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文檔簡(jiǎn)介

1、基因工程一、名詞解釋1. 基因: 是DNA分子中含有特定遺傳信息的一段核苷酸序列,是遺傳物質(zhì)的最小功能單位。2. 定位克隆: 獲取基因在染色體上的位置信息,然后采用各種方法對(duì)該基因進(jìn)行定位和克隆 3.DNA重組:是由于不同DNA鏈的斷裂和連接而產(chǎn)生DNA片段的交換和重新組合,形成新DNA分子的過程。 4.克?。嚎茖W(xué)家把人工遺傳操作動(dòng)物繁殖的過程叫克隆,這門生物技術(shù)叫克隆技術(shù),其本身的含義是無性繁殖,即由同一個(gè)祖先細(xì)胞分裂繁殖而形成的純細(xì)胞系,該細(xì)胞系中每個(gè)細(xì)胞的基因彼此相同。 5.DNA克?。簯?yīng)用酶學(xué)的方法,在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)同源或異源、原核或真核、天然或人工的DNA與載體DNA相結(jié)合

2、成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子復(fù)制子,繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞、篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞,再進(jìn)行擴(kuò)增、提取獲得大量同一DNA分子,即DNA克隆。 5. 融合基因: 是指應(yīng)用DNA體外重組技術(shù)構(gòu)建的一類具有來自兩個(gè)或兩個(gè)以上的不同基因核苷酸序列的新型基因。6. RT-PCR: 是指以mRNA在反轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA第一鏈為模板進(jìn)行的PCR。7. ORF : 起始于AUG、止于UAA、UGA、UAG的連續(xù)的密碼子區(qū)域,是潛在的編碼區(qū)。8. MCS: 指載體上人工合成的含有緊密排列的多種限制核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)的DNA片段。9.基因工程:在體外把核酸分子(DNA的分離、合成)插入載體分

3、子,構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合(重組DNA),引入原先沒有這類分子的受體細(xì)胞內(nèi),穩(wěn)定地復(fù)制表達(dá)繁殖,培育符合人們需要的新品種(品系),生產(chǎn)人類急需的藥品、食品、工業(yè)品等。10. 5RACE: 是一種通過PCR進(jìn)行cDNA末端快速克隆的技術(shù),是以mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈后用PCR技術(shù)擴(kuò)增出某個(gè)特異位點(diǎn)到5端之間未知序列的方法。11.cDNA library:cDNA文庫:是指某生物某一發(fā)育時(shí)期所轉(zhuǎn)錄形成的cDNA片段與某種載體連接而成的克隆的集合。12.載體:能載帶微量物質(zhì)共同參與某種化學(xué)或物理過程的常量物質(zhì),在基因工程重組DNA技術(shù)中將DNA片段(目的基因)轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞的一種能自我復(fù)制

4、的DNA分子。三種最常用的載體是細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體和動(dòng)植物病毒。13.基因診斷:又稱DNA診斷或分子診斷,通過分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù),直接檢測(cè)出分子結(jié)構(gòu)水平和表達(dá)水平是否異常,從而對(duì)疾病做出判斷。14.限制性核酸內(nèi)切酶:是由細(xì)菌產(chǎn)生的一類能特異識(shí)別雙鏈DNA中的特定堿基序列,并在識(shí)別位點(diǎn)切割磷酸二酯鍵的核酸內(nèi)切酶(簡(jiǎn)稱限制酶)。 15.基因文庫:將所有的重組DNA分子都導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增,得到分子克隆的混合體,這樣一個(gè)混合體稱為基因文庫。 16.cDNA文庫:從組織細(xì)胞中分離得到純化的mRNA,然后以mRNA為模板,利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成其互補(bǔ)DNA,再復(fù)制成雙鏈cDNA片段,與適當(dāng)載體連接后

5、導(dǎo)入受體菌內(nèi),擴(kuò)增,構(gòu)建cDNA文庫。 17.RFLP:RFLP標(biāo)記是發(fā)展最早的DNA標(biāo)記技術(shù)。RFLP是指基因型之間限制性片段長度的差異,這種差異是由限制性酶切位點(diǎn)上堿基的插入、缺失、重排或點(diǎn)突變所引起的。 18.核酸探針:是指與特定的靶分子發(fā)生特異性相互作用,并可被特殊的方法探知的分子??贵w-抗原、生物素-抗生物素蛋白、生長因子-受體的相互作用都可以看作是探針與靶分子的相互作用。 19.Shuttle plasmid vector穿梭質(zhì)粒載體:指一類由人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)的選擇標(biāo)記,因而可在兩種不同宿主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。20.限制與修飾系統(tǒng):限制酶的生物學(xué)功能一般被認(rèn)為

6、是用來保護(hù)宿主細(xì)胞不受外源DNA的感染,可講解外來DNA,從而阻止其復(fù)制和整合到細(xì)胞中。一般來說,與限制酶相伴而生的修飾酶是甲基轉(zhuǎn)移酶,或者說是甲基化酶,能保護(hù)自身的DNA不被講解。限制酶和甲基轉(zhuǎn)移酶組成限制與修飾系統(tǒng)。21.星活性:在極端非標(biāo)準(zhǔn)條件下,限制酶能切割與識(shí)別序列相似的序列,這個(gè)改變的特征稱為星星活性。二、簡(jiǎn)答題1.載體的分類按功能分:克隆載體:(主要用于擴(kuò)增或保存DNA片段,是最簡(jiǎn)單的載體。具有強(qiáng)大的包裝能力) 表達(dá)載體:(帶有目標(biāo)細(xì)胞識(shí)別的啟動(dòng)子) 其他載體:(整合載體、穿梭載體等) 按進(jìn)入受體細(xì)胞類型分(1)原核載體(2)真核載體(3)穿梭載體按來源分: 質(zhì)粒(細(xì)菌等原核生物

7、染色體外遺傳物質(zhì)) 噬菌體(原核細(xì)胞的病毒) 真核病毒(真核細(xì)胞的病毒) 人工遺傳物質(zhì)(噬菌粒、粘粒、細(xì)菌、酵母等)2、基因克隆載體必備條件:1)具有多種單一核酸內(nèi)切酶切割位點(diǎn)(多克隆位點(diǎn))一個(gè)或多個(gè))外源DNA插入,不影響載體復(fù)制。2)能攜帶外源DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞能自我復(fù)制,或整合到染色體隨受體細(xì)胞DNA復(fù)制而復(fù)制。3)有選擇克隆子的標(biāo)記基因(篩選標(biāo)記)。4)分子量小,拷貝數(shù)高,易從宿主細(xì)胞中分離。5)安全性(不含損害受體的基因,不任意轉(zhuǎn)入別的,尤其人的細(xì)胞)。 3、表達(dá)載體和基因工程一般克隆載體在元件構(gòu)成上有何差別?表達(dá)載體:?jiǎn)?dòng)子;終止子;核糖體結(jié)合位點(diǎn)(SD序列);篩選標(biāo)記;復(fù)制子

8、(質(zhì)粒拷貝數(shù));多克隆位點(diǎn)克隆載體:篩選標(biāo)記;復(fù)制子(質(zhì)??截悢?shù));多克隆位點(diǎn)4、原核表達(dá)載體與真核表達(dá)載體及穿梭載體的區(qū)別1)真核表達(dá)載體和原核表達(dá)載體就是能在真核生物或原核生物中表達(dá)的載體,它們一般都帶有能在真核生物或原核生物中表達(dá)的必需表達(dá)元件;2)真核表達(dá)和原核表達(dá)的目的都是為了能夠大量獲得自己所需要的目的基因的表達(dá)產(chǎn)物,最好有生物活性,以便下一步的實(shí)驗(yàn)需要.3)原核表達(dá)載體一般只能在原核生物中表達(dá)外源基因,但有些穿梭載體可以分別在真核和原核生物中表達(dá)它們的表達(dá)元件.5、什么是包涵體?重組蛋白在胞內(nèi)表達(dá)時(shí),常常以不溶性蛋白聚集成的晶狀物形式存在,這種晶狀體即包涵體。包涵體的形成是外源蛋

9、白的高效表達(dá)時(shí)的普遍現(xiàn)象,這是由于肽鏈折疊過程中部分折疊的中間態(tài)發(fā)生了錯(cuò)誤聚合,而不是形成成熟的天然態(tài)或完全解鏈的蛋白。探針標(biāo)記的方法:(1)缺口平移法 (Nick Translation)原理及過程:反應(yīng)體系中DNA酶I隨機(jī)在探針DNA上打開缺口,然后利用DNA聚合酶I 5 3外切酶活性,在缺口處按5 3方向切除單核苷酸;同時(shí)DNA聚合酶I有5 3的聚合酶活性,在缺口處3端加入底物中的單核苷酸,彌補(bǔ)缺口處的核苷酸鏈。隨著反應(yīng)的進(jìn)行底物中被標(biāo)記單核苷酸,并被隨機(jī)摻入。DNA聚合酶I的兩種作用交替進(jìn)行,探針即被標(biāo)記。(2)隨機(jī)引物法(6核苷酸引物標(biāo)記法)原理及過程:利用E.coli DNA聚合酶

10、I的Klenow亞單位,合成含有標(biāo)記核苷酸的DNA鏈。Klenow具有5 3聚合酶活性。被標(biāo)記的DNA(探針)變性成單鏈,引物與模板結(jié)合。在Klenow的催化下,以引物3端為起點(diǎn),沿模板3 5方向合成DNA新鏈。反應(yīng)體系中含有標(biāo)記的dNTP,隨機(jī)摻入新合成的DNA鏈中,探針即被標(biāo)記。(3)末端標(biāo)記多核苷酸激酶的用途:DNA5'-OH端磷酸化、標(biāo)記DNA的5端。包括正向反應(yīng)和交換反應(yīng)標(biāo)記法6、PCR反應(yīng)的基本原理:1)變性:在PCR反應(yīng)體系中,通過加熱使溫度至95左右,使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂,形成單鏈DNA作為反應(yīng)模板。2)退火:PCR反應(yīng)中,經(jīng)變性后將溫度降至引物的TM值左右或以下,

11、引物與DNA模板互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合,形成雜交鏈的過程。 3)延伸:當(dāng)反應(yīng)體系溫度升至70左右時(shí),TaqDNA聚合酶催化以引物為起始點(diǎn)的53延伸反應(yīng),形成新生DNA鏈。7、引物設(shè)計(jì)的基本原則最大限度地提高擴(kuò)增效率和特異性,同時(shí)盡可能抑制非特異性擴(kuò)增。(1)引物長度一般為1530個(gè)核苷酸。 (2)堿基隨機(jī)分布,避免出現(xiàn)嘌呤,嘧啶的堆積現(xiàn)象。G+C的含量為4555%。(3端和5端引物具有相似的Tm值。Tm=4(G+C)+2(A+T)。引物長度要確保解鏈溫度不低于54°C。)(3)兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列,尤其應(yīng)避免3端的互補(bǔ)重疊,連續(xù)互補(bǔ)序列一般不超過3bp。(4)引物的堿基序列不應(yīng)與非擴(kuò)增

12、區(qū)域有同源性。(5)引物3端堿基一定要與模板DNA配對(duì),最佳堿基選G和C而不用A。(6)引物的5端沒有嚴(yán)格限制,可以修飾,如加限制酶位點(diǎn),引入突變位點(diǎn),起始密碼子,終止密碼子等。8簡(jiǎn)述獲得目的基因常用的幾種方法。(5分)(1)直接從染色體DNA中分離:(1分)僅適用于原核生物、葉綠體和線粒體基因的分離,較少采用。 (2)人工合成:(1分)根據(jù)已知多肽鏈的氨基酸順序,利用遺傳密碼表推定其核苷酸順序再進(jìn)行人工合成。適應(yīng)于編碼小分子多肽的基因。 (3)從mRNA合成cDNA:(1分)采用一定的方法釣取特定基因的mRNA,再通過逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成其互補(bǔ)DNA(cDNA),除去RNA鏈后,再用DNA聚合酶

13、合成其互補(bǔ)DNA鏈,從而得到雙鏈DNA。這一方法通??傻玫娇杀磉_(dá)的完整基因。 (4)利用PCR合成:(1分)如已知目的基因兩端的序列,則可采用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)技術(shù),在體外合成目的基因。 (5)從基因文庫中篩選:(1分)首先建立基因組或cDNA文庫,利用探針從文庫中篩選目的克隆。9. 分子克隆載體應(yīng)具備哪些特點(diǎn)?(4分)(1) 在宿主細(xì)胞內(nèi)必須能夠自主復(fù)制(1分)(2) 必須具備合適的酶切位點(diǎn),供外源DNA片段插入,同時(shí)不影響其復(fù)制(1分)(3) 有一定的選擇標(biāo)記,用于篩選(1分)(4) 具有較高的拷貝數(shù),便于載體的制備(1分)10. 受

14、體細(xì)胞選擇的基本原則 便于重組DNA分子的導(dǎo)入便于DNA分子的穩(wěn)定存在便于重組體篩選遺傳穩(wěn)定性高,易于擴(kuò)大培養(yǎng)安全性高,無致病性內(nèi)源水解酶缺失或蛋白酶低受體細(xì)胞遺傳密碼無偏性較好的轉(zhuǎn)譯和加工機(jī)制較大研究與應(yīng)用價(jià)值11、 cDNA文庫和基因組文庫的主要差別有哪些?(5分)(1)基因組文庫克隆的是任何基因,包括未知功能的DNA序列;cDNA文庫克隆的是具有蛋白質(zhì)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)基因,包括調(diào)節(jié)基因。(2分)(2)基因組文庫克隆的是全部遺傳信息,不受時(shí)空影響;cDNA文庫克隆的是不完全的編碼DNA序列,因它受發(fā)育和調(diào)控因子的影響。(1分)(3)基因組文庫中的編碼基因是真實(shí)基因,含有內(nèi)含子和外顯子,而cDNA

15、文庫克隆的是不含內(nèi)含子的功能基因。(2分)12、分析比較瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳的異同點(diǎn)?答:同:原理相同。瓊脂糖、聚丙烯酰胺均為無反應(yīng)活性的穩(wěn)定支持介質(zhì),可降低對(duì)流運(yùn)動(dòng),故使電場(chǎng)中的分子電泳遷移率僅與分子的摩擦系數(shù)成反比。在一定電場(chǎng)強(qiáng)度下,DNA分子的遷移率取決于核酸分子的大小和構(gòu)象。 凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙大?。粷舛仍礁?,空隙越小,其分辨能力也就越強(qiáng);反之,濃度降低,空隙就增大,其分辨能力也就隨之減弱。 異:瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為02.Kb-50Kb之間;而聚丙烯酰胺分辨DNA片段的范圍為1-1000bp,分離小片段效果最好,分辨率極高,相差1bp的DNA也可分

16、開。13、轉(zhuǎn)基因與克隆的不同將人工分離和修飾過的基因?qū)氲缴矬w基因組中,由于導(dǎo)入基因的表達(dá),引起生物體的性狀的可遺傳的修飾,這一技術(shù)稱之為轉(zhuǎn)基因技術(shù).科學(xué)家把人工遺傳操作動(dòng)物繁殖的過程叫克隆,這門生物技術(shù)叫克隆技術(shù),其本身的含義是無性繁殖,即由同一個(gè)祖先細(xì)胞分裂繁殖而形成的純細(xì)胞系,該細(xì)胞系中每個(gè)細(xì)胞的基因彼此相同。 克隆是對(duì)單體的復(fù)制,這和轉(zhuǎn)基因有著很大的不同。轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以保持生物基因的多樣性,而克隆卻沒有什么幫助,反而有一定的威脅。三、論述題 1、cDNA文庫的構(gòu)建(1)分離細(xì)胞總RNA , 純化分離mRNA。 (2)以mRNA 為模板,在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下,合成cDNA 第一鏈,(3)

17、雙鏈cDNA 的合成:(dG方法)cDNA第一鏈與mRNA模板分離之前,在第一鏈cDNA分子3端加上一段oligo(dC)。通過堿性蔗糖梯度離心處理,使mRNA模板分子降解,回收全長的cDNA第一鏈。最后以互補(bǔ)的oligo(dG)序列作為引物引導(dǎo)第二鏈cDNA的合成(4)將合成的雙鏈DNA重組入載體,導(dǎo)入宿主(大腸桿菌)增殖2、什么是基因組文庫(genomic library)?構(gòu)建基因組文庫,涉及哪些基本過程?它同遺傳學(xué)上的基因庫有什么不同?基因組文庫是用基因工程的方法,人工構(gòu)建的含有某一生物基因組DNA的各種片段 的克隆群。一般以改造的噬菌體DNA或黏粒作為載體,包括下列過程:(1)高分子

18、量染色體DNA的制備;(2)體外重組連接;(3)包裝蛋白的制備;(4)重組體的體外包裝;(5)將重組DNA導(dǎo)人寄主細(xì)胞;(6)篩選?;蚪M文庫同遺傳學(xué)上所講的基因庫是完全不同的概念?;驇?gene pool)是指在進(jìn)行有性生殖的某一群體中,能進(jìn)行生殖的個(gè)體所含總的遺傳信息。在基因組文庫的構(gòu)建中,由于使用的載體不同,分為噬菌體載體和黏粒載體構(gòu)建的基因組文庫、YAC文庫、BAC文庫等。3、目的基因篩選的策略1、核酸雜交篩選原理:將基因文庫的菌落或噬菌斑原位轉(zhuǎn)移到尼龍膜或硝酸纖維素膜之后,進(jìn)行裂解,釋放DNA并且固定在膜上,利用特異的核酸探針進(jìn)行篩選,根據(jù)堿基配對(duì)原則篩選到目的基因。適用范圍:(1

19、)目的基因序列已知,利用該基因作為探針篩選。(2)“基因園”:目的基因序列未知,同源基因已知,利用同源基因序列制備探針篩選。(3)寡核苷酸簡(jiǎn)并引物探針:對(duì)目的基因的表達(dá)產(chǎn)物的氨基酸序列有所了解,則可以從這些氨基酸序列倒過來推導(dǎo)出核酸的可能序列,合成寡核苷酸作為探針。2、抗體篩選(1)適用范圍:已有目的基因表達(dá)產(chǎn)物的特異性抗體,利用抗體篩選表達(dá)特異抗原的克隆。(2)原理:將cDNA定向克隆到表達(dá)載體構(gòu)建成表達(dá)文庫,用能與目的基因表達(dá)產(chǎn)物特異結(jié)合的抗體與文庫中能表達(dá)目的基因的克隆結(jié)合,再用標(biāo)記的二抗與一抗結(jié)合,指示目的基因所在克隆。 3、功能結(jié)合法篩選適用范圍:已知目的基因表達(dá)產(chǎn)物的功能(1)噬菌

20、體顯示法噬菌體展示技術(shù)的原理 :噬菌體展示技術(shù)是將外源DNA通過基因工程技術(shù)克隆到適當(dāng)?shù)氖删w載體上,使外源DNA片段對(duì)應(yīng)的表達(dá)產(chǎn)物融合在噬菌體的衣殼蛋白上形成融合蛋白,呈現(xiàn)在噬菌體表面。外源多肽或蛋白質(zhì)表達(dá)在噬菌體的表面,而其編碼基因作為噬菌體基因組中的一部分可通過噬菌體DNA序列測(cè)序出來。(2)酵母單、雙雜交法酵母質(zhì)粒有PGBT9和PGAD424。酵母雙雜合系統(tǒng)用于檢測(cè)已知蛋白質(zhì)之間的相互作用,還可用于蛋白質(zhì)的功能域研究及未知蛋白編碼基因的分離克隆等。4、Southern雜交一般過程及影響雜交因素。Southern雜交操作步驟:(1) 用限制性內(nèi)切酶酶切DNA, 經(jīng)凝膠電泳分離各酶切片段;

21、 (2) 轉(zhuǎn)膜:將DNA片段轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上;(3) 預(yù)雜交:封阻濾膜上非特異性位點(diǎn); (4) 雜交:讓探針與同源DNA片段特異性結(jié)合;(5) 洗脫:去除非特異性結(jié)合的探針;(6) 自顯影檢查目的DNA所在的位置。Southern雜交影響因子1)、目的DNA在總DNA中所占的比例2)、探針的大小和標(biāo)記效率3)、轉(zhuǎn)移到濾膜上的DNA量4)、探針與靶DNA的同源性5、簡(jiǎn)單闡述差異顯示PCR克隆基因的原理及其優(yōu)缺點(diǎn),有何應(yīng)用?主要原理:利用真核生物mRNA結(jié)尾處有POLY(A)結(jié)構(gòu),在其3端設(shè)計(jì)象5-T11GA樣引物,該引物可與mRNA總數(shù)的十二分之一結(jié)合,從而使這部分基因得到逆轉(zhuǎn)錄,

22、同時(shí)結(jié)合5端的隨機(jī)引物(20條10-mer),可以使不同長度的基因得到擴(kuò)增。優(yōu)點(diǎn):簡(jiǎn)便、靈敏、高效、省時(shí),能快速顯示mRNA的組成。所需的mRNA量少。各樣本mRNA的差異可同時(shí)進(jìn)行比較。擴(kuò)出的cDNA可直接用于測(cè)序、文庫篩選等。缺點(diǎn):假陽性條帶多,對(duì)低豐度的基因表達(dá)不容易檢測(cè)。工作量大。無法定量研究。擴(kuò)出的條帶往往是3端比較短的UTR區(qū)的一段序列,提供的信息較少。利用該技術(shù),目前已有越來越多的差別表達(dá)基因得以分離和鑒定,在分子生物學(xué)和基因工程研究領(lǐng)域發(fā)揮了極大的作用。(P221)6、抑制性差減雜交的原理與應(yīng)用。原理:SSH的核心技術(shù)是抑制性PCR,它是一種將檢測(cè)子cDNA單鏈標(biāo)準(zhǔn)化步驟和消減雜交步驟結(jié)合為一體的技術(shù)。其中標(biāo)準(zhǔn)化步驟均等了檢測(cè)子中的cDNA單鏈豐度,而消減雜交步驟去除了檢測(cè)子和驅(qū)趕子之間的共同序列,使檢測(cè)子和驅(qū)趕子之間不同的序列得到擴(kuò)增。應(yīng)用:l

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