯氨酸？P 折疊定義：兩條或幾條幾孚完全伸展的篡肽鏈側向聚集在 起相鄰 肢詵匸鏈上的

9、奴基和頊呈Z間形成右規(guī)則的氧鍵，維持這種片足結構的特點：纟肽鏈匸徒比絞伸展，相鄰如的軸心和為O.35nm.側鏈R殳 替分布在片層平面的上、下方.令平行和反平行兩面種兒f所仃的肽遜都參I if鏈間啦建的形成肌紅蛋白（myoglobin）分子由一條多肽鏈 （153個殘基）和一個血紅素組成.分子呈扁圓形， 大小為4.5nm x 3.5nm x 2.5nm°多肽鏈主鏈骨架包 含長短不等的A、B、C、D、E、F、G、H共8個 a螺旋。分子中幾乎80%的氨基酸殘基都是位于a 螺旋結構中.a螺旋之間的拐彎處（AB、CD、EF、 FG、GH）是無規(guī)卷曲。絕大多數(shù)親水性R側鏈分 布在分子的外表面，與水

10、分子結合，使肌紅蛋白 可溶于水溶液中。絕大多數(shù)疏水性R側鏈埋藏在分分子表面有一個深陷的洞穴.該洞穴由C、E、 F、G共4個螺旋段構成。洞穴周圍分布許多疏水 性R側鏈，從而為洞穴構成了疏水性環(huán)境。平面 的血紅素分子埋人疏水的洞穴中.維持肌紅蛋白 分子二級結構的力是范德華引力、疏水鍵、氫健 和配位鍵。血紅蛋白的四級結構V維系蛋白質分子的一級結構：肽鍵、二硫犍V維系蛋白質分子的二級結構：氫犍丁維系蛋白質分子的三級結構：疏水相互作用力、氫鍵、 范律華力.鹽tt7維系蛋白成分子的四級結構：范德華力、鹽鍵a鹽犍（離子犍） b氫犍C疲水相互作用力d范德華力&二磕鍵f陌鍵中性脂肪族氛基酸COOHjN

11、-C-H$ H ?甘気酸«ilyX；)COOCOOCOOl 彳 iCHjj "CH z 、i15HX-C-K X|:HjC CH,:CH 、CH,:H,C CH,：1CH,亮氨酸異亮氯酸(AhuA)含疑基或硫膚驟氨基muc,)(IleJ)-C-Hcoo1COO 1H<N C HH,N C H9 丫 H C-OK：:<1 :1 :OH ：ch5絲氨隈蘇氨酸/TK.T、coocooHjN C-H1HjNC H I1 CH2 :? 1 :SH :ch2 :! 1 ?! s半甲硫氨酸:i? CH,：f w 彳rxtoi MA酸性氨基酸及酰胺COO*COO"CO

12、O"coo* 1 H.N-C-H.1 HjN-C-H 1 HjN-C-Hh3n - c -h| ch2 !1 ch21 CHi11ch2i 1 1;111 COOH i竿 c; ch2；COOHQNH2 =!<；& 0 NH,天冬氨酸谷氨酸天冬酰胺谷氮酰胺(AspJ)(Ghi.E)(AsnTN )(Gln.Q)堿性氨基遼COO"COCTCOCT 1 HjN-C-HH,N -C-H41HjN-C-Hi ch2 I 1CH?1CH,I 11 1i2i円:$ch2HC=C1X:ch2 i? 1 ;ich21xi /' i：H %zNH| 雜環(huán)I ch2 IN

13、HI£ iMJ:NH3 ： 夕、:h2n nh2H賴氨酸精氨酸組氨酸(Lys,K)(Arg.R)(HisJI)ch2HC = CNH脯氨酸(Prof)組氨酸(His Ji)芳香族氨基酸COOCOO*酪氨酸(TynY)色氨酸 (TrgV)苯丙氨酸(Phe.F)雜環(huán)氨基酸COOcoo4 Ih3n 一 ch氨基酸的兼性離子形式：氨基酸或肽在晶體或水中以兼性離子形式 存在，熔點高。 OO氨基酸的兩性解離R1+R1+ OHR .ICII-NH?V- ii N M、- 1CH-NIkCOOHCOO"+1 2 ccxrpH< pl(pic JpH = pIpH>pI凈電荷為正

14、凈電衙=0凈電荷為負pH = pl：蛋白質處于中性環(huán)境，兩邊解離趨勢相等而成兼性離子 pH > Ph蛋白質處于堿性環(huán)境，竣基解離趨勢大于氨基而成負離子 pH<pl：蛋白質處于酸性環(huán)境，氨基解離趨勢大于敖基而成正離子氨基酸的等電點當氨基酸溶液在某一定pH值時.使某特定氮基酸分子上所帶正 負電荷相等，成為兩性離子，在電場中既不向陽極也不向陰極移動 ,此時溶液的pH值即為該氨基酸的等電點(Isoelectric polnl, pl).在氨基酸等電點以上任何pH, AA帶凈的負電荷，在電場中 向陽極移動；在氨基酸等電點以下任何pH, AA帶凈的正電 荷，在電場中向陰極移動.在一定pH范圍中

15、，溶液的pH離AA等電點愈遠，AA帶凈電荷pKj+pKjpKj+pKRCOOH pl= S一氮基一竣基AA的等電點計算：二氨基一竣基AA的等電點計算：pK2+pKRNH2pl= ;一氮基二竣基AA的等電點計算：可見，奴基酸的pl值等于該氨基酸的兩性離子狀態(tài)兩側 的基團pk，眨的一. °®白質兩性解離性質和等電點/ NH/+p / nh +/NH, pr、COOH+p COO"+ 1 COO-pH< plpH = pIpH>pI凈電荷為正凈電荷=0凈電荷為負當?shù)鞍踪|溶液在某一定pH值時，使某特定蛋白質分子上所帶正負 電荷相等，成為兩性離子，在電場中既不向

16、陽極也不向陰極移動，此 時洛液的pH值即為該蛋白質的等電點（isoekxmc point，pD P 轉角（0 -turn）:多肽 鏈中氨基酸 殘基n的撥基 上的氧與殘 基（n+3）的 氮原上的氫 之間形成氫 鍵，肽鍵回 折 180° A.呂絶稔椅牝希椅繊(1)超二級結構(supersecondary structure )蛋白質中相鄰的二級結構單位(即單個a 螺錠或卩一折疊或卩 一轉角)組合在-起，形成有規(guī)則的、在空間上能辯認的二級結構組 合體稱為蛋白質的超二級結構基本組合方式：a n Bp p 0(2)(structure domain)在二級結構的基礎上，多肽進一步卷曲折疊成幾個

17、相對獨立、近 似球形的三維實體，再由兩個或兩個以上這樣的三維實體締合成三級 結構.這種相対獨立的三維實體稱為結構域.形成意義：動力學上更為合理蛋白質(酶)活性部位往往位于結構域之間，使其更具柔性a-氨基可與亞硝酸反應產生氮氣!二級結構secondary structure一級結構 primary structure三級結構 Tertiary structure結構域 Structure doman超二級結構 supersecondary struc四級結構quariernary structure氫鍵(hydrogen bond )主要維持蛋白質分子的二級結構，對三、四級結 構亦有一定作用.范

18、德華引力(Van der weals force )實質是靜電引力，維持三、四級結構。包括： 二個極性基團偶極之間的靜電吸引(取向力)； 極性基團的偶極與非極性基團的誘導偶極之間 的靜電吸引(誘導力)； 二個非極性基團瞬時偶極之間的靜電吸引(色 散力)。疏水作用力(hydrophobic bond )2個或2個以上的疏水基團(非極性基團)因極 性水分子的排斥而接近，因范德華引力而結合，這 種結合力稱疏水作用力或疏水鍵。主要維持三、四 級結構.離子鍵(ionic bond )正負離子之間的靜電吸引產生的化學鍵.在一 些蛋白質分子中，離子鍵參與維持三、四級結構。二硫鍵(disulfide bond

19、 )指二個硫原子之間的共價鍵，又稱二硫橋、硫 硫橋。在一些蛋白質中，二硫鍵對穩(wěn)定蛋白質分子 構象起重要的作用.患者的Hb量僅為正常人（15-16g/i00ml ）的一 半，紅細胞數(shù)目是正常人（4.6-62） x 13個/ml的一 半左右，且形態(tài)不正常，除有大量的未成熟紅細胞 外，還有很多長而薄、新月狀或鐮刀狀的紅細胞。 當紅細胞脫氧時，這種鐮刀狀細胞明顯增加。純合子（50%紅細胞鐮刀狀化）多在童年死去 ,無后代；雜合子患者（1%的患者紅細胞鐮刀狀 化）的壽命也短，但能抵抗流行于非洲的致死性瘧 疾（malaria）,會有后代。正常紅細胞與 鐮刀形紅細胞 的掃描電鏡圖氨基酸序列的細微變化正常的血紅

20、蛋白Hb和異常的血紅蛋白HbS僅在卩 鏈的第&個氨基酸有Glu變?yōu)榱薟I,電泳時向正極的 移動速度HbS比HbA稍慢。A鏈N端氨基酸排列順序12345678Hb-A （正常人）Val-His-Leu-Thr-Pm-Glu-Glu-Lys.Hb-S （患 者）Val-Hls-I.eu-Thr-lVal.Glu-Lys人類發(fā)現(xiàn)的30()多種血紅蛋白變體，絕大多數(shù)只 有一個氨基酸差異，因為取代的位置不同，對功能的 影響程度有差異，但目前對取代氨基酸影響功能的了 解很少。鐮刀狀細胞血紅蛋白的治療性矯正體外用氛酸鉀處理患者的紅細胞，可防止在 去氧時形成鐮刀狀，輸氧能力有好轉.®白質兩性

21、解離性質和等電點'cOOH'coo'coo.凈電荷=0pH > pl凈電荷為負pH<pI凈電荷為正當?shù)鞍踪|溶液在某一定pH值時，使某特定蛋白質分子上所帶正負 電荷相等，成為兩性離子，在電場中既不向陽極也不向陰極移動，此 時溶液的pH值即為該蛋白質的等電點(isodtxtric point, pl) The thermal denaturationof ribonu clease變性是一 個協(xié)同過 程：在彳艮 窄的變性 劑濃度范 圍，很窄 PH或溫度.（2）、引起蛋白質變性的因素有： .物理因素熱（60100°C）、紫外線、X射線、超聲波、 高壓、表

22、面張力，以及劇烈的振蕩、研磨、攪拌 等； .化學因素化學因素又稱為變性劑，包括：酸、堿、有 機溶劑（如乙醇、丙酮等）、尿素、鹽酸肌、重 金屬鹽、三氯醋酸、苦味酸、磷鑄酸以及去污劑(3) 、變性表現(xiàn)及變性機理 生物功能喪失； 物理性質發(fā)生改變； 化學性質發(fā)生改變； .側鏈基團暴露、復性復性：蛋白質的變性作用如果不過于劇烈，則 是一種可逆過程，變性蛋白質通常在除去變性因素 后，可緩慢地重新自發(fā)折疊成原來的構象，恢復原 有的理化性質和生物活性，這種現(xiàn)象成為復性(renaturation)。如1條肽鏈、4個二硫鍵的RNA酶，被8mol/L尿 素和蔬基乙醇變性，二硫鍵全部斷裂，酶活性和結 晶能力全部喪失

23、，若透析除去變性劑，在氧存在下 二硫鍵重新生成，酶活性全部恢復，并恢復結晶能 力，說明RNASI由變性態(tài)恢復到天然態(tài)。4、蛋白質的膠體性質由于蛋白質分子量很大，在水溶液中形成1- lOOnm的顆粒，因而具有膠體溶液的特征?？扇苄?蛋白質分子表面分布著大量極性氨基酸殘基，對水 有很高的親和性，通過水合作用在蛋白質顆粒外面 形成一層，同時這些顆粒帶有 ，因而蛋白質溶液是相當穩(wěn)定的親水膠體。:利用蛋白質不能透過半透膜的的性質，將含有小 分子雜質的蛋白質溶液放入透析袋再置于流水中，小分 子雜質被透析出，大分子蛋白質留在袋中，以達到純化 蛋白質的目的。這種方法稱為透析(dialysis).5、蛋白質的沉

24、淀如果加入適當?shù)脑噭┦沟鞍踪|分子處于等電點狀態(tài)或失 去水化層(消除相同電荷，除去水膜)，蛋白質膠體溶液就 不再穩(wěn)定并將產生沉淀.沉淀方法：(1) :在蛋白質溶液中加入高濃度的硫酸鞍、氯化鈉等中性鹽，可有效地破壞蛋白質顆粒的水化 層.同時又中和了蛋白質表面的電荷，從而使蛋白 質顆粒聚而生成沉淀，這種現(xiàn)象稱為鹽析分段鹽析沉淀反應：不同蛋白質分子的水 膜厚度和帶電量不同，發(fā)生鹽析所需要的 鹽濃度不同.改變鹽濃度可分離蛋白質混 合物，這被稱為分段鹽析法.（2）.有機溶劑沉淀反應降低溶液的介電常數(shù)，使蛋白質發(fā)生沉淀。改變 有機溶劑的種類和濃度，可分離蛋白質混合物，這被 稱為有機溶劑分級法。（3）.重金屬

25、鹽沉淀反應在堿性溶液中，蛋白質分子的負離子基團（如 COO ）可以與重金屬鹽（如醋酸鉛、氯化高汞、硫 酸銅等）的正離子結合成難溶的蛋白質重金屬鹽，并 從溶液中沉淀下來.在臨床上，利用這種特性搶救重 金鹽審毒的病人和家畜。（4）.生物堿試劑沉淀反應生物堿試劑（如苦味酸、單寧酸、三氯醋酸、 藥酸等）在溶液pH小于蛋白質等電點時，其酸根負 離子能與蛋白質分子上的正離子基團相結合，變成 為溶解度很小的蛋白鹽，并從溶液中沉淀下來。臨 床化驗時，常用上述生物堿試劑除去血漿中干擾測 定的蛋白質。二、蛋白質分離純化方法（-）.利用溶解度差別的純化方法（1）.等電點沉淀和pH控制蛋白質是帶有正電荷和負電荷基團的

26、兩性電解質， 蛋白質分子的電荷性質和數(shù)量則因pH不同而變化。蛋 白質處于等電點時，其凈電荷為零，由于相鄰蛋白質 分子之間沒有靜電斥力而趨于聚集沉淀。因此在其他 條件相同時，它的溶解度達到最低點.在等電點以上或以下的pH時，蛋白質分子攜帶同 種符號的凈電荷而相互排斥，阻止了單個分子聚集成 沉淀、因此溶解度較大.（2）.蛋白質的鹽溶和鹽析鹽溶sailing in:在蛋白質水溶液中加少量中性鹽, 增加分子表面電荷，增強分子與水的作用，使蛋 白質在水溶液中的溶解度增大的現(xiàn)象.鹽析salting out:在高濃度的鹽中，離子將蛋白質水化 膜的水奪去，使蛋白質發(fā)生沉淀的現(xiàn)象.如飽和硫酸 鐵.中性鹽影響蛋白

27、質溶解度的能力是離子強度的函 數(shù)。離子強度（ionic strength ）可以定義為： 弓Ci為各離子的濃度，Zj為各離子的凈電荷，E表示求和。 未解離的電解質和攜帶電荷相等的兼性離子不計入電 荷的計算，它們不增強溶液的離子強度。（3）.有機溶劑分級分離法有機溶劑引起蛋白質沉淀的主要原因是改變了介 質的介電常數(shù)（dielectric constant）。水是高介電常 數(shù)物質（20°C時，80）,有機溶劑是低介電常數(shù)物質 （20°C時，甲醇33,乙醇24,丙酮21.4）,因此有機 溶劑的加人使水溶液的介電常數(shù)降低。（4）.溫度對蛋白質溶解度的影響在040°C之間，

28、大部分球狀蛋白質的溶解度隨溫 度升高而增加，但人的血紅蛋白從025°C,溶解度隨 溫度上升而降低.在4（）50°C以上，大部分蛋白質變 得不穩(wěn)定并開始變性，在中性pH介質中失去溶解力. 大多數(shù)蛋白質在低溫下比較穩(wěn)定，因此蛋白質的分級 分離操作一般都在0°C或更低的溫度下進行。（二）、根據(jù)分子大小不同的純化方法仃）.透析和超過濾dialysis and ultrafiltration透析：利用蛋白質分子不能通過半透膜，使 蛋白質和其他小分子物質分開的方法。半透膜：玻璃紙（cellophane paper,或稱賽 璐坊紙）、火棉紙（celloidin paper,又稱

29、賽璐碇 紙）和其他改型的纖維素材料.超過濾：透析時對半透膜加壓，一般液體與膜表面相切的方向流動，使部分液體透過膜，另一部分液體切向流過膜表面，將膜哉留的蛋白質分子沖走（反流回樣品槽），避免在濾膜表面堆積塞。樣品含量低時因吸附不能回收而采用此法.妥白質的越濤(2).密度梯度(區(qū)帶)離心density gradient (zone) centrifugation蛋白質顆粒在有密度梯度的介質中離心時，質量 和密度大的顆粒沉降快，到與自身密度相等的介質密 度梯度即停止，最后各種蛋白質在離心管(常用塑料 管)中被分離成各自獨立的區(qū)帶，在管底小孔分部收 集。常用蔗糖梯度，聚蔗糖梯度和其他合成材料。蔗糖便宜

30、，純度高，濃溶液(60%, W/W)密度 可達 1.28g/cm3.聚蔗糖的商品名是Ficoll,由蔗糖和I氯2,3環(huán)氧 丙烷合成的高聚物，約400.000,需高密度和低滲 透壓的梯度時，可用Ficoll代替蔗糖。(3).凝膠過濾gel filtration又稱凝膠過濾層析、分子排阻(molecular- exclusion )層析、凝膠滲透(gel permeation )層析。 這是按大小分離蛋白質混合物的最有效方法之一.常用的凝膠有交聯(lián)葡聚糖，聚丙烯酰胺凝膠和 瓊脂糖等。交聯(lián)葡聚糖是由線形的al,6葡聚糖與 氯2.3環(huán)氧丙烷反應而成的化合物，商品名稱為 Sephadex»聚丙烯

31、酰胺凝膠(商品名稱為Bio-gel P ) 是一種人工合成的凝膠，它是由單體丙烯酰胺 (acrylamide )和交聯(lián)劑甲文雙丙烯酰胺(N,N， methylenebisacrylamide )共聚而成的。瓊脂糖是從 瓊脂中分離制得的，商品名稱微Sepharose或Bio GelA,這種凝膠的優(yōu)點是孔徑大，排阻極限高。O O OO CO %溶劑流動方向小分子進入凝 膠分子內，被 滯留大分子在凝 膠顆粒間移 動，較快流 出按分子量從大到小依次流出aoe q poo cB凝膠過濾層析原理（三）、根據(jù)電荷不同的純化方法（1）.電泳 electrophoresis電泳或離子泳ionphoresis:在

32、電場作用下、帶電顆粒向與其電性相反的電極移動的現(xiàn)象.（2）.離子交換層析用于各種兩性分子混合物的分離，蛋白質和核 酸大分子層析的支持介質一般是纖維素離子交換劑 和交聯(lián)葡聚糖離子交換劑。陽離子交換劑：CM纖維素（弱酸型）；P纖 維素（中強酸型）；SE纖維素（強酸型）；SP- Sephadex （強酸型）；陰離子交換劑：AE纖維素（弱堿型）；PAB- 纖維素（弱堿型）；DEAE-纖維素（中強戚型）； DEAE- Sephadex （中強戚型）；TEAE-纖維素（強 堿型）;QAE- Sephadex （強堿型）；(四) 、利用對配體的特異生物學親和力的純化方法 親和層析affinity chrom

33、atography:利用蛋白質對其 配體分子特有的識別能力，即生物學親和力建立起來 的券請宛彳匕為法。最先用于酶的純化，現(xiàn)廣泛用于核昔酸.核酸、 免疫球蛋白、膜受體、細胞器甚至完整的細胞的純化.凝集素親和層析、免疫親和層析、金屬螯合層析(metal chelate chromatography )、染料配體層析和共 價層析等都屬于親合層析類抗體和抗原的結合：高度特異性把抗體作為“魚餌”，分離抗原,ai9 AiQen-coTibrrig stle親和層析的操作機理三、蛋白質分子中氨基酸序列的測定 測定宙白質的分f質吊和幺肚創(chuàng) 拆丿1蛋門頃分/的鄉(xiāng)h , 斷幵多肽鏈內的1硫鍵 分析毎條篇肽鏈的紅堆酸細成 器總務肽璉的N末端和C術端殘咗 虬I以I 一