851分光光度法和光散射USP38

1、851分光光度法和光散射紫外、可見光、紅外、原子吸收、熒光、透射比濁法、散射比濁法和拉曼光 譜測定法。吸收分光光度法是測量一化學物質(zhì)電磁輻射與分子或原子間相互作用的方 法。其中常用于藥物分析的技術包括紫外、可見光、紅外和原子吸收光譜法?？?見光區(qū)域的分光光度測量法過去稱作比色法，然而，僅在涉及人類對色彩的感覺 時，用“比色法”這個術語才更準確。熒光分光光度法是對化學物質(zhì)在暴露于紫外線、可見光或其它電磁輻射時所 發(fā)射光線進行測量的方法。一般熒光溶液最大強度發(fā)射光的波長比激發(fā)光波長要 長，通常大約2030nm。光散射是對由于溶液亞顯微光密度不均一性導致的散射光進行測量的方法。 在測量分子量在100

2、0到幾億相對分子量間的多分散系統(tǒng)的平均分子量時很有 用。有兩種這樣的技術(透射比濁法和散射比濁法)應用于藥物分析。拉曼光譜法(非彈性光散射)是試樣在強烈的單色光(通常是激光)照射下 的光散射過程，從樣品散射的光被用來分析頻移。用于這些測量方法的波長范圍從紫外短波長一直延伸到紅外波長。為了方便 參考，這個光譜范圍大致分為以下幾個部分：紫外線(190380nm)、可見光 (380780nm)、近紅外光(7803000nm)、紅外光(2.540m 或 4000250cm-1)。光譜應用范圍比較對于很多藥品而言，在紫外線和可見光區(qū)域內(nèi)的光譜測定比在近紅外和紅外 光譜區(qū)域內(nèi)測定的準確性和靈敏度更高。當在

3、1cm吸收池內(nèi)觀察溶液時，濃度 約10g/mL的樣品溶液經(jīng)常在紫外可見光區(qū)域產(chǎn)生0.2-0.8的吸光度。而在紅外 和近紅外區(qū)域，可能需要1-10mg/mL甚至100mg/mL的濃度才能產(chǎn)生足夠的吸 光度；在這些光譜范圍內(nèi)，池長度一般為0.013mm。物質(zhì)的紫外和可見光譜通常專屬性不高，但適于做定量測定。此外，對于許 多物質(zhì)來說，可用作鑒別的輔助手段。近紅外光譜法在藥物分析中的應用越來越多，尤其是對大量樣品的快速鑒別 以及水分測定。近紅外尤其適合-OH和-NH基團的測定，如乙醇中水的測定、胺類存在下的 -OH測定、烴類中的醇的測定以及叔胺存在情況下伯胺和仲胺的測定。紅外光譜對除光學異構體外任意給

4、定的化合物具有專屬性，光學異構體的紅 外光譜完全相同。然而，某些固體化合物由于存在多品型，會引起紅外光譜差異。 結構上微小的差異經(jīng)常會導致光譜中的顯著差異。由于在一個紅外吸收圖譜中有 大量最大值，有時可不預先分離直接對已知各組分含量的混合物的單個組分進行 定量檢測。雖然光譜強度取決于不同的分子特性，拉曼光譜和紅外光譜可產(chǎn)生類似的數(shù) 據(jù)。拉曼和紅外光譜學對不同的功能基團顯示不同的相對靈敏度，例如拉曼光譜 對C-S和C-C多重鍵特別敏感，而一些芳香族化合物更容易通過拉曼光譜鑒別 出來。水的紅外吸收光譜很強，而拉曼光譜很弱。因此，水只有有限的紅外“窗 口”來檢測物質(zhì)的含水量，而其拉曼光譜幾乎完全透明

5、并可用于溶質(zhì)的鑒別。拉 曼光譜學的兩個主要局限性，一是樣品的最低檢測濃度一般為10-1M10-2M，二 是很多物質(zhì)中的雜質(zhì)能發(fā)出熒光干擾對拉曼散射信號的檢測。光反射測定法與透射測定法反映的光譜信息類似。由于反射測定法僅探測樣 品表面成分，從而消除了物質(zhì)的光散射性質(zhì)和光學厚度帶來的困難。因此，在強 吸光性物質(zhì)上進行反射測定法經(jīng)常會更簡單。在紅外反射測定中常用的一個技術 是衰減全反射（ATR），也稱為多重內(nèi)反射（MIR）。在ATR技術中，紅外光譜 儀的光束通過適當?shù)募t外窗口物質(zhì)進行傳遞（如KRS-5、TlBr-TlI低共熔混合物）， 它以這樣的一個角度被切斷：紅外光束進入第一個（前）窗口表面，但當

6、其碰撞 到第二個（后）表面時完全反射（即光束的入射角在第二個窗口表面時超過了該 材料的臨界角）。通過適當材料的窗口，紅外光束在穿過窗口前可形成許多內(nèi)反 射。如果樣品放置于能完全反射紅外光束的窗口上，則樣品吸收了反射光，它的 強度因而在每個波長（頻率）處減弱。因此，與簡單的反射相比，ATR技術通 過紅外光束在窗口數(shù)次反射可形成增強的反射光譜。ATR技術靈敏度高，但重 現(xiàn)性差，如果不用內(nèi)標物與每個供試樣品緊密混合，該方法不是可靠的定量檢測 方法。熒光分光光度法通常比吸收分光光度法更靈敏。在吸收測定法中，樣品的透 光度與空白作比較；低濃度時，兩種溶液均產(chǎn)生高信號。相反，熒光光度法檢測 時，空白溶劑信

7、號低。所以低濃度時，背景輻射對測定的干擾較小。然而很少化 合物在低于10-5M濃度時能通過吸收光譜測定，在熒光分光光度法中不經(jīng)常使用 10-710-8M濃度的溶液。理論和術語輻射光束的能量隨光束在吸收介質(zhì)中行進距離的增加而減少，且隨介質(zhì)中的 吸光性分子或離子的濃度增加而減少。這兩個因素決定了總入射能量出現(xiàn)的比例。 單色光輻射透過均一吸收介質(zhì)時，其減少的能量可通過比爾定律進行定量計算， 10gl0（1/T）=A=abc，式中各術語定義定義如下：吸光度（符號：A）以透光度（T）倒數(shù)取10為底的對數(shù)。（注：過去曾用光 學密度、吸收率和消光系數(shù)表示。）吸收系數(shù)（符號：a）吸光度（A）除以樣品濃度（c）

8、,表述為g/L，和吸光 光路長度（b，cm）的積得商。（注：不要與吸收指數(shù)、比消光系數(shù)和消光系數(shù) 混淆）。摩爾吸收系數(shù)（符號：球吸光度（A）除以樣品濃度，表示為mol/L，和吸 收光光路長度（cm）的積得商。這也是樣品的吸收系數(shù)a和物質(zhì)的分子量的積。在大多數(shù)情況下，物質(zhì)的吸收系數(shù)是常數(shù)，不依賴于入射光強度、吸收池內(nèi) 部長度和樣品濃度，所以物質(zhì)的濃度可通過分光光度法測定。比爾定律沒有給出溫度、波長或溶劑類型的影響。因為對大多數(shù)分析工作來 說，正常范圍內(nèi)溫度波動的影響可以忽略不計。比爾定律的偏差可由化學或儀器的變動引起。顯然，以下因素引起的溶質(zhì)分 子之間的相互作用、離解、電離。其他偏差可能由多色輻

9、射、狹縫寬度效應或散 色光等諸多因素引起。即使在某一固定的溫度和溶劑的情況下，吸收系數(shù)也可能不是常數(shù)。然而， 在定量分析中，吸光系統(tǒng)不一定要符合比爾定律的要求，只要樣品中有一個成分 吸光，則樣品濃度可通過已有吸光成分的標準曲線對比確定。雖然在嚴格意義上說，由于缺少池長度和樣品濃度這樣的量化指標，比爾定 律在原子吸收光譜中不成立，但如果用可重復吸收的燈,則基本上符合比爾定律。 具體來說，透光率的負對數(shù)或吸光度與吸收系數(shù)呈正比，因此也與吸收原子數(shù)呈 正比。在此基礎上，標準曲線可按這樣的要求建立，即能根據(jù)溶液中已知化合物 的濃度來估算未知吸收值。吸收光譜表示吸光度或任何吸光度函數(shù)的圖譜，按波長或波長

10、函數(shù)繪制。透光度（符號：T）透過樣品的輻射能量除以樣品入射能量的商（注：以前 常用的術語包括透射比和透射度。）對照品的應用除極少數(shù)例子外，藥典分光光度檢查和含量測定的比對要用USP標準物質(zhì)。 這是為了確保在同一條件下測定供試品和對照品。這些條件包括波長設置、狹縫 寬度調(diào)整、池的位置和校正以及透光水平。需要指出的是在特定波長處具有相同 透光度的池，可能在其他波長處透光度相差很大。必要時，應對池進行適當?shù)男?正。分光光度法檢查和含量測定中，常出現(xiàn)“同法”和“相同溶液”，系指對照品（一 般為USP標準物質(zhì)）與供試品一樣用同一條件處理和檢測。通常，特定對照品 溶液的配制應在規(guī)定濃度（通常約在10%范圍

11、內(nèi)），吸收系數(shù)按精密稱定量計算； 如果以前烘干的對照品尚未使用，則吸收系數(shù)以無水物計。在分光光度法檢查和含量測定中，若出現(xiàn)“伴隨測定”和“伴隨測量”，系指供 試品溶液和對照品溶液相對于特定空白溶液的吸光度，應連續(xù)測定。儀器分光光度計的種類較多。除了用于紅外光譜檢查的光度計外，大部分類型的 光度計能用單色輻射能量透過樣品，且能測定透過部分光的強度。傅里葉變換紅 外光譜儀使用的是干涉測量技術。根據(jù)強度和時間，多色輻射可借此技術透過分 析對象到達檢測器。紫外、可見和紅外分光光度計包括光源、分光裝置（如棱鏡 或光柵）、譜帶寬度選擇狹縫、樣品池、輻射能量檢測器以及配套的放大器和測 量裝置。在二極管陣列分

12、光光度計里，從光源發(fā)射的能量通過樣品，再由光柵發(fā) 散到達數(shù)百個光敏二極管上，每個二極管在其短短的波長間隔依次產(chǎn)生與光子數(shù) 量呈正比的信號；然后這些信號在快速選定的間隔中計算形成完整的光譜。傅里 葉變換紅外光譜儀系統(tǒng)利用干涉儀代替分光裝置和數(shù)值計算機處理光譜數(shù)據(jù)。有 些儀器是手動的，而另外一些配備了自動連續(xù)的記錄儀。連接了計算機的儀器可 以對光譜進行疊加、存儲和對比，以及計算示差光譜（用數(shù)字吸光度差減法）。在可見光區(qū)，可見和紫外光區(qū)；可見、紫外和近紅外光區(qū)；以及紅外光區(qū)使 用的光譜儀器都可以買到。對分光光度計分析類型和使用儀器的選擇取決于以下 因素：被分析樣品的組成和量，對準確度、靈敏度和選擇性

13、的要求，以及樣品處 理方式。原子吸收分光光度法使用的儀器有幾個獨特的功能。對于測定的各種元素， 每種均需選擇能發(fā)射特征共振線的源。這種源通常是空心陰極燈，其負極在受激 時能發(fā)射被測元素的共振線。由于被測元素吸收的輻射與被測元素相同。該設備 還配備了一個抽吸裝置，用來引導試驗樣品進入火焰中，該火焰通常由空氣-乙 快、空氣-氫氣，難熔情況下則由一氧化二氮-乙快來提供。實際上，火焰是一個 被加熱的樣品室。而檢測器則是讀取來自樣品室的信號?；鹧嬖谌紵龝r產(chǎn)生的干 擾射線會因使用具有特定頻率的切碎源燈而消除掉。檢測器應調(diào)成交流電頻率， 因此能忽略火焰產(chǎn)生的直流電信號。藥典的目標是：儀器應該能直接提供吸光度

14、 單位。然而，根據(jù)品種正文計算公式要求的定量結果，必要時也能用直接顯示透 光百分率、吸收百分率或濃度的儀器。吸光百分率或透光百分率可由以下兩個等 式轉換成吸光度（A）：A=2- log10（100-吸收）或 A=2- log10 （透光）根據(jù)所使用儀器的類型，讀出裝置可能是計量器、計數(shù)器、記錄儀或打印機。單光束和雙光束儀器都適合以上要求，且市面上都能買到。步驟吸收分光光度法關于操作分光光度計的詳細說明由制造商提供。為得到顯著有效的結果，分 光光度計的操作者必須意識到它的局限性及錯誤和差異的潛在來源。使用手冊 應該密切關注下列事項如：儀器的維護、清潔、校準，處理吸收池的技術以及操 作說明。下面幾

15、點需特別強調(diào)。檢查儀器的校準準確性。當使用連續(xù)光源時，應 當注意其波長和光度比；當使用光譜線光源時，只需檢查光度比。很多輻射能量 源具有充分分布于整個所選光譜范圍的合適強度的光譜線。紫外和可見光校正光 譜的最佳單一光源是石英-汞弧燈，其中在253.7、302.25、313.16、334.15、365.48、 404.66和435.83nm的光線可以使用。玻璃-汞弧燈在300nm以上同樣可用。氫 放電燈的486.13 nm和656.28 nm光線也可以使用。波長范圍還可以通過適當 的玻璃濾波器校準，該濾波器在可見光和紫外區(qū)域的吸收光譜帶很有用處。雖然 發(fā)現(xiàn)含欽的玻璃更好些，但是含釹錯混合物（一個

16、錯和釹的混合物）的標準鏡片使 用廣泛。標準欽氧化物溶液已經(jīng)替代了欽玻璃.1的使用。近紅外和紅外分光光度 計的波長范圍能通過使用由聚苯乙烯薄膜、二氧化碳、水蒸氣或氨氣來提供的吸 收帶易于檢出。對于檢查光度比，可使用若干標準無機玻璃濾波器，以及已知透光度的標準 溶液如重銘酸鉀。定量吸光度測定通常對裝有物質(zhì)的盛液池中的溶液中進行。由于溶劑和池窗 都吸收光，兩者對所測吸光度的影響必須給予補償。市場上可以買到在紫外和 可見分光光度法中適用的、無需校正的吸收池。但是，在紅外分光光度法，通常 要校正吸收池的差異。在這些情況下，在成對的吸收池裝上選定的溶劑，并在選 定的波長下測定它們吸光度的差異。顯示較大吸光

17、度的吸收池可用于測試樣品， 測得的吸光度再減去池的差值來校正。隨著計算機化傅里葉變換紅外系統(tǒng)的使用，因為空白溶劑和測試溶液用的是 同一個吸收池，這個校正過程就沒必要了。但是，必須確定該池的透射參數(shù)為常 量。供試品和對照品的比較最好是在關注化合物的吸收光譜的峰值處進行。分光 光度法含量測定給出的是普遍接受的待測化合物的峰值吸收。已知不同的分光光 度計會在該峰的表觀波長處顯示出微小差異。習慣做法是在峰值吸收波長下進行 比較。如果與各論中指定波長差異超過±1nm，則需重新校正儀器。試驗準備用紫外或可見光分光光度法測定時，樣品一般溶解在溶劑中。除非各論中另 有規(guī)定，測定是在室溫用1cm光程長

18、的條件完成。包括水、醇類、氯仿、低級 烴、醚類和強酸強堿的稀釋液在內(nèi)的很多溶劑在上述條件下都可用。應警惕不要 使用在此光區(qū)中有雜質(zhì)吸收的溶劑。一般建議使用無水甲醇或乙醇，或添加了 甲醇但不含苯或其他干擾雜質(zhì)的變性乙醇作為溶劑。具有特殊光譜性質(zhì)并保證不 含雜質(zhì)的溶劑，可從一些商業(yè)途徑購得。某些其他分析純有機溶劑，可能含有能 在紫外區(qū)域強吸收的痕量雜質(zhì)。使用新溶劑時，應檢查其透明度，在配制供試品 溶液、對照品溶液以及空白溶液時，應注意使用同一批溶劑。在近紅外和紅外光譜區(qū)域，具有可感知厚度的溶劑不是完全透明的。四氯化 碳（最多5mm厚）在6p m（1666cm-1）以下幾乎透明。二硫化碳（厚度1mm

19、） 適合作為最多40p m（250cm-1）光線的溶劑，但是4.25.0 m （2381 cm-1 to 2000 cm-1）和5.5p m7.5 m （1819 cm-1 to 1333 cm-1）的區(qū)域除外，因其在此區(qū)域有 強吸光性。其他溶劑的透明度區(qū)域都相對狹窄。對于紅外分光光度法，對適當溶 劑的額外要求是其必須對吸收池的材質(zhì)（一般是氯化鈉）無影響。供試品的制備： 將磨細的固體樣品分散在礦物油中，或與預先干燥的堿性鹵素鹽（通常是溴化鉀） 混勻。與堿性鹵素鹽形成的混合物可直接測定，或通過模具壓制混合物得到透明 的圓盤或小球再測定。溴化鉀的典型干燥條件是在105真空干燥12個小時， 但是也可

20、以在市場上采購無需干燥的級別。在堿性鹵素鹽和測試樣品有歧化作用 發(fā)生時，采用紅外顯微法或礦物油分散法分散更可取。若試樣合適，則可制備成 整齊的薄層樣品用紅外顯微鏡檢測，或用礦物油分散法制備成懸浮的液體薄膜。 拉曼光譜法中大多數(shù)常見溶劑即可適用，普通的玻璃樣品池（不發(fā)熒光）也可 以使用。電磁光譜的紅外區(qū)域從0.8400 m。8002500 nm（0.82.5 m）一 般認為是近紅外（NIR）區(qū)域，2.525 m區(qū)（4000400cm-1）一般認為是中紅 外區(qū)域，25400 m區(qū)一般認為是遠紅外區(qū)域（FIR）。除非各論中另有規(guī)定， 用3800650cm-1（2.615 m）區(qū)間測定，用于確定是否符

21、合各論中紅外吸收的 要求。在各論中給定的紅外線光譜的值中，字母s、m和w相應表示強、中和弱吸 收；sh表示肩，bd表示一個帶，v表示非常。這些值變化多達0.1 m或10cm-1， 具體數(shù)值取決于所使用的特定儀器。多品型導致了很多固態(tài)化合物的紅外光譜的 差異性。因此，在進行紅外吸收試驗時，如果供試品和對照品的紅外光譜間出現(xiàn) 差異，將等量的供試品和對照品溶解在等體積的合適溶劑中，在同等條件下用相 似容器蒸發(fā)至干，取殘渣再次測量。在近紅外光譜學中，現(xiàn)有關注大多圍繞如何簡化分析。樣品可以粉末形式或 通過反射技術進行分析，無需或只需簡單的前處理?？赏ㄟ^計算機比較樣品的譜 圖和已知對照物譜圖來確定是否符合

22、內(nèi)部規(guī)格。許多藥品物質(zhì)在此光譜區(qū)表現(xiàn)出低吸收率，這使入射的近紅外光可以比紫外、可見光或紅外光更深地穿透樣品。 近紅外分光光度法可用于觀察基質(zhì)變化，經(jīng)適當校正可用于定量分析。在原子吸收分光光度法中，溶劑的性質(zhì)和固體的濃度必須特殊考慮。理想的 溶劑要求對吸收或發(fā)射過程干擾最小且在火焰中產(chǎn)生中性原子。如果供試品溶液 和對照品溶液間表面張力或粘度存在顯著差異，溶液就會以不同的速率吸氣或霧 化，導致產(chǎn)生的信號出現(xiàn)顯著差異。溶液中酸濃度也會影響吸收過程。因而，配 制供試品溶液和對照品溶液時，應使用在這些方面相同或盡量類似的溶劑，并且 應使配制的溶液容易吸收經(jīng)燃燒吸收器的樣品管發(fā)射的輻射，因溶液中的不溶固 體會產(chǎn)生基質(zhì)干擾，所有溶液中不溶固體含量應盡可能保持在2%以內(nèi)。計算在檢查或含量測定中，吸收分光光度法通常需要使用對照品。如在含量測定 中有規(guī)定，則應提供計算公式以便計算需要的結果。公式中常含有常數(shù)項。可用 下面的推算式消去一些正文含量測定項下公式中的常數(shù)項。比爾定律關系式對對照品溶液（S）和供試品溶液（U）均有效。（1）As = abCs （2）Au = abCu式中，As是濃度為Cs的對照品溶液的吸光度，Au是濃度為Cu的供試 品溶液的吸光度。如果Cs和Cu單位相同，并且在相同尺寸的配對池中測定吸 光度，