酶工程生物技術

1、酶工程酶工程李福利李福利山東大學微生物技術國家重點實驗室山東大學微生物技術國家重點實驗室生物技術生物技術的四大支柱四大支柱基 因 工 程細 胞 工 程酶 工 程發(fā) 酵 工 程生生物物 技技 術術（ 生 物 工 程 ）酶的基礎知識酶的基礎知識 一一 什么是酶？什么是酶？Enzyme proteins酶是由生物體產生的具有催化酶是由生物體產生的具有催化劑活性的蛋白質劑活性的蛋白質 。Ribozyme RNAs本身就是一段本身就是一段RNA，不需要額外的，不需要額外的蛋白酶就可以對自身進行剪切。蛋白酶就可以對自身進行剪切。 二二 酶催化特性酶催化特性n 高效率比非催化高1081020倍比非酶催化高1

2、071013倍n 高度專一性n 反應條件溫和n 酶催化是可調控的三 酶的化學本質nEnzyme Proteinsn Ribozyme RNAs四 酶的組成簡單酶酶結合酶輔酶Coenzyme輔因子輔基Prosthetic group (Table 2)HoloenzymeApoenzymeCofactor五 酶的命名與分類原則：n根據酶所用的底物來命名nRibonucleasenProteasen根據所催化的反應來命名nDehydrogenasenPhosphotransferasenAminotransferasen上述兩個原則結合n上述原則再加上酶的來源牛胰核糖核酸酶（一）國際系統分類法n氧

3、化還原酶類 Oxidoreductasesn轉移酶類 Transgerasesn水解酶類Hydrolasesn裂合酶類Lyasesn異構酶類Isomerasesn合成酶類Synthetases nSynthases（二）系統命名法nATP: Creatine Phosphotransferasen ATP: 肌酸 磷酰基轉移酶nGlutamate: Pyruvate aminotransferasen 谷氨酸： 丙酮酸 (GPT) 氨基轉移酶n單體酶 Monomeric enzymesn寡聚酶 Oligomericenzymesn多酶體系 Multienzyme systems酶工程酶工程n酶

4、工程即利用酶的催化作用，在一定的生物反應器中，將相應的原料轉化成所需的產品。酶工程是現代酶學理論與化工技術的交叉技術，它的應用主要集中于食品工業(yè)、輕工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)等領域。酶工程的應用范圍（1）對生物寶庫中存在天然酶的開發(fā)和生產；（2）自然酶的分離純化及鑒定技術；（3）酶的固定化技術（酶和細胞固定化）；（4）酶反應器的研制和應用；（5）與其他生物技術領域的交叉和滲透。 其中固定化酶技術是酶工程的核心。實際上有了酶的固定化技術，酶在工業(yè)生產中的利用價值才真正得以體現。 n盡管人類盡管人類19世紀前后才建立起酶的概念，但酶的世紀前后才建立起酶的概念，但酶的催化作用卻很早就為人們的生活所利用。比如：催

5、化作用卻很早就為人們的生活所利用。比如：(1)在人類游牧生活時期，就已會利用動物的胃液來凝固在人類游牧生活時期，就已會利用動物的胃液來凝固牛乳牛乳 ；(2)人類在人類在4000多年前就已掌握的釀酒和制醬技術其實也多年前就已掌握的釀酒和制醬技術其實也是酶作用的結果。是酶作用的結果。n放線菌放線菌 1987年以后，年以后，Bucher發(fā)現酶的細胞外作用發(fā)現酶的細胞外作用現象，從而導致了酶現象，從而導致了酶的商品化生產。的商品化生產。n霉菌霉菌 最初的商品酶制劑主要以動最初的商品酶制劑主要以動植物為原料提取，如從牛胃中提植物為原料提取，如從牛胃中提取凝乳酶、從胰臟中提取胰酶、取凝乳酶、從胰臟中提取胰

6、酶、從血液中提取凝血酶、從植物材從血液中提取凝血酶、從植物材料中提取淀粉酶等。料中提取淀粉酶等。 之后，之后，Takamine利用霉菌利用霉菌來生產淀粉酶使得酶制劑工業(yè)取來生產淀粉酶使得酶制劑工業(yè)取得突破，其方法至今仍被采用得突破，其方法至今仍被采用 第二次世界大戰(zhàn)以后，第二次世界大戰(zhàn)以后，隨著微生物培養(yǎng)技術、發(fā)酵隨著微生物培養(yǎng)技術、發(fā)酵工業(yè)和設備的漸漸完善，利工業(yè)和設備的漸漸完善，利用微生物來獲得商品化酶制用微生物來獲得商品化酶制劑已形成規(guī)模化產業(yè)，并開劑已形成規(guī)模化產業(yè)，并開辟了廣闊的市場。辟了廣闊的市場。 Pilot Biostat UD50 20世紀世紀90年代，隨著基年代，隨著基因工

7、程的廣泛介入，一些因工程的廣泛介入，一些原來只能由動物或植物生原來只能由動物或植物生產的酶，經過酶基因重組，產的酶，經過酶基因重組，可以在微生物上表達。由可以在微生物上表達。由于在發(fā)酵過程中很容易對于在發(fā)酵過程中很容易對微生物進行控制，因此微生物進行控制，因此 “基因工程發(fā)酵工藝基因工程發(fā)酵工藝先進的發(fā)酵設備先進的發(fā)酵設備”可以算可以算是酶工業(yè)的第三次飛躍。是酶工業(yè)的第三次飛躍。 霉菌霉菌微生物酶的開發(fā)微生物酶的開發(fā)一、應用微生物來開發(fā)酶的優(yōu)點：一、應用微生物來開發(fā)酶的優(yōu)點： (1)微生物生長繁殖快，生活周期短。因此，用微生物來微生物生長繁殖快，生活周期短。因此，用微生物來生產酶產品，生產能力

8、（發(fā)酵）幾乎可以不受限制地擴大，生產酶產品，生產能力（發(fā)酵）幾乎可以不受限制地擴大，能夠滿足迅速擴張的市場需求。能夠滿足迅速擴張的市場需求。 (2)微生物種類繁多，它們散布于整個地球的各個角落，微生物種類繁多，它們散布于整個地球的各個角落，而且在不同的環(huán)境下生存的微生物都有其完全不同的代謝而且在不同的環(huán)境下生存的微生物都有其完全不同的代謝方式，能分解利用不同的底物。方式，能分解利用不同的底物。 (3)這一特征就為微生物酶品種的多樣性提供了物質基礎。這一特征就為微生物酶品種的多樣性提供了物質基礎。微生物酶的開發(fā)微生物酶的開發(fā)一、應用微生物來開發(fā)酶的優(yōu)點：一、應用微生物來開發(fā)酶的優(yōu)點： (4)特別

9、是當基因工程介入時，動植物細胞中存在地酶，特別是當基因工程介入時，動植物細胞中存在地酶，幾乎都能夠利用微生物細胞獲得。幾乎都能夠利用微生物細胞獲得。 因此，有計劃和仔細地篩選微生物菌種，通?？梢砸虼?，有計劃和仔細地篩選微生物菌種，通?？梢垣@得能夠生產幾乎任何一種酶的適當細胞。獲得能夠生產幾乎任何一種酶的適當細胞。微生物酶開發(fā)的一般程序微生物酶開發(fā)的一般程序(一一) 樣品的采集樣品的采集 采樣的目的、采樣地點、采樣方法及采樣的數采樣的目的、采樣地點、采樣方法及采樣的數量。量。微生物酶開發(fā)的一般程序微生物酶開發(fā)的一般程序(二二) 菌種的分離菌種的分離 培養(yǎng)基的確定、培養(yǎng)條件的確定。培養(yǎng)基的確定、培

10、養(yǎng)條件的確定。微生物酶開發(fā)的一般程序微生物酶開發(fā)的一般程序(三三) 菌種的初篩菌種的初篩 (1)用簡單的定性反應進行初篩；用簡單的定性反應進行初篩； (2)在最初分離階段就給予特殊的培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件，在最初分離階段就給予特殊的培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件，進而讓目的菌株得以繁殖，盡可能地把只成為目進而讓目的菌株得以繁殖，盡可能地把只成為目的菌的菌株或只將其最適菌株的一株純化分離。的菌的菌株或只將其最適菌株的一株純化分離。微生物酶開發(fā)的一般程序微生物酶開發(fā)的一般程序(四四) 菌種的復篩菌種的復篩 初篩之后，還要進行復篩。復篩的目的是在初初篩之后，還要進行復篩。復篩的目的是在初篩的基礎上，篩選產酶量高、性能更

11、符合生產要篩的基礎上，篩選產酶量高、性能更符合生產要求的菌種。復篩。求的菌種。復篩。 酶活的測定方法的建立尤其重要。酶活的測定方法的建立尤其重要。微生物酶開發(fā)的一般程序微生物酶開發(fā)的一般程序(五五) 對復篩獲得菌株的要求對復篩獲得菌株的要求 (1)不是致病菌；不是致病菌； (2)菌株不易變易和退化；菌株不易變易和退化； (3)不易感染噬菌體；不易感染噬菌體； (4)微生物產酶量高；微生物產酶量高； (5)酶的性質符合應用的需要，而且最好是胞外酶的性質符合應用的需要，而且最好是胞外酶；酶； (6)產生的酶便于分離和提取，得率高；產生的酶便于分離和提取，得率高； (7)微生物培養(yǎng)營養(yǎng)要求低。微生物

12、培養(yǎng)營養(yǎng)要求低。微生物酶開發(fā)的一般程序微生物酶開發(fā)的一般程序(六六) 最佳產酶條件的初步確定最佳產酶條件的初步確定 (1)培養(yǎng)方式的確定；培養(yǎng)方式的確定； (2)最佳培養(yǎng)條件組合；最佳培養(yǎng)條件組合； (3)微生物產酶的特性微生物產酶的特性(胞內酶、胞外酶胞內酶、胞外酶)； (4)微生物酶收集的時間順序；微生物酶收集的時間順序； 微生物酶開發(fā)的一般程序微生物酶開發(fā)的一般程序(七七) 微生物產酶性能的進一步提高微生物產酶性能的進一步提高 (1)獲得高產菌種的突變體；獲得高產菌種的突變體； 微生物酶開發(fā)的一般程序微生物酶開發(fā)的一般程序(七七) 微生物產酶性能的進一步提高微生物產酶性能的進一步提高 (

13、2)利用代謝工程和代謝調節(jié)機理來提高微生物利用代謝工程和代謝調節(jié)機理來提高微生物的酶產量；的酶產量； 微生物酶開發(fā)的一般程序微生物酶開發(fā)的一般程序(七七) 微生物產酶性能的進一步提高微生物產酶性能的進一步提高 (3)運用遺傳工程、基因工程的手段將原有菌株運用遺傳工程、基因工程的手段將原有菌株中的目的基因轉移到另外一些對生產環(huán)境更適應中的目的基因轉移到另外一些對生產環(huán)境更適應性的微生物細胞之內，使其高效表達；性的微生物細胞之內，使其高效表達； 微生物酶開發(fā)的一般程序微生物酶開發(fā)的一般程序(八八) 微生物酶的提取方法微生物酶的提取方法 (1)酶的粗提；酶的粗提； (2)酶的精制。酶的精制。 微生物

14、酶開發(fā)的一般程序微生物酶開發(fā)的一般程序(九九) 微生物產酶菌種的保藏微生物產酶菌種的保藏 (1)斜面；斜面； (2)沙土管；沙土管； (3)冷凍。冷凍。 代謝流分析與控制代謝流分析與控制 代謝工程是當今國際生化工程界的新興交叉學科，它將計算機技術、自動控制、基因操作技術與發(fā)酵工程結合起來，研究生產過程中細胞代謝流的分布，利用代謝控制理論和網絡剛性理論尋找限制代謝流率的代謝瓶頸和代謝網絡中制約轉化率提高的酶反應，為定向菌種選育和發(fā)酵控制提供思路。Glucose=G6PF6PGAPG3PPEPPyrAcCoADHAPRibu5PRib5PXyl5P1,6FDPSed7PE4PaKGIsocitSu

15、cCoASucMalOaaGluGlnNADPHCO2CO2NH4+ATPCO2CO2GluGln=細胞膜CO2PEPPyr細胞膜ValLacAla谷氨酸與谷氨酰胺產生代謝網絡圖谷氨酸棒桿菌產生谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、谷氨酸棒桿菌產生谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、脯氨酸脯氨酸代謝網絡圖氧化酶誘導產酶機制和發(fā)酵動力學研究n一級酶自催化模型 nOne order self-catalytic model：0510150246810 Time (h) Glucose (g/L)012345Biomass (g/L) Lactate (g/L)0100200300400500 Enzyme Activi

16、ty(nmol Pyr/min/ml broth)實驗室工作與實驗室工作與工業(yè)化生產之間的差異工業(yè)化生產之間的差異微生物酶的應用微生物酶的應用一、蛋白酶一、蛋白酶洗毛工藝中蛋白酶的應用生產中經常會發(fā)現,洗凈毛色澤黯沉,影響后加工的質量和成品的色光。國內外學者研究發(fā)現,原毛表面除了含有羊毛脂、羊汗、土雜、草屑污染物外,還存在另一種蛋白質污染物(PCL),它的殘存使洗凈毛色澤黯沉,采用傳統的洗毛方法很難完全去除。為洗除羊毛表面的蛋白質污染物,在洗毛工藝中應用AS1398 中性枯草桿菌蛋白酶,采用二步法洗毛,先使用合成洗滌劑601 洗去羊毛脂、羊汗、土雜,再利用蛋白酶洗去蛋白質污染物,提高洗凈毛的質

17、量?？刂频鞍酌钢委熂膊蛋白酶對冠狀病毒的復制起著重要的控制作用，因此如果可以有效抑制住蛋白酶的活性，那么就可以控制住病毒在體內的傳播，這樣雖然不能預防感染上SARS，但卻將會使人類有了治療SARS的有效藥物。一種名為“AG7088”的藥物有望在改良后用于治療SARS。該藥物用于治療鼻病毒（rhinovirus）引起的普通感冒，而控制這種病毒復制的蛋白酶與SARS冠狀病毒蛋白酶結構非常相似?？茖W家認為，AG7088這種正處于臨床試驗階段的藥物，雖然不能直接抑制SARS冠狀病毒蛋白酶，但鑒于兩種蛋白酶的相似性，這一藥物有望在經過改良后抑制SARS病毒蛋白酶的活動，從而成為對付SARS的良藥。 二

18、、淀粉酶二、淀粉酶三、纖維素酶三、纖維素酶四、脂肪酶四、脂肪酶廣泛用于化妝品、食品、醫(yī)藥、洗滌劑工業(yè)中的生物表面活性劑包括脂肪酸單甘油酯、脂肪酸糖酯、聚甘油脂肪酸酯和長鏈脂肪酸蠟酯。傳統化學法以堿為催化劑在高溫下進行, 不僅能耗高且產品純度低。脂肪酶作為一種天然生物催化劑, 可在溫和條件下催化合成上述生物表面活性劑, 能耗低且產品純度高。五、醫(yī)藥生產用酶五、醫(yī)藥生產用酶青霉素?；盖嗝顾仵；?青霉素?；甘且环N能轉化天然青霉素的酶.它水解苯乙酸和一些密切相關的芳香脂肪酸的酰胺.在適當條件下,它還能催化6-氨基青霉烷酸生成半合成青霉素. 可獲得高效、廣譜、服用方便的半合成抗生素, 由于這些抗生

19、素在臨床上廣泛的應用, 從而使青霉素酰化酶的需要量日益增長.青霉素?；赋Ｓ晌⑸锂a生, 分胞內酶及胞外酶兩種形式. 六、特殊的治療用酶六、特殊的治療用酶 1. 透明質酸酶透明質酸酶(治療肝炎、肝硬化治療肝炎、肝硬化)2. 血纖維蛋白溶酶血纖維蛋白溶酶(治療心肌梗塞等治療心肌梗塞等)3. L-天冬酰胺酶天冬酰胺酶(治療可用于治療白血病治療可用于治療白血病) 謝謝固定化酶固定化酶 固定化技術及應用固定化技術及應用什么是固定化酶？什么是固定化酶？水溶性酶水溶性酶水不溶性載體水不溶性載體水不溶性酶水不溶性酶（固定化酶）（固定化酶）固定化技術固定化技術化學偶聯酶酶固定化固定化間歇間歇可溶可溶交聯包埋吸

20、附間歇間歇連續(xù)連續(xù)固定化酶的特點：n優(yōu)點：n不溶于水，易于與產物分離；n可反復使用；n可連續(xù)化生產；n穩(wěn)定性好。n缺點：固定化過程中往往會引起酶的失活固定化技術n微型膠囊法n吸附n通過雙功能試劑進行共價交聯n膠格包埋n和水不溶性載體共價結合一 固定化酶的方法（一）微型膠囊法相分離法酶硝酸纖維素D半乳糖苷酶天門冬酰胺酶火棉膠醇脫氫酶蘋果酸脫氫酶丙酮酸激酶脲酶界面聚合法尼龍液膜法聚脲液體干燥法乙基纖維素聚苯乙烯（二）吸附法 物理吸附法 靜止法 電沉積法 反應器上直接吸附法 混合浴或振蕩浴吸附法優(yōu)點：固定化時酶分子的構象很少或基本不發(fā)生變化。缺點：結合力弱，易解吸附。載體：纖維素、瓊脂糖、活性炭、沸

21、石及硅膠等。 離子結合法離子結合法 酶分子含有離子交換基團的固相載體 第一個離子結合法固定化酶：DEAE Cellulose固定化過氧化氫酶 第一個工業(yè)化的固定化酶：DEAE-Sephadex A-50固定化氨基?；福ㄈ┠z格包埋法首先被采用的膠格包埋法是： 固定化胰蛋白酶 木瓜蛋白酶 淀粉酶Enzyme+N, N-甲叉雙丙稀酰胺, 丙稀酰胺引發(fā)劑inactiation（四）共價交聯法雙功能試劑：雙功能試劑：常用的是戊二醛常用的是戊二醛 O OH C CH2 CH2 CH2 C H第一篇報道是：戊二醛交聯羧肽酶第一篇報道是：戊二醛交聯羧肽酶 得到一種分子間得到一種分子間交聯的固定化酶交聯的固定化酶圖 711 酶分子之間共價交聯和與水不溶性載體共價偶聯 酶分子；（a）酶分子之間用雙功能基團的化學交聯試劑相互交聯成水不溶性的固定化酶；（