細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)報(bào)告專業(yè)：生物技術(shù)班級：0801姓名：勵(lì)丹學(xué)號：一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解動物細(xì)胞培養(yǎng)的相關(guān)實(shí)驗(yàn)器材以及實(shí)驗(yàn)前器材的清洗與消毒、無菌室滅菌與消毒等基本方法，以建立起無菌操作的概念。2、了解和掌握動物細(xì)胞原代培養(yǎng)的基本方法，熟悉組織塊法和消化法培養(yǎng)的基本操作過程。初步掌握無菌操作技術(shù)。3、學(xué)習(xí)與了解細(xì)胞超低溫凍存于復(fù)蘇的基本原理，初步掌握培養(yǎng)細(xì)胞常規(guī)超低溫凍存于復(fù)蘇以及玻璃化超低溫凍存于復(fù)蘇的方法。4、掌握ELISA測定抗體效價(jià)的方法，細(xì)胞的超低溫凍存和復(fù)蘇，及MTT法測定細(xì)胞活性的方法。5、學(xué)習(xí)和掌握制備飼養(yǎng)層細(xì)胞的方法，為雜交瘤細(xì)胞的制備做準(zhǔn)備。6、學(xué)習(xí)從脾臟組織制備免疫細(xì)胞的方法，從

2、免疫脾臟中制備免疫細(xì)胞懸液，用于雜交瘤細(xì)胞的融合。7、學(xué)習(xí)和掌握動物細(xì)胞融合的基本方法，通過免疫脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合制備雜交瘤細(xì)胞，并進(jìn)行選擇。8、學(xué)會細(xì)胞形態(tài)的觀察和分析，細(xì)胞技術(shù)等細(xì)胞培養(yǎng)中常見的問題。二、實(shí)驗(yàn)原理1、原代培養(yǎng)原代細(xì)胞培養(yǎng)是指直接從動物體內(nèi)獲取的細(xì)胞、組織或器官，經(jīng)體外培養(yǎng)后直到第一次傳代為止。原代培養(yǎng)首先用無菌操作的方法，從動物體內(nèi)取出所需的組織或器官，切成一定大小的組織塊，直接或經(jīng)消化分散成單個(gè)游離的細(xì)胞，在人工培養(yǎng)條件下，使其不斷地生長、繁殖。2、細(xì)胞活性測定一一MTT法MTT法是利用細(xì)胞線粒體呼吸鏈上的琥珀酸脫氫酶四氮唑藍(lán)還原成難溶的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚，經(jīng)二甲基亞砜（

3、DMSO）溶解后，在490nm處測吸收值，其吸收值可間接反映細(xì)胞的活性狀態(tài)及活細(xì)胞數(shù)量。3、培養(yǎng)細(xì)胞的超低溫凍存于復(fù)蘇為了保持細(xì)胞株（系）遺傳的穩(wěn)定性以及非連續(xù)使用細(xì)胞的長期保存，建立了細(xì)胞超低溫凍存于復(fù)蘇技術(shù)。目前細(xì)胞超低溫凍存技術(shù)主要有兩種方法，即常規(guī)超低溫凍存和玻璃化超低溫凍存?；罴?xì)胞在超低溫下克服了分子間的熱運(yùn)動，因而可長期保存而不影響活力。在不加任何條件下直接凍存細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會形成冰晶，能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生機(jī)械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、PH改變、蛋白變性等，能引起細(xì)胞死亡。如向培養(yǎng)液加入保護(hù)劑，可使冰點(diǎn)降低。在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水份在凍結(jié)前透出細(xì)胞。

4、貯存在一130C以下的低溫中能減少冰晶的形成。4、飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備在體外培養(yǎng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，對于難養(yǎng)的細(xì)胞或者數(shù)量較少的細(xì)胞，常常需要預(yù)先在培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板底部加入一些活的原代細(xì)胞或者靜息的腫瘤細(xì)胞以輔助目的細(xì)胞的生長，這就是飼養(yǎng)層細(xì)胞。它可能在飼養(yǎng)細(xì)胞的生長過程中會釋放一些細(xì)胞生長刺激因子或提供細(xì)胞接觸的信號。5、免疫脾細(xì)胞的制備小鼠經(jīng)抗原多次免疫后，可從脾臟組織細(xì)胞分裂和分化出較多能分泌相應(yīng)抗體的B淋巴細(xì)胞，脾臟內(nèi)細(xì)胞連接不緊密可通過機(jī)械分離和過濾網(wǎng)篩選，將這些細(xì)胞制備成游離的單個(gè)細(xì)胞懸液。6、雜交瘤細(xì)胞的制備（細(xì)胞融合）通過對免疫動物B細(xì)胞和某一個(gè)永久細(xì)胞系進(jìn)行融合，雜交后代稱之為雜交瘤。雜交

5、瘤細(xì)胞可以將分泌特異性抗體B細(xì)胞的遺傳特性和骨髓瘤細(xì)胞系體外增殖的遺傳特性合二為一。一種淋巴細(xì)胞克隆只產(chǎn)生一種特異性抗體；細(xì)胞融合技術(shù)產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞可以保持親代雙方的特性；雜交瘤細(xì)胞的篩選，體外培養(yǎng)大量增殖，獲得所需抗體。7、ELISA檢測使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時(shí)，把受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的

6、量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺刊物定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可極大地地放大反應(yīng)效果，從而使測定方法達(dá)到很高的敏感度。三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1、動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)2、雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體制備3、細(xì)胞工程相關(guān)技術(shù)1）動物細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)器材的準(zhǔn)備無菌室：首次啟用的無菌室一般可采用福爾馬林熏蒸（56m2無菌室用KMnO450g，倒入100ml甲醛（用搪瓷盤），冒濃煙，24hr，氨水中和至無甲醛味），經(jīng)常使用的無菌室在每次實(shí)驗(yàn)前必須開啟紫外燈照射至l小時(shí)，然后避光至l小時(shí)后方可進(jìn)入操作。培養(yǎng)器材的消毒：干熱滅菌

7、法：玻璃器皿、金屬器具等的消毒方法，140150C,23小時(shí)；濕熱滅菌法：橡膠制品、無菌衣、帽和口罩以及除菌過濾器的清毒，高壓蒸汽滅菌15磅2030分鐘；紫外線照射滅菌：多孔培養(yǎng)板的滅菌30分鐘。抽濾除菌：培養(yǎng)基等（培養(yǎng)基通過過濾裝置除菌）2）雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體制備1、小鼠的免疫方法：脾臟直接注射：一般免疫后34天即可制備抗體。其它途徑注射：一般采用間隔免疫的方法，分3次，間隔23周進(jìn)行免疫。步驟：取綿羊靜脈血（加肝素或枸櫞酸鈉抗凝）用NaCI或PBS10001500rpm離心5分鐘滌洗3次，收集血細(xì)胞。血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用NaCI或PBS調(diào)整細(xì)胞濃度至4X10個(gè)/ml（10個(gè)/小格）。向小

8、鼠腹腔注射血細(xì)胞懸液。每隔15天重復(fù)注射作加強(qiáng)免疫，共重復(fù)2次，第2次加強(qiáng)免疫后10天，檢測血清效價(jià)，若血清效價(jià)低則要繼續(xù)免疫。小鼠處死前23天加強(qiáng)免疫1次，以活化B淋巴細(xì)胞。注：細(xì)胞計(jì)數(shù)：一個(gè)大方格被分成16個(gè)中方格。每一個(gè)大方格邊長為1mm，蓋上蓋玻片后，載玻片與蓋玻片之間的高度為，所以計(jì)數(shù)室的容積為。一個(gè)大方格被分成16個(gè)中方格。每一個(gè)大方格邊長為1mm，蓋上蓋玻片后，載玻片與蓋玻片之間的高度為，所以計(jì)數(shù)室的容積為。細(xì)胞濃度（個(gè)/ml）=細(xì)胞數(shù)/體積即：細(xì)胞濃度（個(gè)/ml）=一個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)X104。打入的免疫紅細(xì)胞數(shù)要在一定范圍內(nèi)，細(xì)胞數(shù)量太多會免疫耐受；太少得到的免疫細(xì)胞數(shù)少。2、小

9、鼠血清的制備取五只沒有免疫過的小鼠-每只小鼠眼球取血以上于ImLEP管中一小鼠短頸處死后，放于裝有75%酒精的燒杯中消毒滅菌，帶入無菌室備用一一取出血清放于37C水浴保溫30min2000轉(zhuǎn)離心10min取上清于干凈的離心管中，作為ELISA的陰性對照取五只免疫過的小鼠一一同上操作一一取血清作為ELISA的陽性對照4、骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)1、選擇生長旺盛，形態(tài)良好的細(xì)胞2、將上清倒入離心管內(nèi)，剩余貼壁的細(xì)胞用EDTA消化液消化細(xì)胞5分鐘后倒入同一離心管，10001500rpm離心5分鐘，收集細(xì)胞。3、加6mL含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，分裝于兩個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，5%CO2培養(yǎng)箱37C培養(yǎng)

10、。5、飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備1、每組1只小鼠，斷頸處死后浸泡在75乙醇消毒5分鐘。2、在無菌室內(nèi)小心剪開小鼠腹部皮膚，暴露腹腔，用注射器腹腔注射34ml1640培養(yǎng)液，按摩片刻。3、左手用鑷子夾起腹腔肌肉，右手用剪刀剪開一個(gè)小口，小心用吸管吸出腹腔液體于離心管。4、低速離心洗滌細(xì)胞一次后，用1215ml1640培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞（5X10）取100200I滴96孔板（一般用吸管滴23滴）。5、免疫脾細(xì)胞的制備1. 將免疫過并取完血清后的浸泡在75乙醇中的小鼠帶入無菌室。2. 小心剪開腹腔，取出脾臟。3用一次性注射器將脾臟刺幾個(gè)洞，再吸34mLPBS液吹打脾臟。4. 收集吹打的細(xì)胞懸液，經(jīng)低速離心洗滌后將

11、細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)液。6、雜交瘤細(xì)胞的制備（細(xì)胞融合）1. 將骨髓瘤細(xì)胞（2X107）與脾細(xì)胞按1:10的比例混合，低速離心后棄上清，用手指彈勻細(xì)胞。2將1mL50%的PEG在1分鐘內(nèi)緩緩加到混合的細(xì)胞內(nèi)，注意邊滴加PEG邊搖動離心管。作用1分鐘后，迅速滴加培養(yǎng)液終止PEG作用，低速離心洗滌細(xì)胞。4用10mLDEME培養(yǎng)液懸浮融合細(xì)胞，按每孔3滴的量滴加到含滋養(yǎng)層的96孔板內(nèi)，置37C5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（注：因?yàn)閷?shí)驗(yàn)時(shí)間有限，我們只是操練單克隆抗體的制備方法和過程，并沒有制備到單克隆抗體，但是單克隆抗體的制備過程和操作注意事項(xiàng)已經(jīng)基本了解。）3）原代細(xì)胞的培養(yǎng)組織塊法培養(yǎng)小鼠肝臟組織:1取出

12、肝臟，經(jīng)PBS漂洗三次后，放在表面皿中。2在表面皿中，用滴管加入少量PBS（RPMI1640含20%小牛血清，白蛋白，10ug/ml胰島素，100U青霉素和鏈霉素）用鋒利的剪刀將組織塊剪成約1mm3的小塊。3用彎頭鑷子將組織小塊移入細(xì)胞瓶中，把它們排列成行，每塊組織相距約，每瓶細(xì)胞貼2030小塊，隨即翻轉(zhuǎn)細(xì)胞瓶，使貼組織塊的一面朝上，然后加培養(yǎng)液3ml。4將細(xì)胞瓶置于37C,5%C02培養(yǎng)箱中靜置24小時(shí)，然后將瓶輕輕翻轉(zhuǎn)，使組織塊浸入培養(yǎng)液中，繼續(xù)靜止培養(yǎng)。5. 72小時(shí)后在顯微鏡下檢查，若見細(xì)胞自組織邊緣長出，則繼續(xù)培養(yǎng)3-5日，再換部分或全部培養(yǎng)液，待多數(shù)組織塊的生長暈相接時(shí)，可進(jìn)行傳代

13、培養(yǎng)。肝細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果：若培養(yǎng)液顯為淡黃且清澈，一般顯示細(xì)胞生長良好。培養(yǎng)35日，在相差顯微鏡下觀察，若見細(xì)胞自組織邊緣長出，更換部分或全部培養(yǎng)液，待多數(shù)組織塊的生長暈相接，小心挑掉組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)34天。7天左右后，生長暈擴(kuò)大到直徑為15mm左右小鼠肝臟細(xì)胞原代培養(yǎng)的生長暈是多角形上皮樣細(xì)胞與梭形細(xì)胞混合的細(xì)胞群體。2448小時(shí)后若培養(yǎng)液變成黃色且混濁，表示已被污染；若培養(yǎng)液變成紫色，一般細(xì)胞生長不好，則培養(yǎng)液pH過高；消化法培養(yǎng)小鼠腎細(xì)胞:1、將消毒過的小鼠，剖腹取出腎臟于放有PBS的培養(yǎng)皿中洗滌。2、盡量剪碎腎臟。3、用PBS洗滌23次。4、力口入5mL胰酶，37C（30min）。5

14、、過篩，1000轉(zhuǎn)離心10min，用PBS洗滌23次。6、加培養(yǎng)液，計(jì)數(shù)至35X1O3MI.個(gè)每中格）。7、細(xì)胞懸液裝瓶3mL放于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。4）抗體IgGELISA檢測1取綿羊紅細(xì)胞，加6mlPBS1OOOrpm離心10min洗滌，重復(fù)一次。2. 取下層紅細(xì)胞，加磷酸鹽緩沖液（Na2HPO45mmoI/L,NaH2PO45mmoI/L）（低滲）混勻后，常溫處理2025min,4C1200013000rpm離心15min，去上清，重復(fù)一次。3. 取乳白色沉淀（血影）用包被液稀釋至后，按50g（老師制備）加入96孔酶標(biāo)板內(nèi)，放于濕盒4C冰箱過夜，備用。4. 吸去孔中的抗原液（自制吸頭，這樣

15、沖擊力會小，不會使包被的抗原脫落），用洗滌液洗滌3次（將洗滌液沿孔壁注入200L/孔，放置3分鐘，甩去洗滌液，重新注入），加封閉液（含1%牛血清白蛋白的洗滌液）200L/孔，封閉30min。5. 甩去封閉液，用洗滌液3次。6待測抗體作1:500、1:1000、1:2500、1:5000稀釋后，按每孔100uL加入，置濕盒內(nèi)于37C作用1小時(shí)。同時(shí)設(shè)陰性、陽性、空白對照（調(diào)零孔）。7用洗滌液3次。8每孔加適當(dāng)稀釋的酶標(biāo)兔抗鼠IgG試劑100uL,置濕盒內(nèi)37C作用1小時(shí)。9用洗滌液3次。10每孔加入100uL新配制的底物溶液（TMB）,暗處室溫作用5-10分鐘。11每孔加100UL2MH2SO4

16、終止反應(yīng)，檢測。12.用酶聯(lián)免疫檢測儀測定OD450nm光吸收值，若試驗(yàn)孔的光吸收值比陰性孔的光吸收值大于或等于，可判定為陽性。（注：TMB,2MH2SO4操作時(shí)要帶手套，TMB中有過氧化氫對皮膚有腐蝕作用。酶標(biāo)板在操作過程中不能用手接觸其底部，會影響折光率，在測吸光值時(shí)板底的水要擦干。）5）細(xì)胞的超低溫凍存與復(fù)蘇1小鼠斷頸處死后，分別取腎臟（剪碎）、脾臟（注射器吹打）細(xì)胞，10001500rpm離心5min，收集細(xì)胞。2用1640培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至5X1062X個(gè)7ml，分裝成3管，每管，經(jīng)以下處理后-196C（液氮）凍存過夜。分組：A組：直接凍存；B組：細(xì)胞懸浮在10%D

17、MSO-1640培養(yǎng)液中凍存；C組：細(xì)胞先經(jīng)10%濃度的玻璃化保護(hù)劑處理（PVS2,4C過渡5min，然后4C1000rpm離心10min，棄上清，再用100%PVS2保護(hù)劑，4C過渡5min后凍存；（注：為了MTT法測定細(xì)胞活性比較三種方法時(shí)減小誤差，按C組平行離心AB組。）3、MTT法測定細(xì)胞活性1從液氮中取出凍存管，直接投入3740C的水浴中，并不時(shí)搖動，使其快速（1分鐘之內(nèi)）融化。2轉(zhuǎn)移到離心管后，加1640培養(yǎng)液，1500rpm離心5min，棄上清，收集細(xì)胞。3用1640培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞后，再加80uLMTT反應(yīng)液，37C水浴中培養(yǎng)3小時(shí)。2000rpm離心5min,棄上清，收集細(xì)胞；

18、再用800uLDMSO溶解細(xì)胞，按每孔200uL的量轉(zhuǎn)移至96孔酶標(biāo)板內(nèi)，室溫放置10分鐘，并不時(shí)搖動，以溶解細(xì)胞。吸收值（OD570）6比較不同處理方法，細(xì)胞的存活情況。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析1、細(xì)胞培養(yǎng)觀察：培養(yǎng)液顯為淡黃且清澈，無污染現(xiàn)象；細(xì)胞呈球狀，密集2、細(xì)胞的超低溫凍存與復(fù)蘇后活性檢測：OD1'2'3'4'123456781-1：調(diào)零孔2-1、2、3、4：腎細(xì)胞直接凍存3-1、2、3、4：腎細(xì)胞加10%DMSO凍存4-1、2、3、4：腎細(xì)胞玻璃化凍存2-5、6、7、&脾細(xì)胞直接凍存3-5、6、7、&脾細(xì)胞加10%DMSO凍存4-5、6、7

19、、&脾細(xì)胞加玻璃化凍存就結(jié)果而言：加10%DMSO凍存的細(xì)胞存活率最高，而理論上是玻璃化凍存的細(xì)胞存活率最高。從液氮中取出時(shí)玻璃化凍存也結(jié)成冰晶，與理論不符，實(shí)驗(yàn)存在問題。我們小組將兩只小鼠的細(xì)胞混在一起，細(xì)胞數(shù)增多，損傷也增多。3、ELISA檢測：OD1'2'3'4'5'6'7'8'9'1011'12'123456781'1:調(diào)零孔加入底物溶液（TMB）后，陽性孔呈藍(lán)色，陰性孔無色;加入終止液后，陽性孔呈黃色，陰性孔無色。結(jié)果（OD):陰性對照：0.016251:1000:0.13475(

20、0.19625)1:2000:0.1305(0.1625)1:4000:0.13175(0.12775)1:8000:0.09525(0.09575)1:16000:0.04575(0.0585)1:32000:0.026(0.0395)1:64000:0.02575(0.04775)1:128000:0.018(0.03275)1:1000/陰性對照：8.292(12.077)1:2000/陰性對照：8.031(10.000)l'2、3、4、5:陰性對照1 6、7:陽性對照2 1、2、3、4:1:10002 5、6、7、8:1:20003 1、2、3、4:1:400008'9

21、'1011于2'3'4'5相同3'5、6、7、8:1:800041、2、3、4:1:1600045、6、7、8:1:3200051、2、3、4:1:640005'5、6、7、8:1:128001:4000/陰性對照：10.54(7.862)1:8000/陰性對照：5.862(5.892)1:16000/陰性對照：2.815(3.600)1:32000/陰性對照：1.6(2.431)1:64000/陰性對照：1.585(2.938)1:128000/陰性對照：1.108(2.015)就結(jié)果而言：以2'3'4'5為準(zhǔn)：1:16

22、000/陰性對照>2.1，為陽性1：32000/陰性對照<2.1，為陰性則效價(jià)為1：16000以891011為準(zhǔn)：1：64000/陰性對照>2.1，為陽性1：128000/陰性對照<2.1，為陰性則效價(jià)為1：64000實(shí)驗(yàn)時(shí)加液可能存在的誤差或不準(zhǔn)確，使液面有高低，影響折光率，使實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確；實(shí)驗(yàn)時(shí)手碰到了酶標(biāo)板底部，留有指紋等，影響折光率，使實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確；測OD值時(shí)酶標(biāo)板底部有水，影響折光率，使實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確五、實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)及討論1、酶聯(lián)反應(yīng)常見問題：1、顯色步驟結(jié)束后，所有孔均無色，陽性對照不顯色原因：錯(cuò)加、漏加試劑底物、顯色劑；洗板及加樣過程中，酶標(biāo)受污染失活，失

23、去催化顯色劑顯色的能力；終止液誤做洗滌液或底物溶液配制；蒸餾水有問題2、所有孔均較淡原因：加入試劑的體積和時(shí)間有誤，或移液器槍頭不潔；洗板及加樣過程中，酶標(biāo)受污染失活，失去催化顯色劑顯色的能力；培養(yǎng)時(shí)間及溫度為達(dá)到要求；洗板次數(shù)過多，或洗滌液不符合要求，洗滌沖擊力太大，浸泡時(shí)間過久；底物作用時(shí)間不夠3、陰陽性對照正常，待測品未檢出原因：樣品高溫放置過久，或反復(fù)凍溶致待測物濃度下降4、出現(xiàn)隨機(jī)性的花板、跳板現(xiàn)象原因：樣品離心不完全，反應(yīng)孔內(nèi)發(fā)生凝血或殘留細(xì)胞成分；加樣時(shí)交叉污染；手工洗板時(shí)造成交叉污染；5、假陽性原因：洗滌不充分，樣品中有其他成分殘留；血清標(biāo)本處理不當(dāng)；加酶量過多；培養(yǎng)溫度超37

24、度，或酶結(jié)合物反應(yīng)時(shí)間或底物顯色超時(shí)；底物或樣品污染2、細(xì)胞超低溫凍存于復(fù)蘇的要點(diǎn)1.冷凍速度冷凍速度也就是降溫的速度，它與冷凍效果直接相關(guān)。冷凍速度、細(xì)胞收縮引起細(xì)胞膜和細(xì)胞器的變化是造成損傷的主要因素目。冷凍速度不同，細(xì)胞內(nèi)水分向細(xì)胞外流動的情況也會不同。如果冷凍速度過慢，細(xì)胞內(nèi)水分外滲多，細(xì)胞脫水，體積縮小，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)濃度增高，細(xì)胞內(nèi)不發(fā)生結(jié)冰；冷凍速度過快，細(xì)胞內(nèi)水分沒有足夠時(shí)間外滲，隨著溫度的下降，細(xì)胞內(nèi)會發(fā)生結(jié)冰；如果冷凍速度非?？欤?xì)胞內(nèi)形成的冰晶反而非常小或不結(jié)冰而呈玻璃狀凝固（玻璃化冷凍）。不同細(xì)胞的最適冷凍速度不同，主要取決于水分滲透過程是否與降溫速度相匹配；同時(shí)還取決于細(xì)胞的表面積與體積之比，以及細(xì)胞膜的滲透率。一般來說。小細(xì)胞（如紅細(xì)胞等）對水通透性強(qiáng)，適用于快凍，最佳冷凍速率較高，可達(dá)103oCmin或更高；相反大的細(xì)胞或組織，如直徑100m以上的胚胎，對水的通透性弱，則適于慢凍。此外，最佳冷凍速度還受是否應(yīng)用防凍劑、防凍劑的含量以及培養(yǎng)的細(xì)胞所處的狀態(tài)等多方面的因素影響。目前被普遍接受的是皮膚