動(dòng)物組織切片的制作與染色

1、1水產(chǎn)動(dòng)物組織切片的制作與染色水產(chǎn)動(dòng)物組織切片的制作與染色2一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康膎學(xué)習(xí)石蠟切片法學(xué)習(xí)石蠟切片法n了解組織染色原理了解組織染色原理n掌握各組織器官的基本結(jié)構(gòu)掌握各組織器官的基本結(jié)構(gòu)3組織切片標(biāo)本組織切片標(biāo)本載玻片載玻片蓋玻片蓋玻片組織組織二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理4二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理5 根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模x擇相應(yīng)的材料，材料要求根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，選擇相應(yīng)的材料，材料要求新鮮、新鮮、準(zhǔn)確、完整準(zhǔn)確、完整，材料要避免擠壓、挫傷、干枯。，材料要避免擠壓、挫傷、干枯。n種類：種類：n部位：部位：肝肝n年齡或發(fā)育階段年齡或發(fā)育階段n是觀察橫切面還是縱切面？是觀察橫切面還是縱切面

2、？取材原則：取材原則：n動(dòng)作動(dòng)作-快，輕，用力均勻快，輕，用力均勻n體積合適：體積合適： 0.30.30.3 cmn刀要鋒利刀要鋒利n及時(shí)固定及時(shí)固定:編號(hào)編號(hào), 注明采集時(shí)間、地點(diǎn)、名稱、組織部位注明采集時(shí)間、地點(diǎn)、名稱、組織部位6 取材后應(yīng)及時(shí)固定，取材后應(yīng)及時(shí)固定，編號(hào)，注明采集時(shí)間、地點(diǎn)、編號(hào)，注明采集時(shí)間、地點(diǎn)、名稱、組織部位。名稱、組織部位。n目的目的-保持原來(lái)的結(jié)構(gòu)保持原來(lái)的結(jié)構(gòu)n固定液：固定液：波恩氏液波恩氏液n固定時(shí)間：固定時(shí)間：48h左右左右n固定后的處理：固定后的處理：將固定液換成將固定液換成70%乙醇作短期保存乙醇作短期保存7n單一固定液?jiǎn)我还潭ㄒ簄復(fù)合固定液復(fù)合固定液

3、長(zhǎng)處突出，短處抵消長(zhǎng)處突出，短處抵消（Bouins） 8n保持組織新鮮，勿使其干燥，盡快固定處理。保持組織新鮮，勿使其干燥，盡快固定處理。n固定液必須有足夠的量，一般大于組織固定液必須有足夠的量，一般大于組織2020倍以上。倍以上。n組織塊不易過(guò)大過(guò)厚，厚度必須控制在組織塊不易過(guò)大過(guò)厚，厚度必須控制在0.3cm0.3cm以內(nèi)。以內(nèi)。n沖洗或漂洗：組織固定后應(yīng)充分水洗，去除固定液造成的沖洗或漂洗：組織固定后應(yīng)充分水洗，去除固定液造成的人為假象。人為假象。n抽氣：使固定液盡快滲入材料內(nèi)部，并排除材料內(nèi)氣泡的抽氣：使固定液盡快滲入材料內(nèi)部，并排除材料內(nèi)氣泡的干擾。干擾。9p水和透明劑不能互溶，只有脫

4、去水分后，才能讓水和透明劑不能互溶，只有脫去水分后，才能讓透明劑進(jìn)入?，F(xiàn)采用的脫水劑一般是透明劑進(jìn)入?，F(xiàn)采用的脫水劑一般是乙醇乙醇或丙酮?；虮Ｋ饶芘c水相混合，又能與透明劑相混。它既能與水相混合，又能與透明劑相混。p脫水的過(guò)程：脫水的過(guò)程：70%80%90%70%80%90%（各（各1h1h） 95%95% 95%95%100%100%100%100%（各（各20min20min）p脫水的時(shí)間，可根據(jù)組織的類型，大小而定。脫水的時(shí)間，可根據(jù)組織的類型，大小而定。p保證脫水梯度和每一步脫水時(shí)間，水要完全脫凈保證脫水梯度和每一步脫水時(shí)間，水要完全脫凈，但不能過(guò)度脫水（過(guò)久使組織變脆，但不能過(guò)度

5、脫水（過(guò)久使組織變脆, , 收縮）收縮）10p二甲苯是使用最廣泛的一種透明劑，它具有滲透二甲苯是使用最廣泛的一種透明劑，它具有滲透力強(qiáng)，溶解石蠟量大，又易揮發(fā)的優(yōu)點(diǎn)，其缺點(diǎn)力強(qiáng)，溶解石蠟量大，又易揮發(fā)的優(yōu)點(diǎn)，其缺點(diǎn)是是易使組織收縮，變硬，變脆易使組織收縮，變硬，變脆，因此透明時(shí)間應(yīng)，因此透明時(shí)間應(yīng)根據(jù)組織塊大小及質(zhì)地酌情而定。根據(jù)組織塊大小及質(zhì)地酌情而定。p替代品：替代品：水楊酸甲酯（水楊酸甲酯（30min），氯仿等。，氯仿等。11p將完成透明步驟的組織塊浸入透明劑與石蠟混合將完成透明步驟的組織塊浸入透明劑與石蠟混合液中，不斷提高石蠟的比例，直至用石蠟完全置液中，不斷提高石蠟的比例，直至用石蠟

6、完全置換了組織塊中的透明劑，使石蠟浸入組織而起支換了組織塊中的透明劑，使石蠟浸入組織而起支持作用，便于今后的包理與切片（持作用，便于今后的包理與切片（1h1h）。）。p浸蠟應(yīng)在高于石蠟熔點(diǎn)浸蠟應(yīng)在高于石蠟熔點(diǎn)33左右的溫箱左右的溫箱（6060）中中進(jìn)行，以利石蠟浸入組織內(nèi)。進(jìn)行，以利石蠟浸入組織內(nèi)。12p將液態(tài)石蠟緩緩倒入將液態(tài)石蠟緩緩倒入金屬模具金屬模具中，再用鑷子中，再用鑷子輕輕將浸好蠟的組織塊夾入輕輕將浸好蠟的組織塊夾入金屬模具金屬模具，擺好，擺好位置，待石蠟冷卻成固態(tài)即包埋完畢（位置，待石蠟冷卻成固態(tài)即包埋完畢（約約15 15 minmin）。）。13n包埋好的蠟塊用刀片修包埋好的蠟塊

7、用刀片修成規(guī)整的方形或長(zhǎng)方形，成規(guī)整的方形或長(zhǎng)方形，附于小木塊上附于小木塊上n通常切片厚度為通常切片厚度為5 56um6um切切出一片接一片的蠟帶，用出一片接一片的蠟帶，用毛筆輕托輕放在紙上。毛筆輕托輕放在紙上。14n用粘附劑將展平的蠟片牢附于載玻片上，以免在用粘附劑將展平的蠟片牢附于載玻片上，以免在以后操作中使材料脫落。以后操作中使材料脫落。n在載玻片上涂抹粘片劑，再滴蒸餾水，放上蠟片在載玻片上涂抹粘片劑，再滴蒸餾水，放上蠟片鋪展，最后用濾紙吸除多余水分，將載玻片放入鋪展，最后用濾紙吸除多余水分，將載玻片放入4545溫箱中干燥。溫箱中干燥。15堿性染料，使細(xì)胞核等呈堿性染料，使細(xì)胞核等呈紫藍(lán)

8、色紫藍(lán)色嗜堿性嗜堿性酸性染料，使一般胞質(zhì)和膠酸性染料，使一般胞質(zhì)和膠原纖維呈粉紅色原纖維呈粉紅色 嗜酸性嗜酸性蘇木精（蘇木精（hematoxylin）伊紅（伊紅（eosin）1617n染色后的切片尚不能在顯微鏡下觀察，需經(jīng)梯染色后的切片尚不能在顯微鏡下觀察，需經(jīng)梯度酒精脫水，在度酒精脫水，在9595及純酒精中的時(shí)間可適當(dāng)及純酒精中的時(shí)間可適當(dāng)加長(zhǎng)以保證脫水徹底；如染液為酒精配制，則加長(zhǎng)以保證脫水徹底；如染液為酒精配制，則應(yīng)縮短在酒精中的時(shí)間，以免脫色。應(yīng)縮短在酒精中的時(shí)間，以免脫色。n二甲苯透明后，滴加適量（二甲苯透明后，滴加適量（1 12 2滴）中性樹(shù)膠，滴）中性樹(shù)膠，再將潔凈蓋玻片傾斜放下

9、，以免出現(xiàn)氣泡。再將潔凈蓋玻片傾斜放下，以免出現(xiàn)氣泡。18三、實(shí)驗(yàn)主要儀器三、實(shí)驗(yàn)主要儀器切片機(jī)烤片機(jī)攤片機(jī)19四、實(shí)驗(yàn)試劑四、實(shí)驗(yàn)試劑nBouin氏液：氏液：飽和苦味酸飽和苦味酸 75 ml,甲醛甲醛 25 ml，冰乙酸，冰乙酸 5 ml。nEhrilich氏酸性蘇木素液氏酸性蘇木素液：蘇木素：蘇木素 2 g，純酒精，純酒精 100 ml，鉀明礬鉀明礬 15 g，蒸餾水，蒸餾水 100 ml，甘油，甘油 100 ml，冰醋酸，冰醋酸 10 mln1%伊紅染液伊紅染液：中性曙紅：中性曙紅 0.51 g，蒸餾水，蒸餾水 100 ml n1%鹽酸鹽酸-酒精分化液酒精分化液：濃鹽酸：濃鹽酸 1 ml

10、，70%酒精酒精 99 ml 。n梯度酒精梯度酒精：70%乙醇、乙醇、80%乙醇、乙醇、90%乙醇、乙醇、95%乙乙醇、無(wú)水乙醇。醇、無(wú)水乙醇。n二甲苯二甲苯n石蠟石蠟n中性樹(shù)膠中性樹(shù)膠20五、實(shí)驗(yàn)步驟五、實(shí)驗(yàn)步驟（1）取材）取材21n取材取材固定固定（24-36 h）n70%乙醇（乙醇（1 h）n80%乙醇（乙醇（1 h）n90%乙醇（乙醇（1 h）n95%乙醇（乙醇（20min*2）n100%乙醇（乙醇（20min*2）n水楊酸甲酯水楊酸甲酯（約（約30min ）n1/2石蠟石蠟 + 1/2二甲二甲苯（苯（20min）n蠟杯蠟杯 （20min*2）n包埋包埋n切片切片n貼片貼片n烤片烤片（

11、2）脫水、透明、浸蠟、包埋、切片）脫水、透明、浸蠟、包埋、切片22（3）H.E.染色流程染色流程n二甲苯二甲苯脫蠟脫蠟（1）（）（10 min）n二甲苯脫蠟二甲苯脫蠟(2)（5 min）n1/2 100%乙醇乙醇 + 1/2 二甲二甲苯（苯（1）（）（3 min）n100%乙醇（乙醇（2 min）n95%乙醇（乙醇（2 min）n80%乙醇（乙醇（2 min）n70%乙醇（乙醇（2 min）n蒸餾水洗（蒸餾水洗（3 min）吸水吸水n蘇木精染色蘇木精染色（14min）n自來(lái)水洗（自來(lái)水洗（10min）n分化液分化液分化分化（3s）n自來(lái)水洗（自來(lái)水洗（35 min）n伊紅染色伊紅染色（1.5min）n70%乙醇乙醇 （2 min）n80%乙醇（乙醇（2 min）n 90%乙醇（乙醇（2 min）n95%乙醇乙醇 (1)(2)（2 min）n100%乙醇乙