三種土壤微生物總DNA提取方法的比較

1、基因組學與應用生物學，2009年，第28卷，第2期，第331-334頁GenomicsandAppliedBiology,2009,Vol.28,No.2,331-334實驗技術與方法TechniquesandMethodology三種土壤微生物總DNA提取方法的比較王麗娜1,2許修宏1宛煜嵩2金蕪軍2*1東北農業(yè)大學生命科學學院,哈爾濱,150030;2中國農業(yè)科學院生物技術研究所,北京,100081*通訊作者,jinwujun1218摘要本文對3種常用的土壤微生物總DNA提取方法Martin法、高鹽改進法及試劑盒法進行了比較，并通純度及16SrDNAV3可變區(qū)的PCR擴增結合DGGE法(d

2、enaturinggradientgelelectrophoresis)，過DNA得率、分別對3種方法進行評價。結果表明，3種方法提取的DNA均能滿足土壤微生物多樣性分析的要求。其中試但DNA得率較低且成本昂貴。Martin法和高鹽改進法用時較劑盒方法操作簡單，提取的DNA質量較高，長，DNA得率較高，純度較低，但對后續(xù)PCR擴增和DGGE分析沒有明顯影響，且成本低廉。關鍵詞土壤微生物,DNA提取,DGGEComparisonofthreeExtractionMethodsofSoilMicrobialDNAWangLina1,2XuXiuhong1WanYusong2JinWujun2*1L

3、ifeSciencesInstitute,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin,150030;2BiotechnologyResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSci-ences,Beijing,100081*Correspondingauthor,jinwujun1218DOI：10.3969/gab.028.000331AbstractThreecommonlyusedmethodsforsoilmicrobialDNAextractionincludingMartinmethod,improve

4、dhigh-saltconcentrationmethodandthekitmethodwereassessedinthispaper.TheevaluationwasbasedontheyieldandpurityofextractedtotalDNA,theamplificationof16SrDNAV3variableregionandthesubsequentanalysisofamplifiedproductsbyDGGE(denaturinggradientgelelectrophoresis).TheresultsshowedthateachofthreemethodsofDNA

5、extractioncouldmeettherequirementsofanalysisofsoilmicrobialdiversity.Thekitmethodissimple,thequalityofextractedDNAishigher,buttheyieldofDNAislowerandthecostismoreex-pensive.Martinmethodandimprovedhigh-saltconcentrationmethodbothgothigheryieldsofDNAwithlowercostthanthekitmethodbutspentlongertime.Thep

6、urityofDNAwerelowerthanoneextractedbythekitmethod,butitwouldnotaffectthefollowingPCRandDGGEanalysissignificantly.KeywordsSoilmicroorganisms,DNAextraction,DGGE土壤微生物是陸地生態(tài)系統(tǒng)中重要的生命體，過提取土壤中微生物總DNA，并對特定DNA序列對所生存的微壞境十分敏感，是常用的土壤生態(tài)系統(tǒng)變化的預警及敏感指標。近些年發(fā)展起來的分子生物學技術如PCR-DGGE、ARDRA、RFLP等運用到土壤微生物生態(tài)學的研究，可避開傳統(tǒng)的微生物分離培養(yǎng)過

7、程，直接探討土壤中微生物的多樣性變化及其與環(huán)境的關系，克服因土壤微生物可培養(yǎng)性的差異引起的分析偏差。這些分子生物學方法主要通/doi/10.3969/gab.028.000331基金項目：本研究由農業(yè)部948課題(2007-Z8)資助通過分析擴增產物的多如16SrDNA基因進行擴增，樣性來推斷微生物群落的多樣性。由于土壤中腐殖酸、重金屬離子等物質的存在，往往會造成提取的DNA數量和質量不能滿足要求，影響后續(xù)的PCR擴增、分子雜交等而導致多樣性分析失敗。本實驗對3種直接提取土壤微生物總DNA的方法進行了比較，旨在為相關的研究提供一些參考。332基因組學與應

8、用生物學GenomicsandAppliedBiology1材料與方法1.1材料試驗土壤取自中國農業(yè)科學院試驗田內的棕壤土。土壤充分混勻后裝入花盆中，種植水稻，在水稻出穗期抖落其根際土壤作為實驗材料。16SrDNAV3可變區(qū)細菌特異性引物為對大多數細菌與古細菌16SrDNAV3區(qū)具有特異性的通用引物(Muyzeretal.,1993)：正向引物：357(5-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3)；反向引物：518(5-ATTACCGCGGCTGCTGG-3)。其中F357中下劃線部分為“GC夾板”結構。引物由上海

9、生物技術服務有限公司合成，引物擴增產物片段長度約為230bp。1.2試劑盒法提取土壤DNA采用美國Mobile公司的UltraCleansoilDNAisolationKit。每次提取的土壤樣品量為0.3g。1.3Martin法提取土壤DNA按照Martin-Laurent等(2001)報道的方法進行適當改進。取0.5g土樣加入一離心管，加入1g酸洗石英砂(直徑0.51mm)，再加入3mLDNA提取液(100mmol/LTris,100mmol/LEDTA,100mmol/LNaCl,1%pvp,2%SDS,pH8.0)，渦旋混勻后，在搖床上250r/min振蕩2h。412000伊g離心10m

10、in。取上清，加入等體積苯酚:氯仿:異戊醇混勻。412000伊g離心10min，取上清。加入等體積氯仿:異戊醇抽提1次。412000伊g離心10min。水相中加入1/10體積3mol/L乙酸鈉和1體積冰預冷的異丙醇，4沉淀DNA1h。12000伊g離心10min收集DNA沉淀，用100滋LddH2O溶解，得到DNA粗提液。DNA粗提液用ddH2O稀釋100倍用于PCR擴增。1.4高鹽改進法提取土壤DNA按照張瑞福等(2003)報道的方法進行適當改進。稱取1g土壤樣品，加入3mLDNA提取液(100mmol/LTris-HCl,100mmol/LEDTA,100mmol/LNa3PO4,1.5m

11、ol/LNaCl,1%CTAB,pH8.0)混勻，再加入20滋L蛋白酶K(10mg/mL)，37溫浴30min，中間混勻數次。加入0.3mL20%SDS，65水浴2h，每隔1520min顛倒混勻一次。-70冷凍，然后65溶化，反復3次，每次10min。室溫12000伊g離心10min，收集上清于一新10mL離心管。沉淀再加入1mLDNA提取液和0.1mL20%SDS，旋渦10s，65水浴10min，室溫12000伊g離心10min，合并上清液。重復上一步DOI：10.3969/gab.028.000331驟合并上清液。加入等體積氯仿:異戊醇(24:1,v

12、/v)混勻。12000伊g離心10min，上清轉移至一新10mL離心管，加入0.6v/v異丙醇，室溫沉淀1h。12000伊g離心20min，去上清。加入70%預冷乙醇洗滌，沉淀用100滋L無菌去離子水重懸，得到DNA粗提液。DNA粗提液用ddH2O稀釋100倍后用于PCR擴增。1.5DNA濃度與純度檢測用紫外分光光度計測定3種提取方法所得的粗提產物在230nm、260nm、280nm的光密度值。通過計算OD260/OD280(DNA/蛋白質)來測定所提DNA的純度。230nm處光密度值指示DNA溶液中腐殖酸的含量。1.616SrDNAV3可變區(qū)的擴增PCR擴增體系：5伊buffer5滋L，dN

13、TP(10mmol/L)0.5滋L，上下游引物各0.5滋L(10滋mol/L)，TaqDNA聚合酶0.125滋L(5U/滋LPromega)，分別用1滋L試劑盒法的粗提液、Martin法稀釋100倍的粗提液與高鹽改進法稀釋100倍的粗提液為模板，補ddH2O至25滋L。擴增程序為：94預變性5min；9430s，5530s，共30個循環(huán)；72延伸5min。以上述PCR產物為模板，經ReconditioningPCR去除PCR產物中的異源雙鏈(Thompsonetal.,2002;VonWintzingerodeetal.,1997)。反應體系為：5伊buffer5滋L，dNTP(10mmol/

14、L)0.5滋L，上下游引物各0.5滋L(10滋mol/L)，TaqDNA聚合酶0.125滋L(5U/滋LPromega)，模板1滋L，補ddH2O至25滋L。反應程序為：94變性5min；941min，551min和721min，5個循環(huán)；72延伸10min。擴增產物用1.2%的瓊脂糖膠電泳檢測。1.7變性梯度凝膠電泳ReconditioningPCR產物通過DGGE(儀器為DcodeTMSystem(Bio-RadLaboratories)進行分離，聚丙烯酰胺膠濃度8%，凝膠變性梯度為40%65%，60，180V，1伊TAE緩沖液，電泳時間5h，DGGE膠銀染。銀染方法參考Sangulnet

15、ti等(1994)并略作改進簡化如下：10%酒精+0.5%乙酸+0.2%AgNO3中染色5min，清水漂洗2min后在3%NaOH+0.5%甲醛中顯色510min。2結果分析2.1提取的總DNA產量與純度比較3種方法提取的DNA片段長度差異不大，完整性較好，均在20kb左右，其中試劑盒法提取的DNA條三種土壤微生物總DNA提取方法的比較ComparisonofthreeExtractionMethodsofSoilMicrobialDNA333帶較單一，Martin法及高鹽改進法提取的DNA中有些許雜質(圖1)。3種方法中，Martin法獲得的DNA產量最高，其次為高鹽改進法，試劑盒法產量最低

16、(表1)。3種提取方法中純度最高的為試劑盒法，Martin法與高鹽改進法兩種方法提取的DNA蛋白質污染DNA含量與腐殖程度都較為嚴重。在粗提產物中，酸含量成正比，腐殖酸含量與提取物黑褐顏色的程度呈正比關系，黑褐色越深，腐殖酸污染也越嚴重。圖2以土壤DNA為模板擴增的16SrDNA瓊脂糖凝膠電泳注:M:DL2000plusmarkerFigure2Agarosegelelectrophoresisof16SrDNAamplified3種方法中，Martin法的粗提產物為黑褐色，高鹽改進法為棕褐色，試劑盒法顏色透明；230nm處光密度值Martin法為9.5，高鹽改進法為8.84，試劑盒法為0.4

17、3(表1)。用Martin法提取DNA時，雖然DNA得率高，但同時腐殖酸污染也最嚴重，試劑盒法DNA得率低，對應地其DNA提取液中腐殖酸含量也相對較少。2.2PCR擴增檢測分別以試劑盒法粗提液，Martin法與高鹽改進法稀釋100倍后的提取液為模板進行細菌16SrDNAV3可變區(qū)的PCR擴增檢測。結果表明，本實驗所采用的3種方法提取的DNA都不需要進一步純化即可用于后續(xù)PCR分析(圖2)。圖13種土壤DNA提取方法注:M:姿-Hind芋DNAdigestMarker;13:試劑盒法提取的DNA;46:Martin法提取的DNA;79:高鹽改進法提取的DNA;以下同Figure1SoilDNAe

18、xtractedfromthreedifferentmethodsofex-tractionNote:M:姿-Hind芋DNAdigestMarker;13:DNAextractedbyKitmethod;46:DNAextractedbyMartinmethod;79:DNAextractedbyimprovedhigh-saltconcentrationmethod;Thesameasbelow表13種不同提取方法的土壤DNA產量與純度Table1TheyieldandpurityofsoilDNAextractedfromthreedifferentmethodsofextraction

19、方法OD230OD260OD280OD260/OD280YMethodA0.43依0.070.22依0.020.12依0.011.76依0.043.62依0.37B9.5依0.217.76依0.055.84依0.101.33依0.013129.22依0.67C8.84依0.216.51依0.314.94依0.241.32依0.02108.57依5.18注:A:試劑盒法;B:Martin法;C:高鹽改進法;Y:DNA產率(滋g/g)Note:A:Kitmethod;B:Martinmethod;C:Improvedhigh-saltconcentrationmethod;Y:SoilDNAyie

20、d(滋g/g)fromsoilDNANote:M:DL2000plusmarker2.3PCR擴增產物的DGGE分析3種方法提取DNA進行PCR擴增，擴增產物的DGGE電泳分析結果如圖3。圖中不同擴增條帶及數目代表土壤微生物種類的多樣性。由圖3可以看出，3種方法提取DNA的PCR擴增及DGGE分析結果均具有較好的重復性，且3種方法提取DNA擴增的16SrDNAV3可變區(qū)的條帶位置與數目基本相同。唯一差別在于，試劑盒方法中a、b位置為兩條條帶，代表兩種微生物種類，而在Martin法和高鹽改進法中的同一位置卻只有一條單一的較粗深色條帶c。由以上分析我們得出的結論是，3種方法均能達到土壤微生物多樣性

21、PCR-DGGE分析的要求。其中，試劑盒提取方法的DGGE條帶更為均勻，能更好地代表土壤微生物多樣性。與試劑盒法相比，Martin法和高鹽改進法由于純化不夠完全，DNA提取液中的雜質等可能影響PCR擴增反應，造成DGGE分析中PCR擴增產物條帶數目的微小變化，從而可能會給土壤微生物多樣性分析帶來偏差，這也是應用DGGE分析微生物多樣性時常見的一種偏差(Maarit-Niemietal.,2001)，理想的解決方案是，DGGE結合目的條帶回收、測序以保證土壤微生物多樣性分析的可靠性。3討論圖3三種不同提取方法的DGGE電泳圖注:a,b:試劑盒法;c:Martin法和高鹽改進法Figure3DGG

22、EgelelectrophoresisofsoilDNAextractedfromthreedifferentmethodsofextractionNote:a,b:Kitmethod;c:MartinmethodandImprovedhigh-salt334基因組學與應用生物學GenomicsandAppliedBiology從土壤或沉積物中提取DNA的方法可以分為兩類(Leffetal.,1995)：一類是直接提取法，主要在土壤中直接裂解微生物體并提取DNA(TsaiandOlson,1991)；另一類是間接提取法，即先將微生物菌體與土壤顆粒分開，再提取DNA(JacobsenandRas

23、mussen,1992)。通常第一類方法提取效率比較高，其DNA提取物中理論上包含了所有土壤微生物DNA，但在實際操作中，由于DNA提取物中含有大量雜質如腐殖酸等，可能抑制DNA聚合酶活性，影響PCR擴增效率，引起微生物多樣性分析偏差。一般情況下，土壤微生物DNA的粗提液因含有大量的抑制物質如腐殖酸，所以都應該經過純化以后才能進行PCR擴增，但這些純化方法往往造成核酸的大量損失(Lloyd-JonesandHunter,2001)。本實驗中，試劑盒方法在提取過程中含有去除腐殖酸的步驟，因此可以直接進行PCR。而Martin法與高鹽改進法都含有大量的腐殖酸，考慮純化后DNA損失會影響多樣性分析的

24、問題，因此在本實驗中，采用直接稀釋的方法，進行PCR擴增后表明能夠達到理想的結果。這可能是因為在進行PCR擴增時，DNA的量少至pg(皮克)級就可以進行擴增，而適當稀釋可以使腐植酸等抑制物的濃度降低，減少其抑制作用。1993年，Muzyer等首次將DGGE技術應用于分子微生物學研究領域，最近10年DGGE已廣泛應用于各種環(huán)境微生態(tài)的研究中，在多樣性分析中表現了越來越大的優(yōu)越性。本實驗中用DGGE方法檢驗了3種DNA的提取方法對后續(xù)生物多樣性分析的影響，結果表明3種方法均能應用于微生物多樣性的PCR-DGGE分析。其中試劑盒方法的DGGE條帶相比更加均勻，更加便于進行多樣性分析。對于土壤微生物總

25、DNA提取方法的評價，根據不同的目標有不同的指標。從土壤中提取微生物總DNA，不僅要保證DNA片段足夠大，數量多，雜質少，而且過程是否簡單、省時也是不可忽視的。本實驗的3種方法相比較而言，試劑盒法用時最少，大約只需要4050min，Martin法與高鹽改進法步驟較多，用時較長，Martin法一般用時45h，高鹽改進法需要反復凍融、溶菌酶及SDS溶液多步裂解細胞等步驟，操作程序更為復雜。在試劑成本方面，試劑盒法相對昂貴，每反應大約人民幣5060元；與之相比，Martin法與高鹽改進法則低的多，據本實驗室估算，Martin法每個反應成本為人民幣1015元，高鹽改進法為人民幣1520元?？傮w說來，試

26、劑盒方法操作簡單、省時，提取的DNA質量較高，但成本昂貴。Martin法與高鹽改進法DOI：10.3969/gab.028.000331用時較長，但成本低廉。而對于初學者來說，Martin法與高鹽改進法操作程序復雜，重復性較差，需反復學習、實驗，技術熟練后方可提取出符合微生物多樣性分析需要的土壤微生物總DNA樣品。參考文獻JacobsenC.S.,andRasmussenO.F.,1992,Developmentandap-plicationofanewmethodtoextractbacterialDNAfromsoilbasedonseparatio

27、nofbacteriafromsoilwithcation-ex-changeresin,Appl.Environ.Microbiol.,58(8):2458-2462LeffL.G.,DanaJ.R.,McArthurJ.V.,andShimketsL.J.,1995,ComparisonofmethodsofDNAextractionfromstreamsed-iments,Appl.Environ.Microbiol.,61(3):1141-11431Lloyd-JonesG.,andHunterD.W.F.,2001,ComparisonofrapidDNAextractionmeth

28、odsappliedtocontrastingNewZealandsoils,SoilBiology&Biochemistry,33:2053-2059Maarit-NiemiR.,HeiskanenI.,WalleniusK.,andLindstr觟mK.,2001,ExtractionandpurificationofDNAinrhizospheresoilsamplesforPCR-DGGEanalysisofbacterialconsortia,J.Microbiol.Methods,45(3):155-165Martin-LaurentF.,PhilippotL.,HalletS.,

29、ChaussodR.,GermonJ.C.,SoulasG.,andCatrouxG.,2001,DNAextractionfromsoils:oldbiasfornewmicrobialdiversityanalysismethods,Appl.Environ.Microbiol.,67(5):2354-2359MuyzerG.,EllenC.W.,andAndreG.U.,1993,Profilingofcom-plexmicrobialpopulationsbydenaturinggradientgelelec-trophoresisanalysisofpolymerasechainre

30、actiongenescod-ingfor16SrRNA,Appl.Environ.Microbiol.,59:695-700SanguinettiC.J.,DiasNetoE.,andSimpsonA.J.,1994,RapidsilverstainingandrecoveryofPCRproductsseparatedonpolyacrylamidegels,Biotechniques,17(5):914-21ThompsonJ.R.,MarcelinoL.A.,andPolzM.F.,2002,Heterodu-plexesinmixed-templateamplifications:f

31、ormation,conse-quenceandeliminationbyreconditioningPCR,NucleicAcidsRes.,30(9):2083-2088TsaiY.L.,andOlsonB.H.,1991,RapidmethodforseparationofbacterialDNAfromhumicsubstancesinsedimentsforpoly-merasechainreaction,Appl.Environ.Microbiol.,58(7):2292-2295VonWintzingerodeF.,G觟belU.B.,andStackebrandtE.,1997

32、,Determinationofmicrobialdiversityinenvironmentalsam-ples:pitfallsofPCR-basedrRNAanalysis,FEMSMicrobiol.Rev.,21(3):213-229ZhangR.F.,CaoH.,CuiZ.L.,LiS.P.,andFanB.,2003,Extrac-tionandpurificationofsoilmicrobialtotalDNA,WeishengwuXuebao(ActaMicrobiologicaSinica),43(2):276-282(張瑞福,曹慧,崔中利,李順鵬,樊奔,2003,土壤微

33、生物總DNA的提取和純化,微生物學報,43(2):276-282)基因組學與應用生物學，2009年，第28卷，第2期，第335-338頁GenomicsandAppliedBiology,2009,Vol.28,No.2,335-338實驗技術與方法TechniquesandMethodology螺旋藻的分離篩選及培養(yǎng)條件的選擇宋玉鳳馬光庭*韓宇廣西大學生命科學與技術學院,南寧,530005*通訊作者,mgt7828摘要采用選擇性Zarrouk無機培養(yǎng)基從北海螺旋藻養(yǎng)殖場水樣中富集和稀釋平板分離出9株螺旋藻，經對通過對其形態(tài)學觀察、培養(yǎng)基優(yōu)其生長測定，從中篩選出一株生長較快、藻體粗壯的螺旋藻藻

34、種(暫定名SP06)，徑寬3070滋m，化和最佳生長條件的選擇試驗，結果表明：該藻螺旋狀，細胞為短圓柱形，藻體長50600滋m，螺旋數310，在配方為NaHCO316.8g/L、KH2PO40.4g/L、NaNO32.7g/L、NaCl1.0g/L、FeSO40.005g/L、MgSO40.1g/L、K2SO41.0g/L、CaCl20.04g/L液體培養(yǎng)基中，在起始pH810，光照強度4000Lx，30/25光/暗變溫條件下生長良好，培養(yǎng)8d每升養(yǎng)殖水可收獲濕藻4648g。關鍵詞螺旋藻,分離,培養(yǎng)基優(yōu)化,環(huán)境條件選擇IsolationandScreeningoftheCultureCondi

35、tionofSpirulinaSongYufengMaGuangting*HanYuCollegeofLifeScienceandTechnology,GuangxiUniversity,Nanning,530005*Correspondingauthor,mgt7828DOI：10.3969/gab.028.000335AbstractInthispaper,SpirulinasamplesfromBeihaiwereenrichedbyusingZarroukinorganicculturemediumandninestrainswereisolatedbydilutionplates.O

36、nestrain(namedSP06)withrapidgrowthspeedwasobtainedbytestingtheirgrowthconditions.Bymorphologicalobservation,growingfactorstestandculturesoptimization.itisfoundthatthealgaishelical,cylindricalcell,thelengthofthealgaeis50600滋mandthediameterofthealgaeis3070滋m,helixicalnumberis310.Itgrowswellinfluidcult

37、uremediumwhichingredientsareNaHCO316.8g/L,KH2PO40.4g/L,NaNO32.7g/L,NaCl1.0g/L,FeSO40.005g/L,MgSO40.1g/L,K2SO41.0g/L,CaCl20.04g/L;lightin-tensityis4000Lx;thetemperatureis30/25(light/dark).Aftereightdays,wewillget4648gwetalgaeperliter.KeywordsSpirulina,Separation,Optimizationofthemedium,Choiceofenviro

38、nmentalcondition螺旋藻(Spirulina)是一種古老的微藻類生物，據報道在地球已有35億年的生長歷史，因其體形在顯微鏡下呈螺旋狀而得名，屬于藍藻門、顫藻目、顫藻科、螺旋藻屬；其含有豐富的蛋白質，氨基酸、維生素、生物活性元素等營養(yǎng)物質，對提高人體免疫力，抗衰老、抗腫瘤、抗輻射，防治多種疾病有顯著輔助作用，1981年聯合國糧農組織推薦它為人類未來最理想的光合效食品(陳金娥,2007)。另外螺旋藻生長繁殖快，率是一般農作物的23倍，生產周期短，一般810d，養(yǎng)殖成本低，效益好，引發(fā)國內外在近年來大面積養(yǎng)殖。但在生產中仍存在如藻種退化和混雜，生長慢，加工程度低，產后廢水難以處理等問題

39、，為了解決這些/doi/10.3969/gab.028.000335基金項目：本研究由廣西自然科學基金項目(桂科自0339006)資助問題，近年來對養(yǎng)殖螺旋藻的工藝技術、廢水處理、螺旋藻加工和保健作用等亦有報道，尤其對螺旋藻的藥理保健作用研究較多，但對其選種和生理研究較少。本研究緊密結合螺旋藻的生產實際需要，試圖分離篩選出生長快、產量高、抗逆性和適應性強、藻體粗壯的螺旋藻藻種，并對其培養(yǎng)條件進行優(yōu)化選擇，以為螺旋藻的規(guī)模養(yǎng)殖提供優(yōu)質藻種和養(yǎng)殖技術參數。1材料和方法1.1藻種來源從廣西北海生巴達螺旋藻養(yǎng)殖水樣分離篩選。336基因組學與應用生物學Genomi

40、csandAppliedBiology1.2培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件富集和分離培養(yǎng)基：采用Zarrouk液體和固體培養(yǎng)基配方配制(李全順和賈慶舒,2006)養(yǎng)殖試驗培養(yǎng)基：以上培養(yǎng)基在Zarrouk藻類培養(yǎng)基配方的基礎上根據試驗需要設計進行優(yōu)化試驗，改良配制，121滅菌15min后備用。除條件試驗外，試驗均采用起始pH9.0，30/25變溫，4000Lx光照12h，接藻種量10%(V/V)，以第78天的培養(yǎng)液OD560來表示藻體生長量，以生長量作為試驗的考核指標。1.3螺旋藻的分離篩選取螺旋藻養(yǎng)殖水富集培養(yǎng)液在分離培養(yǎng)基作稀釋平板涂布分離，光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)810d，形成單個藻的群落后取其轉接于試管中培養(yǎng)

41、，作為螺旋藻分離株，然后將分離株分別接種于三角瓶螺旋藻培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)8d后測定其OD值，根據OD560值的高低從中篩選出生長較快的藻株作為藻種篩選株。1.4篩選株培養(yǎng)基的優(yōu)化在Zarrouk培養(yǎng)基配方的基礎上，選用L9(43)正交試驗表(表1)對NaHCO3、KH2PO4、NaNO3、NaCl，即C、N、P、K、Na等營養(yǎng)元素添加量對螺旋藻生長的影響進行正交試驗，根據試驗結果選出其最佳加量，優(yōu)化培養(yǎng)基的配方。1.5篩選株最適生長條件的選擇采用以上試驗優(yōu)化的Zarrouk螺旋藻培養(yǎng)基配方，對螺藻篩選株生長的起始pH值、溫度、光照強度和接藻種量進行最適環(huán)境條件的選擇，另外還試驗了紫外照射對篩選

42、株生長的影響。1.6在所選最佳條件下篩選株生長的測定采用優(yōu)化培養(yǎng)基和在所選最佳條件下對篩選株作培養(yǎng)試驗；在生長過程中定期取培養(yǎng)液測篩選株藻體的生長變化，采用1伊104r/min30min離心稱量濕藻重量測定其生長量；并作出其生長曲線，了解生長規(guī)律。表1正交試驗表L9(43)因素及水平Table1FactorsandlevelsoforthogonaltableL9(43)水平因素LevelsFactorsNaHCO3(g/L)NaNO3(g/L)KH2PO4(g/L)NaCl(g/L)0.81.031.2www.genoapplb

43、DOI：10.3969/gab.028.0003352結果與分析2.1螺旋藻的分離篩選從北海螺旋藻養(yǎng)殖場水中分離出9株藻種，分別編號為SP01、SP02、SP09，經對其養(yǎng)殖試驗，結果表明：其中分離株SP06培養(yǎng)液深綠色，藻體密度高，OD值較高，生長比其它株好(表2)，故選其為篩選藻株。2.2篩選株的形態(tài)特征經對篩選株SP06顯微觀察和群落特征觀察表明：其由短圓柱形細胞組成，螺旋狀，兩端鈍圓，藻體長50600滋m、徑寬3070滋m，螺旋數為310個，表面不具膠鞘，不易被微生物附著，細胞內有氣泡，上浮性好(圖1A)。其在固體培養(yǎng)基上生長形成不規(guī)則點狀，深綠色，邊緣絲狀不規(guī)則的群落(

44、圖1B)。根據表3可以判斷，NaNO3對螺旋藻生長的影響最大，NaHCO3其次，NaCl第三，KH2PO4最小。其最佳添加量為(g/L)：NaHCO316.8，KH2PO40.4，NaNO32.7，NaCl1.0。NaNO3在這里作為氮源，主要用來合成細胞內的含氮物質，而螺旋藻蛋白質含量較高，單位蛋白質產量比大豆高出25倍(周希華,2006,中國食品與營養(yǎng),(8):23-25)，可見其對氮素營養(yǎng)的需求量是較大的；而碳源也是微生物生長不可或缺的，螺表2螺旋藻藻種的篩選Table2SelectionofspirulinastrainsABCDOD560SP01淺綠色密度低懸浮0.664Shallo

45、wgreenLowdesitySuspendSP02綠色密度高懸浮1.026GreenHighdesitySuspendSP03綠色密度高懸浮1.373GreenHighdesitySuspendSP04淺綠色密度低絮狀0.841ShallowgreenLowdesityAgglomeratioSP05淺綠色密度低懸浮0.502ShallowgreenLowdesityaSuspendSP06深綠色密度高懸浮2.152DeepgreenHighdesitySuspendSP07綠色密度高懸浮1.587GreenHighdesitySuspendSP08淺綠色密度低絮狀0.824Shallowg

46、reenLowdesityAgglomerationSP09淺綠色密度低絮狀0.796ShallowgreenLowdesityAgglomeratio注:A:藻體編號;B:培養(yǎng)液顏色;C:顯微觀察藻體生長密度;D:培養(yǎng)液中藻體生長狀態(tài)Note:A:Serialnumberofspirulina;B:Colorofhydroponiccul-ture;C:Growthdensityofspirulinabymicroscopeobservation;D:Growthstateofspirulinainhydroponicculture螺旋藻的分離篩選及培養(yǎng)條件的選擇IsolationandSc

47、reeningoftheCultureConditionofSpirulina337圖1螺旋藻分離篩選株SP06的形態(tài)觀察注:A:光學顯微鏡(伊400)下細胞;B:群落形態(tài)Figure1MorphologicalobservationofisolateSP06Note:A:Morphologybyopticalmicroscop(伊400);B:Populationmorphology表3正交試驗L9(43)結果與分析Table3ResultsandanalysisoforthogonalexperimentL9(43)試驗編號及項目因素OD560ExperimentFactorsnumber

48、anditemNaHCO3NaNO3KH2PO4NaCl11(14.8)1(2.3)1(0.4)1(0.8)1.06021(14.8)2(2.5)2(0.5)2(1.0)0.97131(14.8)3(2.7)3(0.6)3(1.2)1.27642(16.8)1(2.3)2(0.5)3(1.2)1.04152(16.8)2(2.5)3(0.6)1(0.8)0.50262(16.8)3(2.7)1(0.4)2(1.0)2.30173(18.8)1(2.3)3(0.6)2(1.0)0.64083(18.8)2(2.5)1(0.4)3(1.2)0.17893(18.8)3(2.7)2(0.5)1(0.

49、8)0.796K1/31.1020.9141.1800.786K2/31.2810.5500.9361.304K3/30.5381.4580.8060.832極差0.7430.9080.3740.518Range旋藻在生長過程中除吸收空氣中的CO2還需要利用培養(yǎng)基碳酸鹽中的CO2，NaHCO3不僅可作為碳源，也可調節(jié)培養(yǎng)基pH；K、Na對于維持細胞滲透壓和細胞質離子平衡有重要作用，磷是核酸、核蛋白、磷脂、輔酶及ATP等高能分子的成分，這些物質過量就會加大滲透壓不利于生長，不足量則不能滿足藻體生長需要。2.4起始pH值對螺旋藻SP06生長的影響由圖2顯示，篩選株螺旋藻SP06生長的最適起始pH值

50、為810，pH7.0和pH11.0培養(yǎng)液中其生長量下降，但普遍認為在偏堿性環(huán)境不僅有利于螺旋藻生長，同時在生產中對抑制其它雜藻的生長有很大作用(楊學文等,2006)。2.5溫度對螺旋藻SP06生長的影響試驗表明：篩選株SP06在30/25條件下生長比較好；溫度升高或降低，其生長量都有所下降(圖2)，圖2不同條件對SP06生長的影響注:光暗周期:12h/12h;A:20/15(光/暗);B:25/20(光/暗);C:30/25(光/暗);D:35/30(光/暗)Figure2EffectofconditiononthegrowthoftheisolateSP06Note:Lightcycle:1

51、2h/12h;A:20/15(light/dark);B:25/20(light/dark);C:30/25(light/dark);D:35/30(light/dark)所以選擇晝/夜溫度30/25為最適培養(yǎng)溫度。據研究：通過對3種螺旋藻生長最適溫度的比較研究得出了溫度對螺旋藻生長的影響為單峰曲線，溫度過高或過低均會導致螺旋藻生長速率急劇降低(楊學文等,2006)，這與本研究的結果基本相同?？赡軠囟冗^高或過低都會影響酶活性，從而影響暗反應和光合作用以及細胞物質的累積，使螺旋藻生長變慢。2.6光照強度對篩選株螺旋藻SP06生長的影響試驗結果表明：篩選株螺旋藻SP06在無光照時338基因組學與應

52、用生物學GenomicsandAppliedBDOI：10.3969/gab.028.000335生長很差，在光照4000Lx比3000Lx生長好(圖2)，保健價值，是未來人類理想的食品源，因此對其高試驗進一步驗證螺旋藻是一種綠色光合自養(yǎng)生物，生長過程中進行光合作用合成細胞物質需要大量的光能，光照不僅能影響光合碳固定的速率，還能影響藻細胞的呼吸強度以及能源水平(田華等,2005;Kebede,1996)，因此光照是螺旋藻生長最主要的環(huán)境因子。2.7接藻種量對螺旋藻SP06生長的影響試驗表明接藻種量越大，其同時間生長量就越大。由圖2，接藻種量5

53、%和10%所獲得的生長量OD560相近，從養(yǎng)殖成本考慮我們選擇5%為最佳接藻種量。2.8紫外照射對篩選株螺旋藻SP06生長的影響試驗結果如圖2所示，藻種接種前后生長顯著受到影響，這可能是因為紫外線照射會大量殺死藻種細胞，或受損的細胞修復復活也有一個過程，該試驗表明螺旋藻對紫外線有一定抗逆性，照射0.5h仍有較大生長量，同時也可預示有希望通過此方法篩選對紫外線抗逆性強的藻種。綜合以上選擇試驗表明該篩選株螺旋藻SP06在培養(yǎng)基配方為(g/L)：NaHCO316.8、KH2PO40.4、NaNO32.7、NaCl1.0、FeSO40.005、MgSO40.1、K2SO41.0、CaCl20.04，在起始pH9.0，每天光照強度4000Lx照射12h，光/暗30/25變溫條件下生長最好。2.9在所選最佳條件下篩選株SP06生長試驗試驗結果表明：螺旋