HIV抗體初篩實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

1、HIV抗體初篩實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程第二章 樣品采集與處理一、 樣本采集1、 接患者申請(qǐng)單后，填寫血樣采集記錄，記錄包括患者日期、姓名、年齡、門診號(hào)、采集人簽名等。2、 用帶分離膠的負(fù)壓管采集一定量的靜脈血，顛倒混勻56次，室溫下自然放置半小時(shí)，待血液凝固、血塊收縮后再用3000r/min離心15min。二、 標(biāo)本采集注意事項(xiàng)1、 樣本采集嚴(yán)格按靜脈穿刺規(guī)范操作。2、 采集樣本時(shí)應(yīng)注意安全，直接接觸HIV感染/艾滋病病人血液的操作，應(yīng)戴雙層手套，里層是PE手套，外層為乳膠手套。三、 樣本保存在一周內(nèi)檢測(cè)的樣本，可存放于28；在一周以后檢測(cè)的樣本，須存放于-20。四、 樣本運(yùn)送1、 樣本運(yùn)送一般為血

2、清或血漿，不運(yùn)送全血。2、 容器要求：血清應(yīng)置于帶蓋的1.5ml離心管內(nèi)，管外應(yīng)有明顯的標(biāo)記，姓名與門診號(hào)要清晰；在離心周圍應(yīng)墊有可緩沖吸水材料，以免破碎；隨樣品應(yīng)附有送檢單，送檢單應(yīng)與樣本分開放置。外層容器要求耐受性好、防滲漏、容納并保護(hù)第一層容器。3、 天氣過熱，需采用干冰或冰壺冷藏運(yùn)輸。第二章 標(biāo)準(zhǔn)操作程序一、北京金豪【方法】雙抗原夾心酶聯(lián)免疫法【原理】本試劑盒采用HIV特異性抗原gp160和gp36等包被微孔反應(yīng)板，用gp36、gp41標(biāo)記辣根過氧化物酶、采用雙抗原夾心法捕獲人血清、血漿標(biāo)本中的HIV（1+2）抗體?！綡IV篩查試驗(yàn)操作程序】（一） 試驗(yàn)前準(zhǔn)備：1、 試驗(yàn)開始前將試劑和

3、樣品放置于室溫（1823）半小時(shí)。2、 換隔離衣，戴好帽子、口罩、雙層手套。3、 緩沖液配制：用蒸餾水1：25倍稀釋，現(xiàn)用現(xiàn)配。或液體內(nèi)有結(jié)晶，應(yīng)放置在37直至溶解。（二） 試驗(yàn)操作：1、裝好所需使用數(shù)目的孔條。設(shè)空白對(duì)照孔2孔，2個(gè)陰性對(duì)照孔，2個(gè)HIV-1陽性對(duì)照孔。取陽性對(duì)照和陰性對(duì)照分別充分混勻各50ul加入對(duì)照孔中，空白對(duì)照孔只加樣品稀釋液。2、每檢測(cè)孔加入樣品稀釋液50ul，待檢樣品50ul，可振搖510S。3、覆蓋粘膠紙，37±2孵育30min。4、置洗板機(jī)上洗滌5遍（用洗液將反映孔完全加滿，靜置30S，共洗滌5遍，洗完后孔上方及底部不應(yīng)殘存液體，禁止在濾紙上拍干）。5

4、、每孔加酶結(jié)合物100ul，取新粘膠紙覆蓋反應(yīng)板，37±2孵育30min。6、同步驟4。7、每孔加入底物緩沖液50ul，TMB50ul，混勻，不必覆蓋粘膠紙，37±2孵育10min。8、每孔加入50ul 1M硫酸終止反應(yīng)，充分混勻。9、在2h內(nèi)置于酶標(biāo)儀讀數(shù)，單波長(zhǎng)450nm，或雙波長(zhǎng)450/630nm測(cè)OD值。（三）試驗(yàn)結(jié)果1、NC0.022、Cut off值0.1+NC0.123、標(biāo)本OD值小于Cut off為陰性，大于或等于Cut off為陽性（四）報(bào)告：對(duì)呈陰性反應(yīng)的樣品，可由實(shí)施檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室出具HIV抗體陰性報(bào)告；對(duì)呈陽性反應(yīng)的樣品，須進(jìn)行復(fù)檢，不能出陽性報(bào)告。二

5、、上?？迫A生物【方法】雙抗原夾心酶聯(lián)免疫法【原理】本試劑盒采用HIV特異性抗原gp160和gp36等包被微孔反應(yīng)板，用gp36、gp41標(biāo)記辣根過氧化物酶、采用雙抗原夾心法捕獲人血清、血漿標(biāo)本中的HIV（1+2）抗體?！綡IV篩查試驗(yàn)操作程序】（一） 試驗(yàn)前準(zhǔn)備：1. 試驗(yàn)開始前將試劑和樣品放置于室溫（1823）半小時(shí)。2. 換隔離衣，戴好帽子、口罩、雙層手套。3. 緩沖液配制：用蒸餾水1：25倍稀釋，現(xiàn)用現(xiàn)配?；蛞后w內(nèi)有結(jié)晶，應(yīng)放置在37直至溶解。（二） 試驗(yàn)操作：1、裝好所需使用數(shù)目的孔條。設(shè)空白對(duì)照孔2孔，2個(gè)陰性對(duì)照孔，3個(gè)HIV-1陽性對(duì)照孔。2、每孔加入100ul待檢樣品及對(duì)照（對(duì)

6、照要后加），可振搖15S。3、覆蓋粘膠紙，37±2孵育60±2min。4、置洗板機(jī)上洗滌5遍（用洗液將反映孔完全加滿，靜置30S，共洗滌5遍，洗完后孔上方及底部不應(yīng)殘存液體，禁止在濾紙上拍干）。5、每孔加酶結(jié)合物100ul，取新粘膠紙覆蓋反應(yīng)板，37±2孵育30min。6、同步驟4。7、每孔加入底物緩沖液50ul，TMB50ul，混勻，不必覆蓋粘膠紙，37±2孵育10min。8、每孔加入50ul 1M硫酸終止反應(yīng)，充分混勻。9、在2h內(nèi)置于酶標(biāo)儀讀數(shù)，單波長(zhǎng)450nm，或雙波長(zhǎng)450/630nm測(cè)OD值。（三） 試驗(yàn)結(jié)果1、NC0.082、Cut off

7、值陽性對(duì)照值×10%3、標(biāo)本OD值小于Cut off為陰性，大于或等于Cut off為陽性（四） 報(bào)告：對(duì)呈陰性反應(yīng)的樣品，可由實(shí)施檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室出具HIV抗體陰性報(bào)告；對(duì)呈陽性反應(yīng)的樣品，須進(jìn)行復(fù)檢，不能出陽性報(bào)告。三、英科新創(chuàng)【方法】膠體金法【原理】本試劑盒采用膠體金免疫技術(shù)和層析原理，定性測(cè)定血清樣本中的HIV1/2型抗體。血清陽性樣本中HIV抗體與膠體金標(biāo)記抗原結(jié)合形成復(fù)合物，由于層析作用復(fù)合物沿紙條向前移動(dòng)，經(jīng)過檢測(cè)線時(shí)與預(yù)包被的重組AuHIV（1+2）Ag則在對(duì)照線處與抗HIV單克隆抗體結(jié)合而富集顯色。陰性標(biāo)本則僅在對(duì)照線處顯色，30分鐘內(nèi)觀察結(jié)果即可?！綡IV篩查試驗(yàn)操作

8、程序】（一） 試驗(yàn)前準(zhǔn)備：1、 試驗(yàn)開始前將試劑和樣品放置于室溫（1823）半小時(shí)，編號(hào)。2、 戴好帽子、口罩、雙層手套。3、 將所需測(cè)試卡從包裝盒中取出，置于臺(tái)面上。（二） 試驗(yàn)操作：1、用微量加樣器取60ul樣本血清，加到測(cè)試卡的加樣處。2、加樣后，陽性標(biāo)本可在130分鐘內(nèi)檢出。30分鐘后觀察結(jié)果將造成影響。（三） 試驗(yàn)結(jié)果陽性：測(cè)試卡在檢測(cè)區(qū)和對(duì)照區(qū)位置出現(xiàn)兩條紫紅色條帶。如果檢測(cè)的紫紅色條帶隱約可見，應(yīng)用酶免試劑重復(fù)檢測(cè)。陰性：測(cè)試卡只在對(duì)照區(qū)位置出現(xiàn)一條紫紅色條帶。失效：對(duì)照區(qū)未出現(xiàn)紫紅色條帶?！痉椒ā侩p抗原夾心酶聯(lián)免疫法【原理】采用雙抗原夾心兩步法檢測(cè)人血清或血漿樣本中的HIV抗體

9、。當(dāng)待檢樣本中存在HIV抗體時(shí)，在反應(yīng)過程中形成“固相HIV抗原HIV抗體酶標(biāo)記HIV抗原”的免疫復(fù)合物，加入底物后形成顯色反應(yīng)。【HIV篩查試驗(yàn)操作程序】（一）試驗(yàn)前準(zhǔn)備：1. 試驗(yàn)開始前將試劑和樣品放置于室溫（1825）半小時(shí)，編號(hào)。2. 換隔離衣，戴好帽子、口罩、雙層手套。3. 緩沖液配制：用蒸餾水1：19倍稀釋，現(xiàn)用現(xiàn)配?；蛞后w內(nèi)有結(jié)晶，應(yīng)放置在37直至溶解。（二）試驗(yàn)操作1.按順序分別在相應(yīng)孔加入50ul待測(cè)樣品及陰、陽性對(duì)照血清。2.覆上封板膜，置37溫育30min.3.用洗滌液充分洗滌5次（每次應(yīng)保持3060秒浸泡時(shí)間），扣干。4.分別在每孔中加入酶標(biāo)抗原100ul。5.覆上封板

10、膜，置37溫育30min。6.用洗滌液充分洗滌5次（每次應(yīng)保持3060秒浸泡時(shí)間），扣干。7.每孔加底物A、B各50ul，輕拍混勻，覆上封板膜，置37暗置20min。8.每孔加入終止液50ul。9.用酶標(biāo)儀測(cè)定。（三）試驗(yàn)結(jié)果1.陽性對(duì)照值應(yīng)大于陰性對(duì)照值0.6以上且陰性對(duì)照值小于0.1方可認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)有效。2.Cutoff value=0.1+陰性對(duì)照均值（若陰性對(duì)照小于0.05以0.05計(jì)）3.樣品OD值大于或等于臨界值為初篩陽性，小于臨界值為陰性。結(jié)果報(bào)告與注意事項(xiàng)【復(fù)檢試驗(yàn)】對(duì)初篩呈陽性反應(yīng)的樣品用原有試劑和另外一種不同原理或不同廠家的篩查試劑重復(fù)檢測(cè)。如兩種試劑復(fù)測(cè)均呈陰性反應(yīng)，則報(bào)告

11、HIV抗體陰性；如均呈陽性反應(yīng)，或一陰一陽，需送艾滋病確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行確認(rèn)。（具體詳見流程圖）【篩試驗(yàn)結(jié)果的報(bào)告】 對(duì)HIV抗體篩查試驗(yàn)，呈陰性反應(yīng)者可出具“HIV抗體陰性”報(bào)告。對(duì)初篩試驗(yàn)呈陽性反應(yīng)者不能出陽性報(bào)告，可出具“HIV抗體待復(fù)查”報(bào)告?！境鹾Y試驗(yàn)呈陽性反應(yīng)樣品的轉(zhuǎn)送】如需送上級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行復(fù)測(cè)或確認(rèn)，需要填寫“HIV抗體復(fù)測(cè)送檢單”，經(jīng)1名檢驗(yàn)人員和1名具有中級(jí)以上技術(shù)職稱的人員審核簽字，與血樣品一同送天山區(qū)疾控中心實(shí)驗(yàn)室，再轉(zhuǎn)送市疾控中心艾滋病確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室，或在本實(shí)驗(yàn)室復(fù)檢后直接送確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室?！静僮髋_(tái)消毒處理】用35%84消毒液擦拭臺(tái)面，如工作臺(tái)被溢出物污染，則用消毒液浸泡30分鐘后，再行擦拭。【房間消毒】每日用紫外線照射3060min【方法學(xué)特性及注意事項(xiàng)】a) 試劑盒430干燥保存。有效期16個(gè)月。b) 抗凝全血應(yīng)采用EDTA，樣品應(yīng)避免溶血。c) 樣品應(yīng)在收集后7天內(nèi)