第8酵母基因工程基因工程原理與技術(shù)劉志國(guó)課件

1、第二節(jié)第二節(jié) 常見(jiàn)的酵母基常見(jiàn)的酵母基因表達(dá)系統(tǒng)因表達(dá)系統(tǒng)第八章第八章 酵母基因工程酵母基因工程 酵母菌表達(dá)載體酵母菌表達(dá)載體 酵母基因表達(dá)宿主系統(tǒng)酵母基因表達(dá)宿主系統(tǒng)第一節(jié)第一節(jié) 酵母基因工程表達(dá)體系酵母基因工程表達(dá)體系第四節(jié)第四節(jié) 酵母基因工程應(yīng)用舉例酵母基因工程應(yīng)用舉例-利用重組酵母生產(chǎn)乙肝利用重組酵母生產(chǎn)乙肝疫苗疫苗 酵母菌的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)酵母菌的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)第三節(jié)第三節(jié) 影響外源基因表達(dá)的因素影響外源基因表達(dá)的因素酵母菌的分類學(xué)特征酵母菌的分類學(xué)特征 酵母菌（酵母菌（Yeast）是一群是一群以芽殖或裂殖方式以芽殖或裂殖方式進(jìn)行無(wú)性繁進(jìn)行無(wú)性繁殖的單細(xì)胞真核生物，分屬于子囊菌綱、擔(dān)子菌綱、半知菌

2、殖的單細(xì)胞真核生物，分屬于子囊菌綱、擔(dān)子菌綱、半知菌類，共由類，共由5656個(gè)屬和個(gè)屬和500500多個(gè)種組成。多個(gè)種組成。 酵母菌是比較成熟的真核生物表達(dá)系統(tǒng)。酵母菌是比較成熟的真核生物表達(dá)系統(tǒng)。第一節(jié)第一節(jié) 酵母基因表達(dá)體系酵母基因表達(dá)體系-宿主系統(tǒng)宿主系統(tǒng)作為宿主細(xì)胞的酵母需滿足的基本要求作為宿主細(xì)胞的酵母需滿足的基本要求 安全無(wú)毒，沒(méi)有致病性。安全無(wú)毒，沒(méi)有致病性。 遺傳背景清楚，容易進(jìn)行遺傳操作。遺傳背景清楚，容易進(jìn)行遺傳操作。 外源外源DNADNA容易導(dǎo)入宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)化效率高。容易導(dǎo)入宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)化效率高。 培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，容易進(jìn)行培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，容易進(jìn)行高密度高密度發(fā)酵。發(fā)酵。 有較

3、強(qiáng)的蛋白質(zhì)分泌能力。有較強(qiáng)的蛋白質(zhì)分泌能力。 有類似高等真核生物的蛋白質(zhì)翻譯后的修飾加工能有類似高等真核生物的蛋白質(zhì)翻譯后的修飾加工能力力。 酵母菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢(shì)酵母菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢(shì)全基因組測(cè)序，基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理比較清楚，遺傳全基因組測(cè)序，基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理比較清楚，遺傳操作簡(jiǎn)便操作簡(jiǎn)便能將外源基因表達(dá)產(chǎn)物能將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)分泌至培養(yǎng)基中基中具有原核細(xì)菌無(wú)法比擬的具有原核細(xì)菌無(wú)法比擬的真核蛋白翻譯后加工系統(tǒng)真核蛋白翻譯后加工系統(tǒng)大規(guī)模發(fā)酵歷史悠久、技術(shù)成熟、工藝簡(jiǎn)單、成本大規(guī)模發(fā)酵歷史悠久、技術(shù)成熟、工藝簡(jiǎn)單、成本低廉低廉不含有特異性的病毒、不含有特異性的病毒、不產(chǎn)內(nèi)毒素不產(chǎn)

4、內(nèi)毒素，美國(guó)，美國(guó)FDA認(rèn)定認(rèn)定為安全的為安全的基因工程受體系統(tǒng)基因工程受體系統(tǒng)酵母菌是酵母菌是最簡(jiǎn)單的真核模式生物最簡(jiǎn)單的真核模式生物常用的酵母宿主菌常用的酵母宿主菌目前已廣泛用于外源基因表達(dá)和研究的酵母菌包括：目前已廣泛用于外源基因表達(dá)和研究的酵母菌包括：釀酒酵母屬釀酒酵母屬 如釀酒酵母（如釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）克魯維酵亞母屬克魯維酵亞母屬 如乳酸克魯維酵母（如乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）畢赤酵母屬畢赤酵母屬 如巴斯德畢赤酵母（如巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）裂殖酵母屬裂殖酵母屬 如粟酒裂殖酵母（如粟酒裂

5、殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）解脂耶氏酵母（解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）其中釀酒酵母的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究最為詳盡，其中釀酒酵母的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究最為詳盡，但巴斯德畢赤酵母表達(dá)外源基因最理想。但巴斯德畢赤酵母表達(dá)外源基因最理想。 假絲酵母屬假絲酵母屬 產(chǎn)朊假絲酵母產(chǎn)朊假絲酵母 (Candida utilis) 酵母菌表達(dá)系統(tǒng)的選擇酵母菌表達(dá)系統(tǒng)的選擇 釀酒酵母的基因表達(dá)系統(tǒng)最為成熟，包括轉(zhuǎn)錄活性較高的甘油釀酒酵母的基因表達(dá)系統(tǒng)最為成熟，包括轉(zhuǎn)錄活性較高的甘油醛醛-3-磷酸脫氫酶基因磷酸脫氫酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因磷酸甘油

6、激酶基因PKG、乙醇脫氫乙醇脫氫釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)酶基因酶基因ADH所屬的啟動(dòng)子，多種重組外源蛋白獲得成功表達(dá)所屬的啟動(dòng)子，多種重組外源蛋白獲得成功表達(dá)。 釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)的最大問(wèn)題在于其釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)的最大問(wèn)題在于其超糖基化超糖基化能力，往往使得能力，往往使得有些重組蛋白（如人血清白蛋白等）與受體細(xì)胞緊密結(jié)合，而不能有些重組蛋白（如人血清白蛋白等）與受體細(xì)胞緊密結(jié)合，而不能大量分泌。這一缺陷可用非釀酒酵母型的表達(dá)系統(tǒng)來(lái)彌補(bǔ)。大量分泌。這一缺陷可用非釀酒酵母型的表達(dá)系統(tǒng)來(lái)彌補(bǔ)。 乳酸克魯維酵母的雙鏈環(huán)狀質(zhì)粒乳酸克魯維酵母的雙鏈環(huán)狀質(zhì)粒pKD1已被廣泛用作重組異源已被廣泛用作重組

7、異源蛋白生產(chǎn)的高效表達(dá)穩(wěn)定性載體，即便在無(wú)選擇壓力的條件下，也蛋白生產(chǎn)的高效表達(dá)穩(wěn)定性載體，即便在無(wú)選擇壓力的條件下，也乳酸克魯維酵母表達(dá)系統(tǒng)乳酸克魯維酵母表達(dá)系統(tǒng)能穩(wěn)定遺傳能穩(wěn)定遺傳4040代以上。代以上。 乳酸克魯維酵母表達(dá)分泌型和非分泌型的重組蛋白，性能均優(yōu)乳酸克魯維酵母表達(dá)分泌型和非分泌型的重組蛋白，性能均優(yōu)于釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)。于釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)。 巴斯德畢赤酵母是一種巴斯德畢赤酵母是一種甲基營(yíng)養(yǎng)菌甲基營(yíng)養(yǎng)菌，能在甲醇培養(yǎng)基中生，能在甲醇培養(yǎng)基中生巴斯德畢赤酵母表達(dá)系巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)統(tǒng)長(zhǎng)，長(zhǎng)，甲醇可高效甲醇可高效誘導(dǎo)甲醇代謝途徑中各酶編碼基因的表達(dá)。誘導(dǎo)甲醇代謝途徑中各酶編碼基因

8、的表達(dá)。表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)勢(shì)表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)勢(shì)：生長(zhǎng)迅速、強(qiáng)啟動(dòng)子（乙醇氧化酶基因生長(zhǎng)迅速、強(qiáng)啟動(dòng)子（乙醇氧化酶基因AOX1） 、可誘導(dǎo)表達(dá)、可誘導(dǎo)表達(dá) 由于巴斯德畢赤酵母沒(méi)有合適的自主復(fù)制型載體，所以由于巴斯德畢赤酵母沒(méi)有合適的自主復(fù)制型載體，所以外源基因序列一般整合入受體的染色體外源基因序列一般整合入受體的染色體DNA上。其外源基因上。其外源基因20余種具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的重組蛋白在該系統(tǒng)中獲得成功表達(dá)。余種具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的重組蛋白在該系統(tǒng)中獲得成功表達(dá)。的高效表達(dá)在很大程度上取決于整合拷貝數(shù)的多寡。目前已有的高效表達(dá)在很大程度上取決于整合拷貝數(shù)的多寡。目前已有 多型漢遜酵母也是一種多型漢遜酵母也是一種甲基營(yíng)養(yǎng)

9、菌甲基營(yíng)養(yǎng)菌。其自主復(fù)制序列。其自主復(fù)制序列多型漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)多型漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)HARS已被克隆，并用于構(gòu)建克隆表達(dá)載體，已被克隆，并用于構(gòu)建克隆表達(dá)載體， HARS質(zhì)粒質(zhì)粒能高頻自發(fā)地整合在受體的染色體能高頻自發(fā)地整合在受體的染色體DNA上（可連續(xù)整合上（可連續(xù)整合100多多 目前，包括乙型肝炎表面抗原在內(nèi)的數(shù)種外源蛋白在該目前，包括乙型肝炎表面抗原在內(nèi)的數(shù)種外源蛋白在該個(gè)拷貝，因此重組多型漢遜酵母的構(gòu)建也是采取整合的策略。個(gè)拷貝，因此重組多型漢遜酵母的構(gòu)建也是采取整合的策略。系統(tǒng)中獲得成功表達(dá)。系統(tǒng)中獲得成功表達(dá)。釀酒酵母中的釀酒酵母中的2 2m m環(huán)狀質(zhì)粒環(huán)狀質(zhì)粒同源重組同源重組RE

10、P1RAFSTBoriREP2FLPIRIRAB環(huán)狀質(zhì)粒，拷貝數(shù)達(dá)環(huán)狀質(zhì)粒，拷貝數(shù)達(dá)5050至至100100個(gè)。個(gè)。IRs 反向重復(fù)序列，反向重復(fù)序列，600 bp，重組重組FLP 編碼產(chǎn)物驅(qū)動(dòng)編碼產(chǎn)物驅(qū)動(dòng)IRs的同源重組的同源重組REP 編碼產(chǎn)物控制質(zhì)粒的穩(wěn)定性編碼產(chǎn)物控制質(zhì)粒的穩(wěn)定性STB REP的結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合位點(diǎn)接合酵母屬中的接合酵母屬中的pSR1和和pSB1，以及以及克魯維酵母屬中的克魯維酵母屬中的pKD1等均與等均與2m m質(zhì)質(zhì)粒類似。粒類似。第一節(jié)第一節(jié) 酵母基因工程表達(dá)體系酵母基因工程表達(dá)體系-載體載體第一節(jié)第一節(jié) 酵母基因工程表達(dá)體系酵母基因工程表達(dá)體系-載體載體 酵母質(zhì)粒載

11、體既可以在大腸桿菌復(fù)制與擴(kuò)增、又可以酵母質(zhì)粒載體既可以在大腸桿菌復(fù)制與擴(kuò)增、又可以在酵母系統(tǒng)中復(fù)制與擴(kuò)增，故此類載體又稱為在酵母系統(tǒng)中復(fù)制與擴(kuò)增，故此類載體又稱為穿梭載體（穿梭載體（shuttle vectorshuttle vector）。 酵母菌酵母菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體是由來(lái)自酵母的部分核大腸桿菌穿梭表達(dá)載體是由來(lái)自酵母的部分核酸序列和細(xì)菌的部分核酸序列所組成，其原核部分主要包酸序列和細(xì)菌的部分核酸序列所組成，其原核部分主要包括可以在大腸桿菌中復(fù)制的起點(diǎn)序列括可以在大腸桿菌中復(fù)制的起點(diǎn)序列(Ori)和特定的抗生素和特定的抗生素抗性基因序列，這兩個(gè)部分主要是作為在大腸桿菌宿主時(shí)抗性基因序

12、列，這兩個(gè)部分主要是作為在大腸桿菌宿主時(shí)增殖和篩選組分。酵母部分包括酵母轉(zhuǎn)化子的篩選組分，增殖和篩選組分。酵母部分包括酵母轉(zhuǎn)化子的篩選組分，主要是與宿主互補(bǔ)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型基因序列主要是與宿主互補(bǔ)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型基因序列(如：如：HIS4基因序基因序列列)或特定的抗生素抗性基因序列或特定的抗生素抗性基因序列(如：抗如：抗Zeoein的基因序列的基因序列)，以及編碼特定蛋白的基因啟動(dòng)子和終止子序列。，以及編碼特定蛋白的基因啟動(dòng)子和終止子序列。 第一節(jié)第一節(jié) 酵母基因工程表達(dá)體系酵母基因工程表達(dá)體系 -載體載體1 1酵母載體的基本結(jié)構(gòu)酵母載體的基本結(jié)構(gòu) DNA復(fù)制起始區(qū)復(fù)制起始區(qū)：2質(zhì)粒的復(fù)制起始區(qū)及酵母

13、基因組的質(zhì)粒的復(fù)制起始區(qū)及酵母基因組的自主復(fù)制序列（自主復(fù)制序列（autonomously replicating sequence，ARS） 篩選標(biāo)記：篩選標(biāo)記：營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選或者抗性篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選或者抗性篩選 整合介導(dǎo)區(qū)整合介導(dǎo)區(qū) 有絲分裂穩(wěn)定區(qū)有絲分裂穩(wěn)定區(qū) 表達(dá)盒表達(dá)盒： 啟動(dòng)子啟動(dòng)子 ，基因（分泌信號(hào)序列，基因（分泌信號(hào)序列 ），終止子），終止子2 酵母載體的種類酵母載體的種類酵母整合型質(zhì)粒酵母整合型質(zhì)粒YIp： 缺乏酵母的復(fù)制起始位點(diǎn)，缺乏酵母的復(fù)制起始位點(diǎn)，不不能在酵母中自主復(fù)制，能在酵母中自主復(fù)制，含有酵母的篩選標(biāo)記含有酵母的篩選標(biāo)記ura3基因基因。具有整合介導(dǎo)區(qū)，具有整

14、合介導(dǎo)區(qū)， 所以，它只有整合到酵母染色體所以，它只有整合到酵母染色體中才能穩(wěn)定中才能穩(wěn)定(a)。酵母克隆表達(dá)載體根據(jù)其在酵母中酵母克隆表達(dá)載體根據(jù)其在酵母中復(fù)制形式復(fù)制形式來(lái)分來(lái)分類。分為下列五類類。分為下列五類 ：酵母載體按照酵母載體按照用途用途不同可分為克隆載體和表達(dá)載體不同可分為克隆載體和表達(dá)載體兩類兩類含有酵母菌染色體含有酵母菌染色體DNA同源序列的同源序列的YIp質(zhì)粒質(zhì)粒的構(gòu)建的構(gòu)建 在大腸桿菌質(zhì)粒上組裝酵母菌染色體在大腸桿菌質(zhì)粒上組裝酵母菌染色體DNA特定序列和標(biāo)特定序列和標(biāo)記基因，構(gòu)建出來(lái)的質(zhì)粒稱為記基因，構(gòu)建出來(lái)的質(zhì)粒稱為YIp。目的基因表達(dá)盒通常插目的基因表達(dá)盒通常插在染色體

15、在染色體DNA特定序列中，這樣目的基因就能高效整合入特定序列中，這樣目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色體酵母菌特定的染色體DNA區(qū)域。區(qū)域。酵母附加體質(zhì)粒酵母附加體質(zhì)粒YEp：含有釀酒酵母：含有釀酒酵母2m m質(zhì)粒質(zhì)粒DNA復(fù)復(fù)制有關(guān)的序列，該載體在酵母細(xì)胞中穩(wěn)定，拷貝數(shù)制有關(guān)的序列，該載體在酵母細(xì)胞中穩(wěn)定，拷貝數(shù)可達(dá)可達(dá)60-100。轉(zhuǎn)化效率高（。轉(zhuǎn)化效率高（b）。）。 酵母復(fù)制型質(zhì)粒酵母復(fù)制型質(zhì)粒YRp：含有來(lái)源于酵母的：含有來(lái)源于酵母的DNA復(fù)制復(fù)制起始區(qū)起始區(qū)(ARS)，能在酵母染色體外自主復(fù)制的一種自，能在酵母染色體外自主復(fù)制的一種自主復(fù)制型載體，雖然其轉(zhuǎn)化效率高，在宿主的拷貝數(shù)

16、主復(fù)制型載體，雖然其轉(zhuǎn)化效率高，在宿主的拷貝數(shù)可以達(dá)上百個(gè)（可以達(dá)上百個(gè)（c）。）。 ARS為酵母菌中的自主復(fù)制序列，為酵母菌中的自主復(fù)制序列，0.8-1.5kb，染色體上每染色體上每30-40 kb就有一個(gè)就有一個(gè)ARS元件。元件。 以以ARS為復(fù)制子的質(zhì)粒稱為為復(fù)制子的質(zhì)粒稱為YRp 上述兩類質(zhì)粒在釀酒酵母中的拷貝數(shù)最高可達(dá)上述兩類質(zhì)粒在釀酒酵母中的拷貝數(shù)最高可達(dá)200200個(gè)，個(gè)， 以以2m m質(zhì)粒上的復(fù)制元件為復(fù)制子的質(zhì)粒稱為質(zhì)粒上的復(fù)制元件為復(fù)制子的質(zhì)粒稱為YEp但培養(yǎng)幾代后，質(zhì)粒的丟失率高達(dá)但培養(yǎng)幾代后，質(zhì)粒的丟失率高達(dá)50%-70%50%-70%，主要是由于，主要是由于分配不均勻

17、所致。分配不均勻所致。2 2 酵母載體的種類酵母載體的種類 酵母著絲粒質(zhì)粒酵母著絲粒質(zhì)粒YCp：含有酵母染色體著絲粒的：含有酵母染色體著絲粒的DNA片段，這種載體在細(xì)胞分裂過(guò)程中，在母細(xì)胞片段，這種載體在細(xì)胞分裂過(guò)程中，在母細(xì)胞和子細(xì)胞之間平均分配，表現(xiàn)出高度的穩(wěn)定性和子細(xì)胞之間平均分配，表現(xiàn)出高度的穩(wěn)定性(d)。 CEN為酵母菌染色體為酵母菌染色體DNA上與染色體均勻分配有關(guān)上與染色體均勻分配有關(guān)的序列的序列,將將CEN DNA插入含插入含ARS的質(zhì)粒中，獲得的新的質(zhì)粒中，獲得的新載體稱為載體稱為YCp .YCp質(zhì)粒具有較高的有絲分裂穩(wěn)定性質(zhì)粒具有較高的有絲分裂穩(wěn)定性，但拷貝數(shù)只有，但拷貝數(shù)

18、只有1 - 5個(gè)。個(gè)。 酵母人工染色體酵母人工染色體YAC：自主復(fù)制序列（自主復(fù)制序列（ARS）、著絲粒序列（）、著絲粒序列（CEN）和端粒序列（）和端粒序列（TEL），）， YAC載體在宿主細(xì)胞中載體在宿主細(xì)胞中以線性雙鏈以線性雙鏈DNA存在，具有高度的遺傳穩(wěn)定性。存在，具有高度的遺傳穩(wěn)定性。 主要結(jié)構(gòu)：主要結(jié)構(gòu)： 兩個(gè)可在酵母菌中利用的選擇基因，兩個(gè)可在酵母菌中利用的選擇基因，URA3和和TRP1(色氨酸合成基因色氨酸合成基因)； 酵母菌著絲粒序列酵母菌著絲粒序列 (centromere4,CEN4)； 一個(gè)自主復(fù)制序列一個(gè)自主復(fù)制序列(ARS1)； 兩個(gè)來(lái)自嗜熱四膜蟲(chóng)兩個(gè)來(lái)自嗜熱四膜蟲(chóng)

19、(Tetrahymenna thermophilp)的末端重復(fù)序列的末端重復(fù)序列(TEL)，以，以保持重組保持重組YAC為線狀結(jié)構(gòu)；為線狀結(jié)構(gòu)； 在兩個(gè)末端序列中間，有一段填充序在兩個(gè)末端序列中間，有一段填充序列列(stuff, HIS3)，以便，以便pYAC4在細(xì)菌細(xì)胞在細(xì)菌細(xì)胞中穩(wěn)定擴(kuò)增；中穩(wěn)定擴(kuò)增； Ampr抗性及細(xì)菌質(zhì)粒復(fù)制原點(diǎn)；抗性及細(xì)菌質(zhì)粒復(fù)制原點(diǎn)； 一個(gè)一個(gè)EcoR克隆位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于酵克隆位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于酵母菌母菌Sup4 tRNA基因內(nèi)?；騼?nèi)。 酵母菌的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)酵母菌的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)酵母菌的轉(zhuǎn)化方法酵母菌的轉(zhuǎn)化方法用于轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因用于轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因酵母菌轉(zhuǎn)化方法酵母

20、菌轉(zhuǎn)化方法原生質(zhì)球法原生質(zhì)球法：酶解酵母細(xì)胞壁，產(chǎn)生原生質(zhì)球，：酶解酵母細(xì)胞壁，產(chǎn)生原生質(zhì)球，原生質(zhì)體原生質(zhì)體在在Ca2+和和PEG的存在下，的存在下，具有穿透性，并允許具有穿透性，并允許DNADNA進(jìn)入，然進(jìn)入，然后使原生質(zhì)球再生新的細(xì)胞壁。后使原生質(zhì)球再生新的細(xì)胞壁?？梢詫?shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化子可可以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化子可達(dá)原生質(zhì)體總數(shù)的達(dá)原生質(zhì)體總數(shù)的1-2%。Li+鹽轉(zhuǎn)化方法鹽轉(zhuǎn)化方法 ：釀酒酵母的完整細(xì)胞經(jīng)堿金屬離子（如：釀酒酵母的完整細(xì)胞經(jīng)堿金屬離子（如Li+等）處理后，在等）處理后，在PEG存在下和熱休克之后可高效吸收質(zhì)存在下和熱休克之后可高效吸收質(zhì)粒粒DNA。醋酸鋰對(duì)釀酒酵母有效，對(duì)畢赤酵

21、母無(wú)效，畢赤。醋酸鋰對(duì)釀酒酵母有效，對(duì)畢赤酵母無(wú)效，畢赤酵母轉(zhuǎn)化一般用氯化鋰有效酵母轉(zhuǎn)化一般用氯化鋰有效優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：吸收線型：吸收線型DNADNA的能力明顯大于環(huán)狀的能力明顯大于環(huán)狀DNADNA（相差（相差8080倍）倍）酵母菌轉(zhuǎn)化方法酵母菌轉(zhuǎn)化方法電擊轉(zhuǎn)化法：電擊轉(zhuǎn)化法：原理是通過(guò)利用高壓電脈沖作用，造成細(xì)胞膜的原理是通過(guò)利用高壓電脈沖作用，造成細(xì)胞膜的不穩(wěn)定，形成電穿孔，形成可逆的瞬間通道，不僅有利于離子不穩(wěn)定，形成電穿孔，形成可逆的瞬間通道，不僅有利于離子和水進(jìn)入細(xì)胞，也有利于外源和水進(jìn)入細(xì)胞，也有利于外源DNADNA等大分子進(jìn)入等大分子進(jìn)入 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：不依賴于受體細(xì)胞的遺傳特征及培養(yǎng)條

22、件；適用范圍不依賴于受體細(xì)胞的遺傳特征及培養(yǎng)條件；適用范圍廣；轉(zhuǎn)化率高（達(dá)廣；轉(zhuǎn)化率高（達(dá)105 / m mg DNA）。）。PEG轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化法：PEG 1000酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化特點(diǎn)酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化特點(diǎn)單、雙鏈單、雙鏈DNADNA均可轉(zhuǎn)化，但單鏈的轉(zhuǎn)化率是雙鏈的均可轉(zhuǎn)化，但單鏈的轉(zhuǎn)化率是雙鏈的10-3010-30倍倍單鏈質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞后，能轉(zhuǎn)化為雙鏈并復(fù)制（含有復(fù)制子）或單鏈質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞后，能轉(zhuǎn)化為雙鏈并復(fù)制（含有復(fù)制子）或同源整合入染色體（不含復(fù)制子）同源整合入染色體（不含復(fù)制子）克隆在克隆在YIpYIp上的外源基因，會(huì)發(fā)生高頻同源整合，上的外源基因，會(huì)發(fā)生高頻同源整合，整合子占轉(zhuǎn)化子整合子占轉(zhuǎn)化子總

23、數(shù)的總數(shù)的50-80%用于轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因用于轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因 營(yíng)養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基營(yíng)養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：因，如：LEU、TRP、HIS、LYS、URA 等等 但對(duì)于多倍體酵母來(lái)說(shuō)，篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型的受體非但對(duì)于多倍體酵母來(lái)說(shuō)，篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型的受體非常困難常困難營(yíng)養(yǎng)缺陷型的互補(bǔ)基因營(yíng)養(yǎng)缺陷型的互補(bǔ)基因用于轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因用于轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因其編碼產(chǎn)物只要是毒性物質(zhì)的抗性蛋白其編碼產(chǎn)物只要是毒性物質(zhì)的抗性蛋白顯性標(biāo)記基因顯性標(biāo)記基因 aph 氨基糖苷轉(zhuǎn)移酶氨基糖苷轉(zhuǎn)移酶 抗抗G418G418 cat 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶氯霉

24、素乙酰轉(zhuǎn)移酶 抗氯霉素抗氯霉素 dhfr 二氫葉酸還原酶二氫葉酸還原酶 抗氨甲喋呤和磺胺抗氨甲喋呤和磺胺 cup1 銅離子螯合物銅離子螯合物 耐受銅離子耐受銅離子 suc2 蔗糖轉(zhuǎn)化酶蔗糖轉(zhuǎn)化酶 耐受高濃度蔗糖耐受高濃度蔗糖 ilv2 乙酰乳糖合成酶乙酰乳糖合成酶 抗硫酰脲除草劑抗硫酰脲除草劑標(biāo)記基因標(biāo)記基因編碼產(chǎn)物編碼產(chǎn)物遺傳表型遺傳表型第二節(jié)第二節(jié) 常見(jiàn)的酵母基因表達(dá)系統(tǒng)常見(jiàn)的酵母基因表達(dá)系統(tǒng)一、一、 釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)1 1，啟動(dòng)子，啟動(dòng)子 組成型表達(dá)的啟動(dòng)子組成型表達(dá)的啟動(dòng)子：磷酸甘油酸激酶（：磷酸甘油酸激酶（PGKl）啟動(dòng)子）啟動(dòng)子、甘油醛磷酸脫氫酶（、甘油醛磷酸脫氫酶

25、（GAPDH或或GAPl）啟動(dòng)子）啟動(dòng)子 可控性啟動(dòng)子可控性啟動(dòng)子：半乳糖啟動(dòng)子（：半乳糖啟動(dòng)子（GALGAL）、酸性磷酸酶啟動(dòng)）、酸性磷酸酶啟動(dòng)子（子（PHOPHO）、乙醇脫氫酶（）、乙醇脫氫酶（ADH2ADH2）啟動(dòng)子、）啟動(dòng)子、CuCu2+2+螯合蛋白啟螯合蛋白啟動(dòng)子（動(dòng)子（CUPICUPI）以及交配）以及交配a a型阻遏系統(tǒng)（型阻遏系統(tǒng)（MATa/aMATa/a） 酵母菌啟動(dòng)子的可控性酵母菌啟動(dòng)子的可控性pho4TS-PHO5啟動(dòng)子啟動(dòng)子：釀酒酵母釀酒酵母PHO5啟動(dòng)子在培養(yǎng)基中游離磷酸鹽耗盡時(shí)才能打開(kāi)啟動(dòng)子在培養(yǎng)基中游離磷酸鹽耗盡時(shí)才能打開(kāi)PHO4基因編碼產(chǎn)物是基因編碼產(chǎn)物是PHO5

26、啟動(dòng)子的正調(diào)控因子啟動(dòng)子的正調(diào)控因子因此，裝在因此，裝在pho4TS-PHO5啟動(dòng)子下游的外源基因在啟動(dòng)子下游的外源基因在35時(shí)關(guān)閉時(shí)關(guān)閉2323誘導(dǎo)表達(dá)誘導(dǎo)表達(dá)溫度控制型啟動(dòng)子溫度控制型啟動(dòng)子PHO4溫度敏感型突變基因溫度敏感型突變基因pho4TS的編碼產(chǎn)物在的編碼產(chǎn)物在35時(shí)失活時(shí)失活酵母菌啟動(dòng)子的可控性酵母菌啟動(dòng)子的可控性a a a 型啟動(dòng)子釀酒酵母有a和a a兩種單倍體，分別由MATa和MATa a兩個(gè)等位基因決定。a a1因子決定a a細(xì)胞特征表達(dá)a a2因子阻遏a細(xì)胞特征表達(dá)a1-a2阻遏a a細(xì)胞特征表達(dá)編碼a a2因子的基因突變型hmla a2-102能產(chǎn)生a a2變體，它能滅

27、活a1，同時(shí)阻遏a型溫度控制型啟動(dòng)子溫度控制型啟動(dòng)子a 型啟動(dòng)子hmla a2-102 MATaa1Sir3-8TSa 型啟動(dòng)子 受體細(xì)胞基因組受體細(xì)胞基因組 重組質(zhì)重組質(zhì)粒粒a 型啟動(dòng)子hmla a2-102 MATaa1Sir3-8TSa 型啟動(dòng)子a a2a a12535（）酵母菌啟動(dòng)子的可控性酵母菌啟動(dòng)子的可控性釀酒酵母釀酒酵母超誘導(dǎo)型啟動(dòng)子超誘導(dǎo)型啟動(dòng)子GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80基因基底水平表達(dá)基因基底水平表達(dá)GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80半乳糖誘導(dǎo)時(shí)，半乳糖誘導(dǎo)時(shí)，GAL4高效表達(dá)，高效表達(dá)，GAL1、GAL1、GAL10超高效表達(dá)超高效表

28、達(dá)GAL10Promoter的半乳糖的半乳糖利用酶系利用酶系由由GAL1 GAL7和和 GAL10基因編碼基因編碼雜合啟動(dòng)子：雜合啟動(dòng)子：將釀酒酵母的乙醇脫氫酶將釀酒酵母的乙醇脫氫酶基因（基因（ADH2）所屬啟動(dòng)子的上游調(diào)控區(qū)與甘油醛）所屬啟動(dòng)子的上游調(diào)控區(qū)與甘油醛-3-磷酸脫磷酸脫氫酶基因（氫酶基因（GAPDH）所屬啟動(dòng)子的下游基本區(qū)重組）所屬啟動(dòng)子的下游基本區(qū)重組在一起，構(gòu)建出在一起，構(gòu)建出ADH2-GADPH型雜合啟動(dòng)子型雜合啟動(dòng)子 釀酒酵母表達(dá)載體釀酒酵母表達(dá)載體 目前已建立的釀酒酵母目前已建立的釀酒酵母表達(dá)載體有（表達(dá)載體有（1）酵母）酵母附加體質(zhì)粒附加體質(zhì)粒(YEp) （見(jiàn)（見(jiàn)右圖

29、）；（右圖）；（2）酵母復(fù)）酵母復(fù)制型質(zhì)粒制型質(zhì)粒(YRp)；（；（3）酵母著絲粒質(zhì)粒酵母著絲粒質(zhì)粒(YCp) ；（；（4）酵母整合型質(zhì)）酵母整合型質(zhì)粒粒 (YIp)；（；（5）酵母人）酵母人工染色體工染色體(YAC)。前三。前三類統(tǒng)稱為游離自主復(fù)制類統(tǒng)稱為游離自主復(fù)制型質(zhì)粒載體。含有來(lái)自型質(zhì)粒載體。含有來(lái)自酵母基因組的復(fù)制起始酵母基因組的復(fù)制起始區(qū)區(qū)ARS或者酵母天然質(zhì)或者酵母天然質(zhì)粒粒2m m復(fù)制起點(diǎn)序列，復(fù)制起點(diǎn)序列，能能夠自主復(fù)制，通常為多夠自主復(fù)制，通常為多拷貝數(shù)拷貝數(shù)釀酒酵母宿主釀酒酵母宿主 有些蛋白酶缺陷有利于重組異源蛋白的穩(wěn)定表有些蛋白酶缺陷有利于重組異源蛋白的穩(wěn)定表達(dá)。如達(dá)。

30、如pep4-3pep4-3突變株中蛋白酶的活性顯著降低突變株中蛋白酶的活性顯著降低，對(duì)外源基因表達(dá)產(chǎn)物的降解作用較小。，對(duì)外源基因表達(dá)產(chǎn)物的降解作用較小。 提高重組蛋白表達(dá)產(chǎn)率的突變宿主菌提高重組蛋白表達(dá)產(chǎn)率的突變宿主菌能導(dǎo)致釀酒酵母中重組蛋白產(chǎn)量提高或質(zhì)量改善的突變類型能導(dǎo)致釀酒酵母中重組蛋白產(chǎn)量提高或質(zhì)量改善的突變類型ssc1 改善重組蛋白分泌改善重組蛋白分泌 鈣離子依賴型的鈣離子依賴型的ATP酶酶ssc2 提高重組蛋白表達(dá)提高重組蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)錄后加工轉(zhuǎn)錄后加工rgr 1 提高重組蛋白表達(dá)提高重組蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)錄水平轉(zhuǎn)錄水平ose1 提高重組蛋白表達(dá)提高重組蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)錄水平轉(zhuǎn)錄水平ssc1

31、1 改善重組蛋白分泌改善重組蛋白分泌 羧肽酶羧肽酶Yrho- 提高重組蛋白表達(dá)提高重組蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)錄水平轉(zhuǎn)錄水平突變類型突變類型生物效應(yīng)生物效應(yīng)作用位點(diǎn)作用位點(diǎn)釀酒酵母宿主釀酒酵母宿主 為了減少目的蛋白的過(guò)度糖基化，目前已從為了減少目的蛋白的過(guò)度糖基化，目前已從野生型的釀酒酵母中分離出許多類型的糖基化途野生型的釀酒酵母中分離出許多類型的糖基化途徑突變株，如甘露聚糖合成缺陷型的徑突變株，如甘露聚糖合成缺陷型的mnn突變株突變株、天門(mén)冬酰胺側(cè)鏈糖基化缺陷的、天門(mén)冬酰胺側(cè)鏈糖基化缺陷的alg突變株以及外突變株以及外側(cè)糖鏈缺陷型的側(cè)糖鏈缺陷型的och突變株等。在這些突變株中，突變株等。在這些突變株中，

32、具有重要實(shí)用價(jià)值的是具有重要實(shí)用價(jià)值的是mnn9、och1、och2、alg1和和alg2，因?yàn)樗鼈儾荒茉诋愒吹鞍椎奶扉T(mén)冬酰胺側(cè)，因?yàn)樗鼈儾荒茉诋愒吹鞍椎奶扉T(mén)冬酰胺側(cè)鏈上延長(zhǎng)甘露多聚糖長(zhǎng)鏈。鏈上延長(zhǎng)甘露多聚糖長(zhǎng)鏈。 抑制超糖基化作用的突變宿主菌抑制超糖基化作用的突變宿主菌能抑制超糖基化的突變類型能抑制超糖基化的突變類型mnn 甘露糖生物合成缺陷型甘露糖生物合成缺陷型alg 天冬酰胺側(cè)鏈糖基化缺陷型天冬酰胺側(cè)鏈糖基化缺陷型och 外側(cè)糖鏈添加缺陷型外側(cè)糖鏈添加缺陷型突變類型突變類型生物效應(yīng)生物效應(yīng) 許多真核生物的蛋白質(zhì)在其天冬酰胺側(cè)鏈上接有寡糖基團(tuán)，許多真核生物的蛋白質(zhì)在其天冬酰胺側(cè)鏈上接有寡糖

33、基團(tuán)，它們常常影響蛋白質(zhì)的生物活性。整個(gè)糖單位由它們常常影響蛋白質(zhì)的生物活性。整個(gè)糖單位由糖基核心糖基核心和和外側(cè)糖外側(cè)糖鏈兩部分組成。鏈兩部分組成。 酵母菌普遍擁有蛋白酵母菌普遍擁有蛋白質(zhì)的糖基化系統(tǒng)，但野生質(zhì)的糖基化系統(tǒng)，但野生型釀酒酵母對(duì)異源蛋白的型釀酒酵母對(duì)異源蛋白的糖基化反應(yīng)很難控制，呈糖基化反應(yīng)很難控制，呈超糖基化超糖基化傾向，因此超糖傾向，因此超糖基化缺陷株非常重要?；毕葜攴浅Ｖ匾p少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解作用泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解作用蛋白酶體蛋白酶體LysHOOCUbiquitin 76 aa ubiqu

34、itin ligase E3 Lysubiquitin ligase E3 Lys靶蛋白靶蛋白靶蛋白減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌酵母菌泛素依賴型蛋白降解系統(tǒng)的編碼基因酵母菌泛素依賴型蛋白降解系統(tǒng)的編碼基因酵母菌有四個(gè)泛素編碼基因：酵母菌有四個(gè)泛素編碼基因：UBI 1 編碼編碼泛素泛素-羧基延伸蛋白羧基延伸蛋白52（CEP52） 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期表達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期表達(dá) 穩(wěn)定期關(guān)閉穩(wěn)定期關(guān)閉UBI 2 編碼編碼泛素泛素-羧基延伸蛋白羧基延伸蛋白52（CEP52） 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期表達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期表達(dá) 穩(wěn)定期關(guān)閉穩(wěn)定期關(guān)閉UBI 3 編碼編碼泛素泛素-羧基延伸蛋白羧基延

35、伸蛋白76（CEP76） 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期表達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期表達(dá) 穩(wěn)定期關(guān)閉穩(wěn)定期關(guān)閉UBI 4 編碼編碼泛素五聚體泛素五聚體 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期關(guān)閉對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期關(guān)閉 穩(wěn)定期表達(dá)穩(wěn)定期表達(dá)酵母菌有七個(gè)泛素連接酶基因：酵母菌有七個(gè)泛素連接酶基因：UBC 1、UBC 2、UBC 3、UBC 4、UBC 5、UBC 6、UBC 7減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌泛素降解途徑衰減的釀酒酵母泛素降解途徑衰減的釀酒酵母釀酒酵母菌中，泛素主要由釀酒酵母菌中，泛素主要由UBI 4基因表達(dá)，基因表達(dá)，UBI 4-突變株能突變株能UBI 4缺陷型缺陷型： 外源基因表達(dá)理想的受體外源基因表達(dá)

36、理想的受體正常生長(zhǎng)，但細(xì)胞內(nèi)游離泛素分子的濃度比野生株要低得多，正常生長(zhǎng)，但細(xì)胞內(nèi)游離泛素分子的濃度比野生株要低得多，UBA 1缺陷型缺陷型：減少蛋白降解：減少蛋白降解UBA1編碼泛素激活酶編碼泛素激活酶E1，UBA1突變株是致死性的，但其等位突變株是致死性的，但其等位基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介導(dǎo)的蛋白降解基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介導(dǎo)的蛋白降解Ubc4 - ubc5 雙突變型：雙突變型： 減少蛋白降解減少蛋白降解七個(gè)泛素連接酶基因的突變對(duì)衰減蛋白降解作用同樣有效七個(gè)泛素連接酶基因的突變對(duì)衰減蛋白降解作用同樣有效二、畢赤酵母（二、畢赤酵母（Pichia pastori

37、s）表達(dá)系統(tǒng)）表達(dá)系統(tǒng) 1. 1. 啟動(dòng)子啟動(dòng)子 （1） AOX1和和AOX2啟動(dòng)子啟動(dòng)子（2）三磷酸甘油醛脫氫酶（）三磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldeyde 3-phosphate dehydrogenase ，GAPDH）啟動(dòng)子）啟動(dòng)子 （3）甲醛脫氫酶（）甲醛脫氫酶（formaldehyde dehydrogenase, FLD）啟動(dòng)子）啟動(dòng)子2 2 畢赤酵母表達(dá)載體類型畢赤酵母表達(dá)載體類型胞內(nèi)表達(dá)載體胞內(nèi)表達(dá)載體pPICZ A,B,C 分泌型表達(dá)載體分泌型表達(dá)載體pPICZa a A,B,C 畢赤酵母表達(dá)載體上無(wú)酵母復(fù)制起點(diǎn)，它是靠畢赤酵母表達(dá)載體上無(wú)酵母復(fù)制起點(diǎn)，它是靠AOX1

38、或或HIS4基因的位置同源重組整合入酵母染基因的位置同源重組整合入酵母染色體色體DNA中，并隨酵母的生長(zhǎng)傳代穩(wěn)定地存在。中，并隨酵母的生長(zhǎng)傳代穩(wěn)定地存在。整合的方式可以是單交換插入，亦可雙交換插入整合的方式可以是單交換插入，亦可雙交換插入，一般來(lái)說(shuō)前一種方式更容易發(fā)生，一般來(lái)說(shuō)前一種方式更容易發(fā)生 。3 3 載體的整合方式載體的整合方式依據(jù)具體整合位點(diǎn)及相應(yīng)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子的類型可依據(jù)具體整合位點(diǎn)及相應(yīng)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子的類型可分為三種情況：分為三種情況：5 AOX1和和3 AOX1與染色體發(fā)生同源重組，使受體染色體帶有與染色體發(fā)生同源重組，使受體染色體帶有一個(gè)拷貝的外源基因。這種情況有功能的一個(gè)拷貝的

39、外源基因。這種情況有功能的AOX1基因被替換而丟基因被替換而丟失后，只能利用弱的失后，只能利用弱的AOX2基因啟動(dòng)合成基因啟動(dòng)合成AOX，就產(chǎn)生，就產(chǎn)生His+MutS表型表型(methanol utilization slow)，在含甲醇的培養(yǎng)基中，在含甲醇的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)緩慢。此時(shí)，甲醇利用率很低，但它表達(dá)外源基因的效率生長(zhǎng)緩慢。此時(shí)，甲醇利用率很低，但它表達(dá)外源基因的效率高高染色體染色體HIS4基因與載體的基因與載體的HIS4基因發(fā)生置換，使得一個(gè)或多個(gè)基因發(fā)生置換，使得一個(gè)或多個(gè)表達(dá)單位插入在表達(dá)單位插入在his4位點(diǎn)，產(chǎn)生的表型也是位點(diǎn)，產(chǎn)生的表型也是His+ Mut+染色體染色體AO

40、X1區(qū)與載體質(zhì)粒的區(qū)與載體質(zhì)粒的AOX1區(qū)發(fā)生單位點(diǎn)互交換，外源區(qū)發(fā)生單位點(diǎn)互交換，外源基因的表達(dá)單位插入在基因區(qū)基因的表達(dá)單位插入在基因區(qū)AOX1基因的上游或下游，這一過(guò)基因的上游或下游，這一過(guò)程可重復(fù)發(fā)生，使得更多拷貝的表達(dá)單位插入基因組中。這種程可重復(fù)發(fā)生，使得更多拷貝的表達(dá)單位插入基因組中。這種情況情況AOX1基因仍然有活性，在含甲醇的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)正常，產(chǎn)基因仍然有活性，在含甲醇的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)正常，產(chǎn)生的表型是生的表型是His+Mut+。 在畢赤酵母中有在畢赤酵母中有3種方法可以得到多拷貝表達(dá)菌株。種方法可以得到多拷貝表達(dá)菌株。 第一種方法直接構(gòu)建含高拷貝外源基因的表達(dá)載體，在體第一種

41、方法直接構(gòu)建含高拷貝外源基因的表達(dá)載體，在體外利用同尾酶向載體中多次插入首尾相連的表達(dá)盒。此法的優(yōu)外利用同尾酶向載體中多次插入首尾相連的表達(dá)盒。此法的優(yōu)點(diǎn)是一次整合，即可有多個(gè)表達(dá)盒插入染色體。但體外基因操點(diǎn)是一次整合，即可有多個(gè)表達(dá)盒插入染色體。但體外基因操作較繁瑣。作較繁瑣。 第二種方法是利用含有第二種方法是利用含有kanr基因的載體。細(xì)菌來(lái)源的卡那霉基因的載體。細(xì)菌來(lái)源的卡那霉素抗性基因在酵母中賦予宿主抵抗真核抗生素素抗性基因在酵母中賦予宿主抵抗真核抗生素G418。G418的抗的抗性水平大致與載體的拷貝數(shù)相關(guān)。提高抗生素性水平大致與載體的拷貝數(shù)相關(guān)。提高抗生素G418的濃度可以的濃度可以

42、得到含高拷貝表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化菌株。得到含高拷貝表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化菌株。 第三種方法是用含有第三種方法是用含有Zeocin抗性標(biāo)記基因抗性標(biāo)記基因Sh ble的載體來(lái)構(gòu)的載體來(lái)構(gòu)建多拷貝菌株。來(lái)源于細(xì)菌的建多拷貝菌株。來(lái)源于細(xì)菌的Sh ble在酵母中賦予宿主對(duì)抗生素在酵母中賦予宿主對(duì)抗生素zeocin的抵抗能力，通過(guò)提高的抵抗能力，通過(guò)提高zeocin濃度可篩選出含高拷貝表達(dá)濃度可篩選出含高拷貝表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化菌株。然而與載體的轉(zhuǎn)化菌株。然而與G418篩選相似，大多數(shù)能抵抗高水平篩選相似，大多數(shù)能抵抗高水平 zeocin 的轉(zhuǎn)化子并不含有多載體拷貝。的轉(zhuǎn)化子并不含有多載體拷貝。 4 4 宿宿 主主 常用

43、的畢赤酵母受體菌株有：組氨酸缺陷型常用的畢赤酵母受體菌株有：組氨酸缺陷型GSl15和和SMD1168，腺，腺嘌呤缺陷型嘌呤缺陷型PMAD11，PMAD16， 其中其中SMD1168為蛋白酶缺陷型，以為蛋白酶缺陷型，以其作為宿主表達(dá)蛋白可以降低表達(dá)產(chǎn)物的降解。這些表達(dá)宿主都是由野其作為宿主表達(dá)蛋白可以降低表達(dá)產(chǎn)物的降解。這些表達(dá)宿主都是由野生品系生品系NRRL-Y11430衍生來(lái)的。最常用的受體菌是衍生來(lái)的。最常用的受體菌是Cregg在在1985年建立年建立的的GS115，它含有一個(gè)組氨醇脫氫酶缺陷型基因，它含有一個(gè)組氨醇脫氫酶缺陷型基因His4，可接受含，可接受含His4 的的載體而具有載體而

44、具有 His+表型來(lái)篩選轉(zhuǎn)化子。表型來(lái)篩選轉(zhuǎn)化子。 根據(jù)對(duì)根據(jù)對(duì)甲醇利用的情況甲醇利用的情況，畢赤酵母可劃分為三種表型。菌株含有，畢赤酵母可劃分為三種表型。菌株含有AOX1和和AOX2基因，在含甲醇的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速率與野生型類似，稱基因，在含甲醇的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速率與野生型類似，稱為為甲醇利用正表型（甲醇利用正表型（Mut+），），如如GS115；當(dāng)；當(dāng)AOX1被其他基因取代，則被其他基因取代，則需依賴需依賴AOX2，但其甲醛代謝速度慢，稱為，但其甲醛代謝速度慢，稱為甲醇利用慢表型（甲醇利用慢表型（Muts），），如如KM71。當(dāng)。當(dāng)AOX基因全部缺失，則不能利用甲醇，稱為基因全部缺失，則不能利

45、用甲醇，稱為甲醇利用負(fù)表甲醇利用負(fù)表型（型（Mut-），如，如MC100-3。后兩者胞內(nèi)表達(dá)外源蛋白質(zhì)有時(shí)優(yōu)于野生株。后兩者胞內(nèi)表達(dá)外源蛋白質(zhì)有時(shí)優(yōu)于野生株，且需甲醇較少。，且需甲醇較少。 此外為增加分泌蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，避免被宿主蛋白酶降解，可使用蛋此外為增加分泌蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，避免被宿主蛋白酶降解，可使用蛋白酶缺陷型菌株，如白酶缺陷型菌株，如SMD1168(his4, prb1)。 第三節(jié)第三節(jié) 影響外源基因表達(dá)的因素影響外源基因表達(dá)的因素外源基因穩(wěn)態(tài)外源基因穩(wěn)態(tài)mRNA的濃度的濃度優(yōu)化翻譯起始區(qū)前后優(yōu)化翻譯起始區(qū)前后mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，提高的二級(jí)結(jié)構(gòu)，提高外源基因外源基因mRNA的翻譯活性的翻

46、譯活性酵母菌對(duì)密碼子的偏愛(ài)性酵母菌對(duì)密碼子的偏愛(ài)性在釀酒酵母中，高豐度的蛋白質(zhì)（如甘油醛在釀酒酵母中，高豐度的蛋白質(zhì)（如甘油醛-3-磷酸脫氫酶磷酸脫氫酶GAPDH、磷酸甘油激酶磷酸甘油激酶PKG、乙醇脫氫酶乙醇脫氫酶ADH）中中96%以上的氨基酸是由以上的氨基酸是由25個(gè)密碼子編碼的個(gè)密碼子編碼的一、轉(zhuǎn)錄水平控制一、轉(zhuǎn)錄水平控制二、表達(dá)載體的拷貝數(shù)和穩(wěn)定性二、表達(dá)載體的拷貝數(shù)和穩(wěn)定性三、其他因素三、其他因素優(yōu)化工程菌發(fā)酵工藝優(yōu)化工程菌發(fā)酵工藝 避免表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的降解，選擇或改造宿主，如避免表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的降解，選擇或改造宿主，如：采用二倍體宿主、采用釀酒酵母以外的酵母菌作為：采用二倍體宿

47、主、采用釀酒酵母以外的酵母菌作為宿主宿主第三節(jié)第三節(jié) 影響外源基因表達(dá)的因素影響外源基因表達(dá)的因素 利用重組利用重組酵母生產(chǎn)乙肝疫苗酵母生產(chǎn)乙肝疫苗第四節(jié)第四節(jié) 酵母基因工程應(yīng)用實(shí)例酵母基因工程應(yīng)用實(shí)例 由由乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的急慢性乙型肝炎是一種嚴(yán)重感染引起的急慢性乙型肝炎是一種嚴(yán)重的傳染病，每年約有的傳染病，每年約有200萬(wàn)萬(wàn)病人死亡，并有病人死亡，并有3億億人成為人成為HBV攜帶者，其攜帶者，其中相當(dāng)一部分人可能轉(zhuǎn)化為肝硬化或肝癌患者。目前對(duì)乙型肝炎病毒中相當(dāng)一部分人可能轉(zhuǎn)化為肝硬化或肝癌患者。目前對(duì)乙型肝炎病毒還沒(méi)有一種有效的治療藥物，因此高純度乙型疫苗的生產(chǎn)對(duì)

48、預(yù)防病毒還沒(méi)有一種有效的治療藥物，因此高純度乙型疫苗的生產(chǎn)對(duì)預(yù)防病毒感染具有重大的社會(huì)效益，而利用重組酵母大規(guī)模生產(chǎn)乙型疫苗為其感染具有重大的社會(huì)效益，而利用重組酵母大規(guī)模生產(chǎn)乙型疫苗為其廣泛應(yīng)用提供了可靠的保證。廣泛應(yīng)用提供了可靠的保證。 利用重組利用重組酵母生產(chǎn)乙肝疫苗酵母生產(chǎn)乙肝疫苗產(chǎn)乙肝表面抗原的重組釀酒酵母產(chǎn)乙肝表面抗原的重組釀酒酵母乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)產(chǎn)乙肝表面抗原的重組巴斯德畢赤酵母產(chǎn)乙肝表面抗原的重組巴斯德畢赤酵母乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)與性質(zhì) 乙肝病毒是一種蛋白包裹型的雙鏈乙肝病毒是一種蛋白包裹型的雙鏈DNA病毒，病毒顆粒呈病毒，

49、病毒顆粒呈乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)球面狀，直徑為球面狀，直徑為42 nm，基因組僅為基因組僅為3.2 kb。病毒顆粒的主要病毒顆粒的主要結(jié)構(gòu)蛋白是表面抗原多肽（結(jié)構(gòu)蛋白是表面抗原多肽（HBsAg）或）或S多肽，它具有糖基化多肽，它具有糖基化和非糖基化兩種形式。顆粒內(nèi)的蛋白包括核心抗原（和非糖基化兩種形式。顆粒內(nèi)的蛋白包括核心抗原（ HBcAg ）、 此外，被乙肝病毒感染的人肝臟還能合成并釋放大量的此外，被乙肝病毒感染的人肝臟還能合成并釋放大量的22病毒病毒DNA聚合酶、微量病毒蛋白。聚合酶、微量病毒蛋白。nm的空殼亞病毒顆粒，其免疫原性是各種未裝配的包裝蛋白的的空殼亞病毒顆粒，其免

50、疫原性是各種未裝配的包裝蛋白的1000倍。包裝蛋白共有三種轉(zhuǎn)膜糖蛋白：倍。包裝蛋白共有三種轉(zhuǎn)膜糖蛋白：S、M、L多肽多肽。乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)乙型肝炎病毒的包裝蛋白編碼基因乙型肝炎病毒的包裝蛋白編碼基因ATGATGATGTAA108 aa55 aa226 aapreS1preS2SS 多肽226 aaM 多肽281 aaL 多肽399 aa乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)與性質(zhì) 乙肝病毒在體外細(xì)胞培養(yǎng)基中并不能繁殖，因此第一代的乙肝病毒在體外細(xì)胞培養(yǎng)基中并不能繁殖，因此第一代的傳統(tǒng)乙肝疫苗的制備乙肝疫苗是從病毒攜帶者的肝細(xì)胞膜上提取出來(lái)的。這種來(lái)源的乙肝疫苗是從病毒攜帶者的肝細(xì)胞

51、膜上提取出來(lái)的。這種來(lái)源的疫苗具有較高的免疫原性，但由于原材料的限制難以大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化。疫苗具有較高的免疫原性，但由于原材料的限制難以大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化。產(chǎn)乙肝表面抗原的重組釀酒酵母產(chǎn)乙肝表面抗原的重組釀酒酵母 20世紀(jì)世紀(jì)80年代開(kāi)始選擇釀酒酵母表達(dá)重組年代開(kāi)始選擇釀酒酵母表達(dá)重組HBsAg，主要工作包括主要工作包括將將S多肽的編碼置于多肽的編碼置于ADH1啟動(dòng)子控制下，轉(zhuǎn)化子能表達(dá)出具有免疫活啟動(dòng)子控制下，轉(zhuǎn)化子能表達(dá)出具有免疫活性的重組蛋白，它在細(xì)胞提取物中以球形脂蛋白顆粒的形式存在，平性的重組蛋白，它在細(xì)胞提取物中以球形脂蛋白顆粒的形式存在，平均顆粒直徑為均顆粒直徑為 22 nm，其結(jié)構(gòu)和形態(tài)

52、均與慢性乙肝病毒攜帶者血清中其結(jié)構(gòu)和形態(tài)均與慢性乙肝病毒攜帶者血清中的病毒顆粒相同。的病毒顆粒相同。 目前，由釀酒酵母生產(chǎn)的重組目前，由釀酒酵母生產(chǎn)的重組HBsAgHBsAg顆粒的最終產(chǎn)量可達(dá)細(xì)胞顆粒的最終產(chǎn)量可達(dá)細(xì)胞總蛋白量的總蛋白量的1%-2%1%-2%。 進(jìn)一步的研究表明，進(jìn)一步的研究表明，M M多肽和多肽和L L多肽對(duì)多肽對(duì)S S型疫苗型疫苗具有顯著的增效作具有顯著的增效作用，由三者（或兩者）構(gòu)成的用，由三者（或兩者）構(gòu)成的復(fù)合型乙肝疫苗復(fù)合型乙肝疫苗還可以誘導(dǎo)那些對(duì)還可以誘導(dǎo)那些對(duì) S抗抗原缺乏響應(yīng)的人群的免疫反應(yīng)。原缺乏響應(yīng)的人群的免疫反應(yīng)。產(chǎn)乙肝表面抗原的重組巴斯德畢赤酵母產(chǎn)乙肝

53、表面抗原的重組巴斯德畢赤酵母整合型重組巴斯德畢赤酵母的構(gòu)建PARS2Bgl II5 AOX1HBsAgPHIS43 AOX1Bgl IIpBSAG15111 kbBgl II5 AOX1 HBsAgPHIS43 AOX1his+的轉(zhuǎn)化子重組分子轉(zhuǎn)化his-的受體細(xì)胞染色體DNA產(chǎn)乙肝表面抗原的重組巴斯德畢赤酵母產(chǎn)乙肝表面抗原的重組巴斯德畢赤酵母 由于巴斯德畢赤酵母染色體由于巴斯德畢赤酵母染色體DNA上還擁有第二個(gè)乙醇氧化酶基因上還擁有第二個(gè)乙醇氧化酶基因AOX2，所以整合型重組菌仍能在含有甲醇的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。所以整合型重組菌仍能在含有甲醇的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。 重組菌首先在含有甘油的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待甘油耗盡后，加入甲重組菌首先在含有甘油的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，