基因工程復(fù)習(xí)匯總

1、基因工程一、名詞解釋1. 基因: 是DNA分子中含有特定遺傳信息的一段核苷酸序列，是遺傳物質(zhì)的最小功能單位。2. 定位克隆: 獲取基因在染色體上的位置信息，然后采用各種方法對(duì)該基因進(jìn)行定位和克隆 3.DNA重組：是由于不同DNA鏈的斷裂和連接而產(chǎn)生DNA片段的交換和重新組合，形成新DNA分子的過程。 4.克?。嚎茖W(xué)家把人工遺傳操作動(dòng)物繁殖的過程叫克隆，這門生物技術(shù)叫克隆技術(shù)，其本身的含義是無性繁殖，即由同一個(gè)祖先細(xì)胞分裂繁殖而形成的純細(xì)胞系，該細(xì)胞系中每個(gè)細(xì)胞的基因彼此相同。 5.DNA克?。簯?yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)同源或異源、原核或真核、天然或人工的DNA與載體DNA相結(jié)合

2、成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子復(fù)制子，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞、篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增、提取獲得大量同一DNA分子，即DNA克隆。 5. 融合基因: 是指應(yīng)用DNA體外重組技術(shù)構(gòu)建的一類具有來自兩個(gè)或兩個(gè)以上的不同基因核苷酸序列的新型基因。6. RT-PCR: 是指以mRNA在反轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA第一鏈為模板進(jìn)行的PCR。7. ORF : 起始于AUG、止于UAA、UGA、UAG的連續(xù)的密碼子區(qū)域，是潛在的編碼區(qū)。8. MCS: 指載體上人工合成的含有緊密排列的多種限制核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)的DNA片段。9.基因工程：在體外把核酸分子（DNA的分離、合成）插入載體分

3、子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合（重組DNA），引入原先沒有這類分子的受體細(xì)胞內(nèi)，穩(wěn)定地復(fù)制表達(dá)繁殖，培育符合人們需要的新品種（品系），生產(chǎn)人類急需的藥品、食品、工業(yè)品等。10. 5RACE: 是一種通過PCR進(jìn)行cDNA末端快速克隆的技術(shù)，是以mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈后用PCR技術(shù)擴(kuò)增出某個(gè)特異位點(diǎn)到5端之間未知序列的方法。11.cDNA library:cDNA文庫：是指某生物某一發(fā)育時(shí)期所轉(zhuǎn)錄形成的cDNA片段與某種載體連接而成的克隆的集合。12.載體：能載帶微量物質(zhì)共同參與某種化學(xué)或物理過程的常量物質(zhì)，在基因工程重組DNA技術(shù)中將DNA片段（目的基因）轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞的一種能自我復(fù)制

4、的DNA分子。三種最常用的載體是細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體和動(dòng)植物病毒。13.基因診斷：又稱DNA診斷或分子診斷，通過分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)，直接檢測(cè)出分子結(jié)構(gòu)水平和表達(dá)水平是否異常，從而對(duì)疾病做出判斷。14.限制性核酸內(nèi)切酶：是由細(xì)菌產(chǎn)生的一類能特異識(shí)別雙鏈DNA中的特定堿基序列，并在識(shí)別位點(diǎn)切割磷酸二酯鍵的核酸內(nèi)切酶(簡(jiǎn)稱限制酶)。 15.基因文庫：將所有的重組DNA分子都導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，得到分子克隆的混合體，這樣一個(gè)混合體稱為基因文庫。 16.cDNA文庫：從組織細(xì)胞中分離得到純化的mRNA，然后以mRNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成其互補(bǔ)DNA，再復(fù)制成雙鏈cDNA片段，與適當(dāng)載體連接后

5、導(dǎo)入受體菌內(nèi)，擴(kuò)增，構(gòu)建cDNA文庫。 17.RFLP：RFLP標(biāo)記是發(fā)展最早的DNA標(biāo)記技術(shù)。RFLP是指基因型之間限制性片段長度的差異，這種差異是由限制性酶切位點(diǎn)上堿基的插入、缺失、重排或點(diǎn)突變所引起的。 18.核酸探針：是指與特定的靶分子發(fā)生特異性相互作用，并可被特殊的方法探知的分子?？贵w-抗原、生物素-抗生物素蛋白、生長因子-受體的相互作用都可以看作是探針與靶分子的相互作用。 19.Shuttle plasmid vector穿梭質(zhì)粒載體：指一類由人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)的選擇標(biāo)記，因而可在兩種不同宿主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。20.限制與修飾系統(tǒng)：限制酶的生物學(xué)功能一般被認(rèn)為

6、是用來保護(hù)宿主細(xì)胞不受外源DNA的感染，可講解外來DNA，從而阻止其復(fù)制和整合到細(xì)胞中。一般來說，與限制酶相伴而生的修飾酶是甲基轉(zhuǎn)移酶，或者說是甲基化酶，能保護(hù)自身的DNA不被講解。限制酶和甲基轉(zhuǎn)移酶組成限制與修飾系統(tǒng)。21.星活性：在極端非標(biāo)準(zhǔn)條件下，限制酶能切割與識(shí)別序列相似的序列，這個(gè)改變的特征稱為星星活性。二、簡(jiǎn)答題1.載體的分類按功能分：克隆載體：（主要用于擴(kuò)增或保存DNA片段，是最簡(jiǎn)單的載體。具有強(qiáng)大的包裝能力） 表達(dá)載體：（帶有目標(biāo)細(xì)胞識(shí)別的啟動(dòng)子） 其他載體：（整合載體、穿梭載體等） 按進(jìn)入受體細(xì)胞類型分（1）原核載體（2）真核載體（3）穿梭載體按來源分： 質(zhì)粒（細(xì)菌等原核生物

7、染色體外遺傳物質(zhì)） 噬菌體（原核細(xì)胞的病毒） 真核病毒（真核細(xì)胞的病毒） 人工遺傳物質(zhì)（噬菌粒、粘粒、細(xì)菌、酵母等）2、基因克隆載體必備條件：1）具有多種單一核酸內(nèi)切酶切割位點(diǎn)（多克隆位點(diǎn)）一個(gè)或多個(gè))外源DNA插入，不影響載體復(fù)制。2）能攜帶外源DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞能自我復(fù)制，或整合到染色體隨受體細(xì)胞DNA復(fù)制而復(fù)制。3）有選擇克隆子的標(biāo)記基因（篩選標(biāo)記）。4）分子量小，拷貝數(shù)高，易從宿主細(xì)胞中分離。5）安全性(不含損害受體的基因,不任意轉(zhuǎn)入別的,尤其人的細(xì)胞)。 3、表達(dá)載體和基因工程一般克隆載體在元件構(gòu)成上有何差別？表達(dá)載體：?jiǎn)?dòng)子；終止子；核糖體結(jié)合位點(diǎn)（SD序列）；篩選標(biāo)記；復(fù)制子

8、（質(zhì)粒拷貝數(shù)）；多克隆位點(diǎn)克隆載體：篩選標(biāo)記；復(fù)制子（質(zhì)?？截悢?shù)）；多克隆位點(diǎn)4、原核表達(dá)載體與真核表達(dá)載體及穿梭載體的區(qū)別1)真核表達(dá)載體和原核表達(dá)載體就是能在真核生物或原核生物中表達(dá)的載體,它們一般都帶有能在真核生物或原核生物中表達(dá)的必需表達(dá)元件;2)真核表達(dá)和原核表達(dá)的目的都是為了能夠大量獲得自己所需要的目的基因的表達(dá)產(chǎn)物,最好有生物活性,以便下一步的實(shí)驗(yàn)需要.3)原核表達(dá)載體一般只能在原核生物中表達(dá)外源基因,但有些穿梭載體可以分別在真核和原核生物中表達(dá)它們的表達(dá)元件.5、什么是包涵體？重組蛋白在胞內(nèi)表達(dá)時(shí)，常常以不溶性蛋白聚集成的晶狀物形式存在，這種晶狀體即包涵體。包涵體的形成是外源蛋

9、白的高效表達(dá)時(shí)的普遍現(xiàn)象，這是由于肽鏈折疊過程中部分折疊的中間態(tài)發(fā)生了錯(cuò)誤聚合，而不是形成成熟的天然態(tài)或完全解鏈的蛋白。探針標(biāo)記的方法：（1）缺口平移法 （Nick Translation）原理及過程：反應(yīng)體系中DNA酶I隨機(jī)在探針DNA上打開缺口，然后利用DNA聚合酶I 5 3外切酶活性，在缺口處按5 3方向切除單核苷酸；同時(shí)DNA聚合酶I有5 3的聚合酶活性，在缺口處3端加入底物中的單核苷酸，彌補(bǔ)缺口處的核苷酸鏈。隨著反應(yīng)的進(jìn)行底物中被標(biāo)記單核苷酸，并被隨機(jī)摻入。DNA聚合酶I的兩種作用交替進(jìn)行，探針即被標(biāo)記。（2）隨機(jī)引物法（6核苷酸引物標(biāo)記法）原理及過程：利用E.coli DNA聚合酶

10、I的Klenow亞單位，合成含有標(biāo)記核苷酸的DNA鏈。Klenow具有5 3聚合酶活性。被標(biāo)記的DNA（探針）變性成單鏈，引物與模板結(jié)合。在Klenow的催化下，以引物3端為起點(diǎn)，沿模板3 5方向合成DNA新鏈。反應(yīng)體系中含有標(biāo)記的dNTP,隨機(jī)摻入新合成的DNA鏈中，探針即被標(biāo)記。（3）末端標(biāo)記多核苷酸激酶的用途:DNA5'-OH端磷酸化、標(biāo)記DNA的5端。包括正向反應(yīng)和交換反應(yīng)標(biāo)記法6、PCR反應(yīng)的基本原理：1）變性：在PCR反應(yīng)體系中，通過加熱使溫度至95左右，使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA作為反應(yīng)模板。2）退火：PCR反應(yīng)中，經(jīng)變性后將溫度降至引物的TM值左右或以下，

11、引物與DNA模板互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合，形成雜交鏈的過程。 3）延伸：當(dāng)反應(yīng)體系溫度升至70左右時(shí)，TaqDNA聚合酶催化以引物為起始點(diǎn)的53延伸反應(yīng)，形成新生DNA鏈。7、引物設(shè)計(jì)的基本原則最大限度地提高擴(kuò)增效率和特異性，同時(shí)盡可能抑制非特異性擴(kuò)增。（1）引物長度一般為1530個(gè)核苷酸。 （2）堿基隨機(jī)分布，避免出現(xiàn)嘌呤，嘧啶的堆積現(xiàn)象。G+C的含量為4555%。（3端和5端引物具有相似的Tm值。Tm=4（G+C）+2（A+T）。引物長度要確保解鏈溫度不低于54°C。）（3）兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其應(yīng)避免3端的互補(bǔ)重疊，連續(xù)互補(bǔ)序列一般不超過3bp。（4）引物的堿基序列不應(yīng)與非擴(kuò)增

12、區(qū)域有同源性。（5）引物3端堿基一定要與模板DNA配對(duì)，最佳堿基選G和C而不用A。（6）引物的5端沒有嚴(yán)格限制，可以修飾，如加限制酶位點(diǎn)，引入突變位點(diǎn)，起始密碼子，終止密碼子等。8簡(jiǎn)述獲得目的基因常用的幾種方法。（5分）（1）直接從染色體DNA中分離：（1分）僅適用于原核生物、葉綠體和線粒體基因的分離，較少采用。 （2）人工合成：（1分）根據(jù)已知多肽鏈的氨基酸順序，利用遺傳密碼表推定其核苷酸順序再進(jìn)行人工合成。適應(yīng)于編碼小分子多肽的基因。 （3）從mRNA合成cDNA：（1分）采用一定的方法釣取特定基因的mRNA，再通過逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成其互補(bǔ)DNA（cDNA），除去RNA鏈后，再用DNA聚合酶

13、合成其互補(bǔ)DNA鏈，從而得到雙鏈DNA。這一方法通?？傻玫娇杀磉_(dá)的完整基因。 （4）利用PCR合成：（1分）如已知目的基因兩端的序列，則可采用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)技術(shù)，在體外合成目的基因。 （5）從基因文庫中篩選：（1分）首先建立基因組或cDNA文庫，利用探針從文庫中篩選目的克隆。9. 分子克隆載體應(yīng)具備哪些特點(diǎn)？（4分）(1) 在宿主細(xì)胞內(nèi)必須能夠自主復(fù)制（1分）(2) 必須具備合適的酶切位點(diǎn)，供外源DNA片段插入，同時(shí)不影響其復(fù)制（1分）(3) 有一定的選擇標(biāo)記，用于篩選（1分）(4) 具有較高的拷貝數(shù)，便于載體的制備（1分）10. 受

14、體細(xì)胞選擇的基本原則 便于重組DNA分子的導(dǎo)入便于DNA分子的穩(wěn)定存在便于重組體篩選遺傳穩(wěn)定性高,易于擴(kuò)大培養(yǎng)安全性高,無致病性內(nèi)源水解酶缺失或蛋白酶低受體細(xì)胞遺傳密碼無偏性較好的轉(zhuǎn)譯和加工機(jī)制較大研究與應(yīng)用價(jià)值11、 cDNA文庫和基因組文庫的主要差別有哪些？（5分）（1）基因組文庫克隆的是任何基因，包括未知功能的DNA序列；cDNA文庫克隆的是具有蛋白質(zhì)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)基因，包括調(diào)節(jié)基因。（2分）（2）基因組文庫克隆的是全部遺傳信息，不受時(shí)空影響；cDNA文庫克隆的是不完全的編碼DNA序列，因它受發(fā)育和調(diào)控因子的影響。（1分）（3）基因組文庫中的編碼基因是真實(shí)基因，含有內(nèi)含子和外顯子，而cDNA

15、文庫克隆的是不含內(nèi)含子的功能基因。（2分）12、分析比較瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳的異同點(diǎn)？答：同：原理相同。瓊脂糖、聚丙烯酰胺均為無反應(yīng)活性的穩(wěn)定支持介質(zhì)，可降低對(duì)流運(yùn)動(dòng)，故使電場(chǎng)中的分子電泳遷移率僅與分子的摩擦系數(shù)成反比。在一定電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移率取決于核酸分子的大小和構(gòu)象。 凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙大?。粷舛仍礁?，空隙越小，其分辨能力也就越強(qiáng)；反之，濃度降低，空隙就增大，其分辨能力也就隨之減弱。 異：瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為02.Kb-50Kb之間；而聚丙烯酰胺分辨DNA片段的范圍為1-1000bp，分離小片段效果最好，分辨率極高，相差1bp的DNA也可分

16、開。13、轉(zhuǎn)基因與克隆的不同將人工分離和修飾過的基因?qū)氲缴矬w基因組中，由于導(dǎo)入基因的表達(dá)，引起生物體的性狀的可遺傳的修飾，這一技術(shù)稱之為轉(zhuǎn)基因技術(shù).科學(xué)家把人工遺傳操作動(dòng)物繁殖的過程叫克隆，這門生物技術(shù)叫克隆技術(shù)，其本身的含義是無性繁殖，即由同一個(gè)祖先細(xì)胞分裂繁殖而形成的純細(xì)胞系，該細(xì)胞系中每個(gè)細(xì)胞的基因彼此相同。 克隆是對(duì)單體的復(fù)制，這和轉(zhuǎn)基因有著很大的不同。轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以保持生物基因的多樣性，而克隆卻沒有什么幫助，反而有一定的威脅。三、論述題 1、cDNA文庫的構(gòu)建（1）分離細(xì)胞總RNA , 純化分離mRNA。 （2）以mRNA 為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，合成cDNA 第一鏈，（3）

17、雙鏈cDNA 的合成：（dG方法）cDNA第一鏈與mRNA模板分離之前，在第一鏈cDNA分子3端加上一段oligo（dC）。通過堿性蔗糖梯度離心處理，使mRNA模板分子降解，回收全長的cDNA第一鏈。最后以互補(bǔ)的oligo（dG）序列作為引物引導(dǎo)第二鏈cDNA的合成（4）將合成的雙鏈DNA重組入載體，導(dǎo)入宿主(大腸桿菌)增殖2、什么是基因組文庫(genomic library)?構(gòu)建基因組文庫，涉及哪些基本過程?它同遺傳學(xué)上的基因庫有什么不同?基因組文庫是用基因工程的方法，人工構(gòu)建的含有某一生物基因組DNA的各種片段 的克隆群。一般以改造的噬菌體DNA或黏粒作為載體，包括下列過程：(1)高分子

18、量染色體DNA的制備；(2)體外重組連接；(3)包裝蛋白的制備；(4)重組體的體外包裝；(5)將重組DNA導(dǎo)人寄主細(xì)胞；(6)篩選?；蚪M文庫同遺傳學(xué)上所講的基因庫是完全不同的概念?；驇?gene pool)是指在進(jìn)行有性生殖的某一群體中，能進(jìn)行生殖的個(gè)體所含總的遺傳信息。在基因組文庫的構(gòu)建中，由于使用的載體不同，分為噬菌體載體和黏粒載體構(gòu)建的基因組文庫、YAC文庫、BAC文庫等。3、目的基因篩選的策略1、核酸雜交篩選原理：將基因文庫的菌落或噬菌斑原位轉(zhuǎn)移到尼龍膜或硝酸纖維素膜之后，進(jìn)行裂解，釋放DNA并且固定在膜上，利用特異的核酸探針進(jìn)行篩選，根據(jù)堿基配對(duì)原則篩選到目的基因。適用范圍：（1

19、）目的基因序列已知，利用該基因作為探針篩選。（2）“基因園”：目的基因序列未知，同源基因已知，利用同源基因序列制備探針篩選。（3）寡核苷酸簡(jiǎn)并引物探針：對(duì)目的基因的表達(dá)產(chǎn)物的氨基酸序列有所了解，則可以從這些氨基酸序列倒過來推導(dǎo)出核酸的可能序列，合成寡核苷酸作為探針。2、抗體篩選（1）適用范圍：已有目的基因表達(dá)產(chǎn)物的特異性抗體，利用抗體篩選表達(dá)特異抗原的克隆。（2）原理：將cDNA定向克隆到表達(dá)載體構(gòu)建成表達(dá)文庫，用能與目的基因表達(dá)產(chǎn)物特異結(jié)合的抗體與文庫中能表達(dá)目的基因的克隆結(jié)合，再用標(biāo)記的二抗與一抗結(jié)合，指示目的基因所在克隆。 3、功能結(jié)合法篩選適用范圍：已知目的基因表達(dá)產(chǎn)物的功能（1）噬菌

20、體顯示法噬菌體展示技術(shù)的原理 ：噬菌體展示技術(shù)是將外源DNA通過基因工程技術(shù)克隆到適當(dāng)?shù)氖删w載體上，使外源DNA片段對(duì)應(yīng)的表達(dá)產(chǎn)物融合在噬菌體的衣殼蛋白上形成融合蛋白，呈現(xiàn)在噬菌體表面。外源多肽或蛋白質(zhì)表達(dá)在噬菌體的表面，而其編碼基因作為噬菌體基因組中的一部分可通過噬菌體DNA序列測(cè)序出來。（2）酵母單、雙雜交法酵母質(zhì)粒有PGBT9和PGAD424。酵母雙雜合系統(tǒng)用于檢測(cè)已知蛋白質(zhì)之間的相互作用，還可用于蛋白質(zhì)的功能域研究及未知蛋白編碼基因的分離克隆等。4、Southern雜交一般過程及影響雜交因素。Southern雜交操作步驟:(1) 用限制性內(nèi)切酶酶切DNA, 經(jīng)凝膠電泳分離各酶切片段；

21、 (2) 轉(zhuǎn)膜：將DNA片段轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上；(3) 預(yù)雜交：封阻濾膜上非特異性位點(diǎn)； (4) 雜交：讓探針與同源DNA片段特異性結(jié)合；(5) 洗脫：去除非特異性結(jié)合的探針；(6) 自顯影檢查目的DNA所在的位置。Southern雜交影響因子1）、目的DNA在總DNA中所占的比例2）、探針的大小和標(biāo)記效率3）、轉(zhuǎn)移到濾膜上的DNA量4）、探針與靶DNA的同源性5、簡(jiǎn)單闡述差異顯示PCR克隆基因的原理及其優(yōu)缺點(diǎn)，有何應(yīng)用？主要原理：利用真核生物mRNA結(jié)尾處有POLY（A）結(jié)構(gòu)，在其3端設(shè)計(jì)象5-T11GA樣引物，該引物可與mRNA總數(shù)的十二分之一結(jié)合，從而使這部分基因得到逆轉(zhuǎn)錄，

22、同時(shí)結(jié)合5端的隨機(jī)引物（20條10-mer），可以使不同長度的基因得到擴(kuò)增。優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、靈敏、高效、省時(shí)，能快速顯示mRNA的組成。所需的mRNA量少。各樣本mRNA的差異可同時(shí)進(jìn)行比較。擴(kuò)出的cDNA可直接用于測(cè)序、文庫篩選等。缺點(diǎn)：假陽性條帶多，對(duì)低豐度的基因表達(dá)不容易檢測(cè)。工作量大。無法定量研究。擴(kuò)出的條帶往往是3端比較短的UTR區(qū)的一段序列，提供的信息較少。利用該技術(shù)，目前已有越來越多的差別表達(dá)基因得以分離和鑒定，在分子生物學(xué)和基因工程研究領(lǐng)域發(fā)揮了極大的作用。（P221）6、抑制性差減雜交的原理與應(yīng)用。原理：SSH的核心技術(shù)是抑制性PCR，它是一種將檢測(cè)子cDNA單鏈標(biāo)準(zhǔn)化步驟和消減雜交步驟結(jié)合為一體的技術(shù)。其中標(biāo)準(zhǔn)化步驟均等了檢測(cè)子中的cDNA單鏈豐度，而消減雜交步驟去除了檢測(cè)子和驅(qū)趕子之間的共同序列，使檢測(cè)子和驅(qū)趕子之間不同的序列得到擴(kuò)增。應(yīng)用：l