綠僵菌論文：蝗綠僵菌CQMa102體表入侵相關(guān)基因MaChy的克隆和分析

1、綠僵菌論文：蝗綠僵菌CQMalO體表入侵相關(guān)基因MaChy的克隆和分析【中文摘要】蝗綠僵菌(Metarhiziumacridum)是一類應(yīng)用廣泛的蟲生真菌，在農(nóng)業(yè)害蟲生物防治中起著重要作用。蟲生真菌的致病力是影響其廣泛使用的主要限制因素，迄今為止，實(shí)驗(yàn)室在前期工作中構(gòu)建了蝗綠僵菌CQMalO在侵染過程中，相比于體內(nèi)，在體表時(shí)期的高表達(dá)的差減文庫，從此文庫中，選擇了蝗綠僵菌CQMalO體表時(shí)期高表達(dá)的一條EST序列，該EST序列長750bp,經(jīng)過比對發(fā)現(xiàn)該序列與其他物種中的氰化物水合酶的同源性較高。利用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的蝗綠僵菌CQMa10在產(chǎn)孢時(shí)期的均一化全長cDNA文庫，獲取了該基因(MaChy

2、的cDNA全長。通過以基因組為模板PCR擴(kuò)增后克隆測序的方式，成功獲取了MaChy基因的DNA全長。利用RNAi的方法研究了MaChy的功能。主要研究結(jié)果如下：獲得了MaChy基因的cDNA全長,并進(jìn)行了相關(guān)生物信息學(xué)分析。MaChyS因cDNA序列全長為1202bp,5'端有80bp的UTR區(qū)域,3'端有50bpUTR區(qū)域，其開放閱讀框?yàn)?074bp。預(yù)測該基因編碼357個(gè)氨基酸,與多個(gè)物種如eptosphaeriamaculans(AAF66098.1)、Aspergillusniger(XP001389844.1)Fusariumsolani(CAM82815.)Neur

3、osporacrassa(XP960160.2)PenicilliumchrysogenumWisconsin(XP002562104.1)、Aspergillusniger(ABX75546.1)、Alternariabrassicicola(AAP88966.1)對應(yīng)所編碼都有97%以上的蛋白同源性。該蛋白沒有信號肽，也不具有跨膜的結(jié)構(gòu)。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示,該蛋白的分子量39.78kDa,等電點(diǎn)為5.53。為酸性蛋白。預(yù)測其在177位（NAS）、206位（NASE、332位（NSTD氨基酸處存在N-糖基化位點(diǎn)；4位（TIR）、77位（SMR、300位（TKK、323位（TPK氨基酸處存

4、在蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)；104位（SELD、134位（THVE、179位（SKHE、341（STLE處有一個(gè)酪蛋白激酶2磷酸化位點(diǎn);122位（GTVINH、144位（GSGDSL238位（GARLGL262位（GNGYSRN-十四?；稽c(diǎn)。通過PCRT增基因組送測序后，獲取了MaChy基因的DNA全長，將DNA序列與cDNA序列用DNAMA軟件比對，結(jié)果顯示:MaChy基因不含內(nèi)含子，DNA全長1202bp。采用RNAi的方法進(jìn)行MaChy基因的功能研究。構(gòu)建MaChy基因的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化的RNA干擾載體后，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化蝗綠僵菌CQMa10中,經(jīng)過培養(yǎng)基的初篩和PCR篩選后,獲得

5、多個(gè)穩(wěn)定的MaChyS因干擾突變株。分析了MaChy#因干擾突變株的毒力變化，統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)干擾突變株和出發(fā)菌株的半數(shù)致死時(shí)間沒有顯著差異，推測MaChyg因的功能與毒力不相關(guān)。觀察干擾突變株與出發(fā)菌株在附著胞形成方面的差異,從多個(gè)角度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，在附著胞形成比率，形成時(shí)間，附著胞形態(tài)，附著胞大小都沒有顯著的差異。分析了MaChy®因在體表和體內(nèi)的表達(dá)差異。統(tǒng)計(jì)定量PCF數(shù)據(jù)得到的結(jié)論顯示，在體表階段的表達(dá)量最高，大約是體內(nèi)表達(dá)量的2.5倍,而在1/4SDA液體培養(yǎng)基中的表達(dá)量與體內(nèi)表達(dá)量基本相同，表明該基因在體表階段是高表達(dá)的?！居⑽恼縏heascomycetesMetarhi

6、ziumacridumwaswellcharacterizedentomopathogenicfungiandwidelyusedinbiologicalcontrolprograms.TheoverallhostrangeofM.acridumisbroad.Duringtheinvasionsteps,theformationofappressoriumwasveryimportant.SocloningandidentificationoftheCharacteristicsofappressoriumformationrelatedgenearenecessarytoclarifyth

7、echaracteristicsofappressoriumformationandotherimportanttraitsrelatedtothemolecularmechanism.BasedontheMetarhiziumacridumCQMa10金ubtractedDNAlibrarywhichconstructedbysuppressionsubtractivehybridization(SSH)beforepenetration.wechoseoneESTwhichwashighlyexpressedbeforepenetration.UsingtheMetarhiziumacri

8、dumCQMa1O0ormalizedfull-lengthcDNAlibraryduringtheconidiationstage,wehavegotthefull-lengthcDNAofMaChyAtthesametime,wegottheDNAofMaChythroughtheDNAofMetarhiziumacridumCQMa102naddition,weuseRNAitoanalysethefunctionofMaChygene.A1202bpDNAfragmentwhichcontainedthefull-lengthMaChygeneaswellasupstreamanddownstreamregulatorysequenceswasclonedandsequeneed.Theputativecodingsequene