第2章細胞生物學技術

1、第二章細胞生物學技術第二章細胞生物學技術細胞形態(tài)結構的觀察方法細胞形態(tài)結構的觀察方法細胞組分的分析方法細胞組分的分析方法細胞培養(yǎng)、細胞工程與顯微操作技術細胞培養(yǎng)、細胞工程與顯微操作技術1 細胞形態(tài)結構的觀察方法細胞形態(tài)結構的觀察方法 光學顯微鏡技術光學顯微鏡技術 電子顯微鏡技術電子顯微鏡技術 掃描隧道顯微鏡掃描隧道顯微鏡光學顯微鏡光學顯微鏡：以可見光可見光（或紫外線紫外線）為光源。電子顯微鏡電子顯微鏡：以電子束電子束為光源。1. 構成：構成： 照明系統(tǒng)照明系統(tǒng) 光學放大系統(tǒng)光學放大系統(tǒng) 機械裝置機械裝置2. 原理：原理： 經(jīng)物鏡形成倒立實像，經(jīng)物鏡形成倒立實像，經(jīng)目鏡進一步放大成像。經(jīng)目鏡進一

2、步放大成像。（一）普通光學顯微鏡（一）普通光學顯微鏡1.物鏡轉(zhuǎn)換器 2.接物鏡 3.游標卡尺 4.載物臺 5.聚光器 6.彩虹光闌 7.光源 8.鏡座 9.電源開關 10.光源滑動變阻器 11.粗調(diào)螺12.微調(diào)螺旋 13.鏡臂 14.鏡筒 15.目鏡 16.標本移動螺旋3. 分辨率分辨率：指區(qū)分開兩個質(zhì)點間的最小距離。 分辨距離越小，則分辨能力越高。分辨距離越小，則分辨能力越高。R=0.61/NA為入射光線波長；為入射光線波長；NA（鏡口率）（鏡口率） sin/2，n=介質(zhì)折射率；=物鏡鏡口角（樣品對物鏡鏡口的張角） 。思考：如何提高顯微鏡的分辨能力？如何提高顯微鏡的分辨能力？NA：顯微鏡物鏡

3、的鏡口率鏡口率光學性能指標，每個物鏡上都標有其鏡口率的數(shù)值）。幾種介質(zhì)的折射率幾種介質(zhì)的折射率物鏡鏡口率受入射鏡口角入射鏡口角和介質(zhì)折射率介質(zhì)折射率的限制，不可能有更大提高。所以科學家們從另外兩個途徑來改進改進顯微鏡：換用短波長的換用短波長的“照明光源照明光源”，來提高分辨能力。如：紫外光顯微鏡，電子顯微鏡。應用特殊光學效應，應用特殊光學效應，增強反差，來提高分辨能力。（二）熒光顯微鏡（二）熒光顯微鏡 Fluorescence microscope特點：光源為紫外線光源為紫外線，波長較短，分辨能力高于普通顯微鏡；有兩個特殊的濾光片兩個特殊的濾光片；照明方式通常為落射式落射式。（二）熒光顯微鏡（

4、二）熒光顯微鏡 Fluorescence microscope原理：原理：以紫外光為光源，使被檢材料中的熒光物質(zhì)激發(fā)出熒光，從而對細胞內(nèi)某些物質(zhì)進行定性和定位分析。熒光現(xiàn)象有兩種：（）自發(fā)熒光：（）自發(fā)熒光：細胞內(nèi)某些天然熒光物質(zhì)天然熒光物質(zhì)被紫外光照射所激發(fā)的熒光，例如葉綠素葉綠素（血紅色自發(fā)熒光）；（）誘發(fā)熒光：（）誘發(fā)熒光：在細胞中加入熒光染料（熒熒光染料（熒光素）光素），與細胞內(nèi)某種特定成分結合在一起，經(jīng)紫外光照射激發(fā)出熒光。 例：熒光染料例：熒光染料吖啶橙吖啶橙，可使RNA發(fā)出紅色熒光，而使DNA發(fā)出綠色熒光。熒光顯微鏡與普通光鏡在結構上不同之處：熒光顯微鏡與普通光鏡在結構上不同之處

5、：（1）紫外光發(fā)生裝置紫外光發(fā)生裝置：高壓汞燈：高壓汞燈+激發(fā)裝置激發(fā)裝置+濾光濾光裝置；裝置；（2）透鏡由石英玻璃制成透鏡由石英玻璃制成，以便減少光通路上的紫，以便減少光通路上的紫外光損耗；外光損耗；（3）目鏡中要裝壓紫濾片目鏡中要裝壓紫濾片F(xiàn)luorescence image of epithelial cell, DNA in blue and Microtubules in green用于觀察能激發(fā)出熒光的結構。用途：免疫熒光觀察、基因定位、疾病診斷。（三）相差顯微鏡（三）相差顯微鏡原理：原理：光波的三個光學特性：光波的三個光學特性：（1）波長波長：對于光波波長變化，肉眼覺察為顏色變化

6、顏色變化;（2）振幅振幅：對于光波振幅變化（即振幅差），肉眼覺察為明暗變化明暗變化；（3）相位：相位：指某一時刻，光在其前進路線上的位置。對于光相位的變化（即相位差），肉眼不能覺察肉眼不能覺察。當光線穿過當光線穿過無色透明無色透明且且非勻質(zhì)非勻質(zhì)的活細胞，其波的活細胞，其波長和振幅都無明顯變化，長和振幅都無明顯變化，僅光相位出現(xiàn)一定程僅光相位出現(xiàn)一定程度變化度變化。觀察時感覺觀察時感覺反差較小反差較小，物體內(nèi)部的結構難分辨。，物體內(nèi)部的結構難分辨。為何普通光鏡不適宜用于觀察活細胞？為何普通光鏡不適宜用于觀察活細胞？把透過標本的可見光的光程差光程差變成變成振幅差振幅差，從而提高了各種結構間的對比

7、度。在構造上，相差顯微鏡的兩個特殊之處。 環(huán)形光闌環(huán)形光闌（annular diaphragm）：位于光源與聚光器之間。作用：作用：使透過聚光器的光線形成空心光錐，聚焦到標本上。使透過聚光器的光線形成空心光錐，聚焦到標本上。1.相差板相差板（annular phaseplate）：物鏡后加了涂有氟化鎂的相差板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4。相相 差差 顯顯 微微 鏡鏡 原原 理理相差顯微鏡卻是運用一些特殊裝置，使通過被檢物體的光線分離成兩組光波，并人為地使人為地使這這兩組兩組光波之間微弱的相位差加大，光波之間微弱的相位差加大，再經(jīng)過光波光波干涉干涉作用，使看不見的相位差轉(zhuǎn)變成可見的振相位

8、差轉(zhuǎn)變成可見的振幅差幅差，從而反差增強反差增強，便能夠清晰看到被檢物體及其內(nèi)部細微結構了。相差顯微鏡下的樣品不需染色，相差顯微鏡下的樣品不需染色，可以清晰觀察活細胞及其內(nèi)部結構的變化。相相 差差 顯顯 微微 鏡用途：觀察未經(jīng)染色的玻片標本鏡用途：觀察未經(jīng)染色的玻片標本二、電子顯微鏡二、電子顯微鏡（一）透射電子顯微鏡一）透射電子顯微鏡transmission electron microscope, TEM不同光線的波長不同光線的波長以電子束作光源電子束作光源，電磁場作透鏡電磁場作透鏡。電子束的波長短，并且波長與加速電壓(通常50120KV)的平方根成反比。由電子束照明系統(tǒng)電子束照明系統(tǒng)、電磁透

9、鏡成像系統(tǒng)電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)真空系統(tǒng)、記錄記錄系統(tǒng)系統(tǒng)等部分構成。分辨率分辨率0.2nm，放大倍數(shù)可達百萬倍。用于觀察超微結構觀察超微結構（ultrastructure），即小于0.2m、光學 顯 微 鏡 下 無 法 看 清 的 結 構 ， 又 稱 亞 顯 微 結 構（submicroscopic structures）。（1）照明光源不同。照明光源不同。（2）放大倍數(shù)的調(diào)節(jié)方式不同。放大倍數(shù)的調(diào)節(jié)方式不同。 依靠改變磁透鏡的激磁電流強度來調(diào)節(jié)放大倍數(shù)。電流強度的變化引起了磁場強度的改電流強度的變化引起了磁場強度的改變變，而磁場強度的變化又使電子射線的折射程使電子射線的折射程度發(fā)生改變

10、度發(fā)生改變，放大倍數(shù)隨之出現(xiàn)變化放大倍數(shù)隨之出現(xiàn)變化。（3）具有高壓穩(wěn)壓系統(tǒng)。具有高壓穩(wěn)壓系統(tǒng)。 電子流的發(fā)射速度及波長皆取決于電壓的高低。透射電子顯微鏡特點透射電子顯微鏡特點（4）高度真空的工作系統(tǒng)。高度真空的工作系統(tǒng)。 高速運動的電子流如果與空氣中的微粒和分子碰撞，就會改變它的發(fā)射方改變它的發(fā)射方向，導致成像模糊向，導致成像模糊。 要求電鏡內(nèi)的工作系統(tǒng)（包括樣品室）都必須保持高度真空狀態(tài)，并且樣品都必須脫水。 因此說，透射電鏡不能用來觀察活透射電鏡不能用來觀察活的樣品。的樣品。透射電子顯微鏡特點透射電子顯微鏡特點（5）樣品厚度必須樣品厚度必須 25kr/min。第二節(jié)第二節(jié) 細胞組分的分析

11、方法細胞組分的分析方法（一）差速離心（一）差速離心 Differential centrifugation特點特點：介質(zhì)密度均一介質(zhì)密度均一；速度由低向高速度由低向高，逐級離心。用途用途：分離大小相差懸殊的細胞和細胞器。沉降順序沉降順序 細胞核細胞核線粒體線粒體溶酶體溶酶體、過氧化物酶體過氧化物酶體微微體、高爾基體、囊泡體、高爾基體、囊泡核蛋白體核蛋白體。細胞器初步分離后，再通過密度梯度離心純化。細胞器初步分離后，再通過密度梯度離心純化。（一）差速離心（一）差速離心 Differential centrifugation（二）密度梯度離心（二）密度梯度離心用介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一用介質(zhì)在離心管內(nèi)

12、形成一連續(xù)連續(xù)或或不連續(xù)不連續(xù)的的密度梯密度梯度度，將細胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過，將細胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過離心力場的作用使細胞分層、分離。離心力場的作用使細胞分層、分離。類型類型：速度沉降、等密度沉降。：速度沉降、等密度沉降。常用介質(zhì)常用介質(zhì)：氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。：氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。1、速度沉降、速度沉降 velocity sedimentation 用途用途：分離密度相近密度相近而大小不等大小不等的細胞或細胞器。特點特點：介質(zhì)密度較低。原理原理：介質(zhì)密度梯度平緩，分離物按各自的沉降系數(shù)沉降系數(shù)以不同的速度沉降。2.等密度沉降等密度沉降 isopycnic s

13、edimentation用途用途：分離分離密度不等密度不等的顆粒。的顆粒。特點特點：介質(zhì)密度較高，陡度大。原理原理：樣品各成分各成分在連續(xù)梯度的介質(zhì)中，經(jīng)過離心，沉降到與自身密度相等的介質(zhì)沉降到與自身密度相等的介質(zhì)處處，并停留在那里達到平衡。Velocity (A) and Equilibrium (B) sedimentation二、細胞成分的細胞化學顯示方法二、細胞成分的細胞化學顯示方法顯色劑顯色劑能與待測物質(zhì)中一些特殊基團特異性結合。通過顯色劑在細胞中的定位定位及顏色的深淺顏色的深淺，判斷某種物質(zhì)在細胞中的分布和相對含量。孚爾根反應孚爾根反應：特異顯示DNAPAS反應反應：多糖多糖米倫反

14、應米倫反應：蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)四氧化鋨四氧化鋨、蘇丹紅蘇丹紅：不飽和脂肪酸不飽和脂肪酸、脂滴脂滴格莫瑞法（Gomori）：堿性磷酸酶堿性磷酸酶三、特異蛋白抗原的定位與定性三、特異蛋白抗原的定位與定性免疫熒光技術免疫熒光技術：將將免疫學方法免疫學方法（抗原（抗原抗體抗體特異結合）與特異結合）與熒光標記技術熒光標記技術相結合，用于研相結合，用于研究特異蛋白抗原在細胞內(nèi)分布的方法。究特異蛋白抗原在細胞內(nèi)分布的方法。四、細胞內(nèi)特異核酸的定位與定性四、細胞內(nèi)特異核酸的定位與定性原位雜交原位雜交（in situ hybridization）：用）：用標記標記的的核酸探核酸探針針，通過分子雜交，確定特異核苷酸序列

15、在染色體，通過分子雜交，確定特異核苷酸序列在染色體上或在細胞中的位置的方法。上或在細胞中的位置的方法。標記探針方法標記探針方法1、放射性同位素標記（顯微放射自顯影）、放射性同位素標記（顯微放射自顯影）2、熒光素標記（熒光顯微鏡觀察）、熒光素標記（熒光顯微鏡觀察）3、生物素標記、生物素標記五、流式細胞術五、流式細胞術用途用途：對：對單個細胞單個細胞進行快速進行快速定量分析與分選定量分析與分選。原理原理：包在鞘液中的細胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含包在鞘液中的細胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個細胞的液滴；單個細胞的液滴；激光束的照射下，細胞發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測器檢激光束的照射下，細胞

16、發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測器檢測，轉(zhuǎn)換為電信號，送入計算機處理，輸出統(tǒng)計結果。測，轉(zhuǎn)換為電信號，送入計算機處理，輸出統(tǒng)計結果。第三節(jié)第三節(jié) 細胞培養(yǎng)與細胞工程細胞培養(yǎng)與細胞工程（一）群體培養(yǎng)和克隆培養(yǎng)（一）群體培養(yǎng)和克隆培養(yǎng)群體培養(yǎng)群體培養(yǎng)（mass culture）：將含有）：將含有一定數(shù)量細胞的懸液一定數(shù)量細胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細胞置于培養(yǎng)瓶中，讓細胞貼壁生長貼壁生長，匯合后形成均勻的，匯合后形成均勻的單細單細胞層胞層；克隆培養(yǎng)克隆培養(yǎng)（clonal culture）：培養(yǎng)）：培養(yǎng)高度稀釋的細胞懸液高度稀釋的細胞懸液，細胞貼壁生長，每個細胞形成一個細胞貼壁生長，每個細胞形成一個細胞集落細

17、胞集落（克隆克隆）。）。一、細胞培養(yǎng)一、細胞培養(yǎng)（一）群體培養(yǎng)（左）和克隆培養(yǎng)（右）（一）群體培養(yǎng)（左）和克隆培養(yǎng)（右）原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)（primary culture）：培養(yǎng)直接來自）：培養(yǎng)直接來自動物機體的細胞群。動物機體的細胞群。傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)（Passage）：將細胞從一個培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)）：將細胞從一個培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到另外一個培養(yǎng)瓶。移到另外一個培養(yǎng)瓶。 傳代細胞傳代細胞：適應在體外培養(yǎng)條件下，持續(xù)傳代培：適應在體外培養(yǎng)條件下，持續(xù)傳代培養(yǎng)的細胞。養(yǎng)的細胞。（二）動物細胞培養(yǎng)（二）動物細胞培養(yǎng)Hela 細胞（細胞（a) 和和 CHO （b) 細胞的培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)細胞株細胞株（cell stra

18、in）：從原代培養(yǎng)細胞群原代培養(yǎng)細胞群中篩選出的具有特定性質(zhì)特定性質(zhì)或標志的細胞群標志的細胞群。細胞系細胞系（cell line）：從腫瘤組織腫瘤組織培養(yǎng)培養(yǎng)建立的細胞群或培養(yǎng)過程中發(fā)生突變突變或轉(zhuǎn)化的細胞轉(zhuǎn)化的細胞，可無限繁殖。 克隆克?。╟lone）：由同一個祖先細胞通過有絲分裂產(chǎn)生的遺傳性狀一致遺傳性狀一致的的細胞群細胞群。（三）植物細胞培養(yǎng)（三）植物細胞培養(yǎng)外植體培養(yǎng)外植體培養(yǎng)：誘導產(chǎn)生愈傷組織。研究：誘導產(chǎn)生愈傷組織。研究植物的植物的生長發(fā)育、分化生長發(fā)育、分化和變異；和變異；無性繁無性繁殖殖；制取代謝產(chǎn)物。；制取代謝產(chǎn)物。懸浮細胞培養(yǎng)懸浮細胞培養(yǎng)：產(chǎn)業(yè)化產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模細胞培養(yǎng)，大規(guī)模細胞培養(yǎng)，制取植物代謝產(chǎn)物。制取植物代謝產(chǎn)物。（三）植物細胞培養(yǎng)（三）植物細胞培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)：培養(yǎng)脫壁后的細胞。：培養(yǎng)脫壁后的細胞。 特點：特點：比較容易比較容易攝取外來的遺傳物質(zhì)攝取外來的遺傳物質(zhì)，如，如DNA；便于進行便于進行細胞融合細胞融合，形成雜交細胞；，形成雜交細胞；細胞壁可再生，經(jīng)誘導分化成完整植株。細胞壁可再生，經(jīng)誘導分化成完整植株。