HIV抗體初篩實驗室標準操作規(guī)程

1、HIV抗體初篩實驗室標準操作規(guī)程第二章 樣品采集與處理一、 樣本采集1、 接患者申請單后，填寫血樣采集記錄，記錄包括患者日期、姓名、年齡、門診號、采集人簽名等。2、 用帶分離膠的負壓管采集一定量的靜脈血，顛倒混勻56次，室溫下自然放置半小時，待血液凝固、血塊收縮后再用3000r/min離心15min。二、 標本采集注意事項1、 樣本采集嚴格按靜脈穿刺規(guī)范操作。2、 采集樣本時應注意安全，直接接觸HIV感染/艾滋病病人血液的操作，應戴雙層手套，里層是PE手套，外層為乳膠手套。三、 樣本保存在一周內檢測的樣本，可存放于28；在一周以后檢測的樣本，須存放于-20。四、 樣本運送1、 樣本運送一般為血

2、清或血漿，不運送全血。2、 容器要求：血清應置于帶蓋的1.5ml離心管內，管外應有明顯的標記，姓名與門診號要清晰；在離心周圍應墊有可緩沖吸水材料，以免破碎；隨樣品應附有送檢單，送檢單應與樣本分開放置。外層容器要求耐受性好、防滲漏、容納并保護第一層容器。3、 天氣過熱，需采用干冰或冰壺冷藏運輸。第二章 標準操作程序一、北京金豪【方法】雙抗原夾心酶聯(lián)免疫法【原理】本試劑盒采用HIV特異性抗原gp160和gp36等包被微孔反應板，用gp36、gp41標記辣根過氧化物酶、采用雙抗原夾心法捕獲人血清、血漿標本中的HIV（1+2）抗體。【HIV篩查試驗操作程序】（一） 試驗前準備：1、 試驗開始前將試劑和

3、樣品放置于室溫（1823）半小時。2、 換隔離衣，戴好帽子、口罩、雙層手套。3、 緩沖液配制：用蒸餾水1：25倍稀釋，現(xiàn)用現(xiàn)配?；蛞后w內有結晶，應放置在37直至溶解。（二） 試驗操作：1、裝好所需使用數(shù)目的孔條。設空白對照孔2孔，2個陰性對照孔，2個HIV-1陽性對照孔。取陽性對照和陰性對照分別充分混勻各50ul加入對照孔中，空白對照孔只加樣品稀釋液。2、每檢測孔加入樣品稀釋液50ul，待檢樣品50ul，可振搖510S。3、覆蓋粘膠紙，37±2孵育30min。4、置洗板機上洗滌5遍（用洗液將反映孔完全加滿，靜置30S，共洗滌5遍，洗完后孔上方及底部不應殘存液體，禁止在濾紙上拍干）。5

4、、每孔加酶結合物100ul，取新粘膠紙覆蓋反應板，37±2孵育30min。6、同步驟4。7、每孔加入底物緩沖液50ul，TMB50ul，混勻，不必覆蓋粘膠紙，37±2孵育10min。8、每孔加入50ul 1M硫酸終止反應，充分混勻。9、在2h內置于酶標儀讀數(shù)，單波長450nm，或雙波長450/630nm測OD值。（三）試驗結果1、NC0.022、Cut off值0.1+NC0.123、標本OD值小于Cut off為陰性，大于或等于Cut off為陽性（四）報告：對呈陰性反應的樣品，可由實施檢測的實驗室出具HIV抗體陰性報告；對呈陽性反應的樣品，須進行復檢，不能出陽性報告。二

5、、上?？迫A生物【方法】雙抗原夾心酶聯(lián)免疫法【原理】本試劑盒采用HIV特異性抗原gp160和gp36等包被微孔反應板，用gp36、gp41標記辣根過氧化物酶、采用雙抗原夾心法捕獲人血清、血漿標本中的HIV（1+2）抗體?！綡IV篩查試驗操作程序】（一） 試驗前準備：1. 試驗開始前將試劑和樣品放置于室溫（1823）半小時。2. 換隔離衣，戴好帽子、口罩、雙層手套。3. 緩沖液配制：用蒸餾水1：25倍稀釋，現(xiàn)用現(xiàn)配。或液體內有結晶，應放置在37直至溶解。（二） 試驗操作：1、裝好所需使用數(shù)目的孔條。設空白對照孔2孔，2個陰性對照孔，3個HIV-1陽性對照孔。2、每孔加入100ul待檢樣品及對照（對

6、照要后加），可振搖15S。3、覆蓋粘膠紙，37±2孵育60±2min。4、置洗板機上洗滌5遍（用洗液將反映孔完全加滿，靜置30S，共洗滌5遍，洗完后孔上方及底部不應殘存液體，禁止在濾紙上拍干）。5、每孔加酶結合物100ul，取新粘膠紙覆蓋反應板，37±2孵育30min。6、同步驟4。7、每孔加入底物緩沖液50ul，TMB50ul，混勻，不必覆蓋粘膠紙，37±2孵育10min。8、每孔加入50ul 1M硫酸終止反應，充分混勻。9、在2h內置于酶標儀讀數(shù)，單波長450nm，或雙波長450/630nm測OD值。（三） 試驗結果1、NC0.082、Cut off

7、值陽性對照值×10%3、標本OD值小于Cut off為陰性，大于或等于Cut off為陽性（四） 報告：對呈陰性反應的樣品，可由實施檢測的實驗室出具HIV抗體陰性報告；對呈陽性反應的樣品，須進行復檢，不能出陽性報告。三、英科新創(chuàng)【方法】膠體金法【原理】本試劑盒采用膠體金免疫技術和層析原理，定性測定血清樣本中的HIV1/2型抗體。血清陽性樣本中HIV抗體與膠體金標記抗原結合形成復合物，由于層析作用復合物沿紙條向前移動，經過檢測線時與預包被的重組AuHIV（1+2）Ag則在對照線處與抗HIV單克隆抗體結合而富集顯色。陰性標本則僅在對照線處顯色，30分鐘內觀察結果即可。【HIV篩查試驗操作

8、程序】（一） 試驗前準備：1、 試驗開始前將試劑和樣品放置于室溫（1823）半小時，編號。2、 戴好帽子、口罩、雙層手套。3、 將所需測試卡從包裝盒中取出，置于臺面上。（二） 試驗操作：1、用微量加樣器取60ul樣本血清，加到測試卡的加樣處。2、加樣后，陽性標本可在130分鐘內檢出。30分鐘后觀察結果將造成影響。（三） 試驗結果陽性：測試卡在檢測區(qū)和對照區(qū)位置出現(xiàn)兩條紫紅色條帶。如果檢測的紫紅色條帶隱約可見，應用酶免試劑重復檢測。陰性：測試卡只在對照區(qū)位置出現(xiàn)一條紫紅色條帶。失效：對照區(qū)未出現(xiàn)紫紅色條帶?！痉椒ā侩p抗原夾心酶聯(lián)免疫法【原理】采用雙抗原夾心兩步法檢測人血清或血漿樣本中的HIV抗體

9、。當待檢樣本中存在HIV抗體時，在反應過程中形成“固相HIV抗原HIV抗體酶標記HIV抗原”的免疫復合物，加入底物后形成顯色反應?！綡IV篩查試驗操作程序】（一）試驗前準備：1. 試驗開始前將試劑和樣品放置于室溫（1825）半小時，編號。2. 換隔離衣，戴好帽子、口罩、雙層手套。3. 緩沖液配制：用蒸餾水1：19倍稀釋，現(xiàn)用現(xiàn)配?；蛞后w內有結晶，應放置在37直至溶解。（二）試驗操作1.按順序分別在相應孔加入50ul待測樣品及陰、陽性對照血清。2.覆上封板膜，置37溫育30min.3.用洗滌液充分洗滌5次（每次應保持3060秒浸泡時間），扣干。4.分別在每孔中加入酶標抗原100ul。5.覆上封板

10、膜，置37溫育30min。6.用洗滌液充分洗滌5次（每次應保持3060秒浸泡時間），扣干。7.每孔加底物A、B各50ul，輕拍混勻，覆上封板膜，置37暗置20min。8.每孔加入終止液50ul。9.用酶標儀測定。（三）試驗結果1.陽性對照值應大于陰性對照值0.6以上且陰性對照值小于0.1方可認為本實驗有效。2.Cutoff value=0.1+陰性對照均值（若陰性對照小于0.05以0.05計）3.樣品OD值大于或等于臨界值為初篩陽性，小于臨界值為陰性。結果報告與注意事項【復檢試驗】對初篩呈陽性反應的樣品用原有試劑和另外一種不同原理或不同廠家的篩查試劑重復檢測。如兩種試劑復測均呈陰性反應，則報告

11、HIV抗體陰性；如均呈陽性反應，或一陰一陽，需送艾滋病確認實驗室進行確認。（具體詳見流程圖）【篩試驗結果的報告】 對HIV抗體篩查試驗，呈陰性反應者可出具“HIV抗體陰性”報告。對初篩試驗呈陽性反應者不能出陽性報告，可出具“HIV抗體待復查”報告?！境鹾Y試驗呈陽性反應樣品的轉送】如需送上級實驗室進行復測或確認，需要填寫“HIV抗體復測送檢單”，經1名檢驗人員和1名具有中級以上技術職稱的人員審核簽字，與血樣品一同送天山區(qū)疾控中心實驗室，再轉送市疾控中心艾滋病確認實驗室，或在本實驗室復檢后直接送確認實驗室?！静僮髋_消毒處理】用35%84消毒液擦拭臺面，如工作臺被溢出物污染，則用消毒液浸泡30分鐘后，再行擦拭?！痉块g消毒】每日用紫外線照射3060min【方法學特性及注意事項】a) 試劑盒430干燥保存。有效期16個月。b) 抗凝全血應采用EDTA，樣品應避免溶血。c) 樣品應在收集后7天內