生物顯微技術(shù)試卷

1、GDOU-B-11-302班級(jí)： 姓名： 學(xué)號(hào)： 試題共 1 頁(yè)加白紙1張 密 封 線(xiàn)廣東海洋大學(xué) 2012 2013 學(xué)年第 一 學(xué)期 生物顯微技術(shù)與電鏡技術(shù) 課程試題課程號(hào)：11352124考試A卷閉卷考查B卷開(kāi)卷題 號(hào)一二三四五六七八九十總分閱卷教師各題分?jǐn)?shù)實(shí)得分?jǐn)?shù)簡(jiǎn)答題（請(qǐng)從以下三個(gè)題目中任選兩個(gè)作答）1、 相差顯微鏡的制造成功，是近代顯微鏡技術(shù)中最為重要的成就，請(qǐng)查閱文獻(xiàn)詳述相差顯微鏡的工作原理和特點(diǎn)。2、 目前，在常規(guī)生物顯微技術(shù)的基礎(chǔ)上已經(jīng)發(fā)展出了染色體原位雜交技術(shù)、組織化學(xué)原位雜交技術(shù)、組織切片原位PCR等研究手段，請(qǐng)查閱文獻(xiàn)詳述其中一種研究手段的原理和基本

2、步驟。3、 常規(guī)電子顯微鏡技術(shù)與免疫學(xué)方法結(jié)合形成了免疫電子顯微術(shù)，其中膠體金標(biāo)記抗體技術(shù)最為成熟，得到廣泛應(yīng)用。請(qǐng)查閱文獻(xiàn)詳述該技術(shù)的原理和基本步驟。1、答：相差顯微鏡的工作原理: 鏡檢時(shí)光源只能通過(guò)環(huán)狀光闌的透明環(huán)，經(jīng)聚光器后聚成光束，這束光線(xiàn)通過(guò)被檢物體時(shí)，因各部分的光程不同，光線(xiàn)發(fā)生不同程度的偏斜（衍射）。由于透明圓環(huán)所成的像恰好落在物鏡后焦點(diǎn)平面和相板上的共軛面重合。因此，未發(fā)生偏斜的直射光便通過(guò)共軛面，而發(fā)生偏斜的衍射光則經(jīng)補(bǔ)償面通過(guò)。由于相板上的共軛面和補(bǔ)償面的性質(zhì)不同，它們分別將通過(guò)這兩部分的光線(xiàn)產(chǎn)生一定的相位差和強(qiáng)度的減弱，兩組光線(xiàn)再經(jīng)后透鏡的會(huì)聚，又復(fù)在同一光路上

3、行進(jìn)，而使直射光和衍射光產(chǎn)生光的干涉，變相位差為振幅差。這樣在相差顯微鏡鏡檢時(shí)，通過(guò)無(wú)色透明體的光線(xiàn)使人眼不可分辨的相位差轉(zhuǎn)化為人眼可以分辨的振幅差（明暗差）。$主要用于觀察活細(xì)胞或不染色的組織切片，有時(shí)也可用于觀察缺少反差的染色樣品。特點(diǎn)：光線(xiàn)通過(guò)比較透明的標(biāo)本時(shí)，光的波長(zhǎng)（顏色）和振幅（亮度）都沒(méi)有明顯的變化。因此，用普通光學(xué)顯微鏡觀察未經(jīng)染色的標(biāo)本（如活的細(xì)胞）時(shí)，其形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)往往難以分辨。然而，由于細(xì)胞各部分的折射率和厚度的不同，光線(xiàn)通過(guò)這種標(biāo)本時(shí)，直射光和衍射光的光程就會(huì)有差別。隨著光程的增加或減少，加快或落后的光波的相位會(huì)發(fā)生改變（產(chǎn)生相位差）。光的相位差人的肉眼感覺(jué)不到，但相

4、差顯微鏡能通過(guò)其特殊裝置環(huán)狀光闌和相板，利用光的干涉現(xiàn)象，將光的相位差轉(zhuǎn)變?yōu)槿搜劭梢圆煊X(jué)的振幅差（明暗差），從而使原來(lái)透明的物體表現(xiàn)出明顯的明暗差異，對(duì)比度增強(qiáng)，使我們能比較清楚的觀察到普通光學(xué)顯微鏡和暗視野顯微鏡下都看不到或看不清的活細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)的某些細(xì)微結(jié)構(gòu)。2、答：組織化學(xué)原位雜交技術(shù)的原理: 原位雜交技術(shù)是在一定的溫度和離子濃度下，使具有特異序列的單鏈探針通過(guò)堿基互補(bǔ)規(guī)則與組織細(xì)胞內(nèi)待測(cè)的核酸復(fù)性結(jié)合而使得組織細(xì)胞中的特異性核酸得到定位，并通過(guò)探針上所標(biāo)記的檢測(cè)系統(tǒng)將其在核酸的原有位置上顯示出來(lái)。 經(jīng)特定標(biāo)記的核苷酸鏈為探針，可與組織切片、細(xì)胞或染色體標(biāo)本中的待檢DNA片段或mRNA進(jìn)

5、行雜交，然后顯示標(biāo)記物，從而分析待檢核酸的分布和含量。利用此項(xiàng)技術(shù)可研究各種基因在染色體上的定位，編碼某種蛋白質(zhì)的mRNA在胞質(zhì)中的表達(dá)。基本步驟：原位雜交技術(shù)方法大致可分為：1.雜交前準(zhǔn)備，包括固定、取材、玻片和組織的處理，如何增強(qiáng)核酸探針的穿透性、減低背景染色等；2.雜交；3.雜交后處理；4.顯示：包括放射性自顯影和非放射性標(biāo)記的顯色。 （一）固定 原位雜交組織化學(xué)技術(shù)在固定劑的應(yīng)用和選擇上應(yīng)兼顧到三個(gè)方面：保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)，最大限度地保持細(xì)胞內(nèi)DNA或RNA的水平；使探針易于進(jìn)入細(xì)胞或組織。DNA是比較穩(wěn)定的，mRNA是相對(duì)穩(wěn)定的但易為酶合成和降解。RNA卻絕然不同，非常容易被降解。 因此，

6、對(duì)于DNA的定位來(lái)說(shuō)，固定劑的種類(lèi)和濃度并不十分重要。相反，在RNA的定位上，如果要使RNA的降解減少到最低限度，那么，不僅固定劑的種類(lèi)濃度和固定的時(shí)間十分重要，而且取材后應(yīng)盡快予以冷凍或固定。 （二）玻片和組織切片的處理 1玻片的處理 玻片包括蓋片和載片應(yīng)用熱肥皂刷洗，自來(lái)水清洗干凈后，置于清潔液中浸泡24h，清水洗凈烘干，95%酒精中浸泡24h后蒸餾水沖洗、烘干，烘箱溫度最好在150或以上過(guò)夜以去除任何RNA酶。由于ISHH的實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)程序繁雜，因此，要應(yīng)用粘附劑預(yù)先涂抹在玻片上，干燥后待切片時(shí)應(yīng)用，以保證在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中切片不致脫落。常用的粘附劑有鉻礬-明膠液，多聚賴(lài)氨酸液。 2增

7、強(qiáng)組織的通透性和核酸探針的穿透性 此步驟根據(jù)應(yīng)用固定劑的種類(lèi)、組織的種類(lèi)、切片的厚度和核酸探針的長(zhǎng)度而定。比如用戊二醛固定的組織由于其與蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接就需要應(yīng)用較強(qiáng)的增強(qiáng)組織通透性的試劑。增強(qiáng)組織通透性常用的方法如應(yīng)用稀釋的酸洗滌、去垢劑或稱(chēng)清洗劑Triton X-100、酒精或某些消化酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶、膠原蛋白酶和淀粉酶等。 這種廣泛的去蛋白作用無(wú)疑可增強(qiáng)組織的通透性和核酸探針的穿透性，提高雜交信號(hào)，但同時(shí)也會(huì)減低RNA的保存最和影響組織結(jié)構(gòu)的形態(tài)，因此，在用量及孵育時(shí)間上應(yīng)慎為掌握。 3減低背景染色 在原位雜交實(shí)驗(yàn)程序中，如何減低背景染色是一個(gè)重要的問(wèn)題。ISHH中背景染色

8、的形成是諸多因素造成的。雜交后的酶處理和雜交后的洗滌均有助于減低背景染色。 預(yù)雜交是減低背景染色的一種有效手段。預(yù)雜交液和雜交液的區(qū)別在于前者不含探針和硫酸葡聚糖。將組織切片浸入預(yù)雜交液中可達(dá)到封閉非特異性雜交點(diǎn)的目的，從而減低背景染色。 4防止RNA酶的污染 由于在手指皮膚及實(shí)驗(yàn)用玻璃器皿上均可能含有RNA酶,為防止其污染影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在整個(gè)雜交前處理過(guò)程都需戴消毒手套。所有實(shí)驗(yàn)用玻璃器皿及鑷子都應(yīng)于實(shí)驗(yàn)前一日置高溫（240）烘烤以達(dá)到消除RNA酶的目的。要破壞RNA酶，其最低溫度必須在150左右。雜交前及雜交時(shí)所應(yīng)用的溶液均需經(jīng)高壓消毒處理。 （三）雜交 在ISHH，整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期是比較長(zhǎng)的

9、，實(shí)驗(yàn)程序也比較繁雜，而雜交在ISHH整個(gè)實(shí)驗(yàn)中可被認(rèn)為是“短兵相接”的一步。雜交前的一切準(zhǔn)備工作如增加組織通透性都是為了在雜交這一步驟中核酸探針能進(jìn)入細(xì)胞或組織與其內(nèi)的靶核苷酸相結(jié)合。因此，雜交是ISHH中關(guān)鍵的而且是最重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。 雜交是將雜交液滴于切片組織上，加蓋硅化的蓋玻片，防止孵育過(guò)程中的高溫（50左右）導(dǎo)致雜交液的蒸發(fā)。為保證雜交所需的濕潤(rùn)環(huán)境，可將其放在盛有少量5×SSC或2×SSC溶液的硬塑料盒中進(jìn)行孵育。雜交液的成分和預(yù)雜交液基本相同，所不同的是加入了標(biāo)記的核酸探針和硫酸葡聚糖。 （四）雜交后處理 雜交后處理包括系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的漂洗。通過(guò)雜交后的洗滌有效地減低背景染色，獲得較好的反差效果。 （五）顯示根據(jù)核酸探針標(biāo)記物的種類(lèi)分別進(jìn)行放射自顯影或利用酶檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行不同顯色處理。細(xì)胞或組織的原位雜交切片在顯示后均可進(jìn)行半定量的測(cè)定，如放射自顯影可利用人工或計(jì)算機(jī)輔助的圖象分析檢測(cè)儀檢測(cè)銀粒的數(shù)量和分布的差異。非放射性核酸探針雜交的細(xì)胞或組織可利用酶檢測(cè)系統(tǒng)顯色，然后利