正交試驗(yàn)報告

1、主講人：汪雁佳主講人：汪雁佳“救命仙草石斛ShihuDENDROBII CAULIS石斛簡介石斛簡介 我石斛屬蘭科石斛屬多年生草本植物，我石斛屬蘭科石斛屬多年生草本植物，全世界約有全世界約有1400 1400 種，其中鐵皮石斛種，其中鐵皮石斛(Dendrobium candidumWal.l exLind.l )是我是我國常見的石斛品種之一。國常見的石斛品種之一。 鐵皮石斛具有抗腫瘤、抗氧化、降血鐵皮石斛具有抗腫瘤、抗氧化、降血糖和降血脂等多種功效，現(xiàn)代藥理學(xué)研究糖和降血脂等多種功效，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，表明，石斛多糖是石斛中的主要功能成分石斛多糖是石斛中的主要功能成分。 產(chǎn)地：產(chǎn)地：主產(chǎn)于廣

2、西、貴州、廣東、云南、四川等主產(chǎn)于廣西、貴州、廣東、云南、四川等省區(qū)。省區(qū)。制劑開發(fā)制劑開發(fā) 目前市場上已研制開發(fā)出了鐵皮楓斗、目前市場上已研制開發(fā)出了鐵皮楓斗、鐵皮石斛鐵皮石斛沖劑沖劑（顆粒）、鐵皮石斛（顆粒）、鐵皮石斛飲料飲料、鐵皮石斛微粉、鐵皮石斛鐵皮石斛微粉、鐵皮石斛酒酒、鐵皮石斛、鐵皮石斛茶茶、復(fù)方天人百合鐵皮石斛、復(fù)方天人百合鐵皮石斛 、復(fù)方鮮石、復(fù)方鮮石斛斛膠囊膠囊、復(fù)方鮮、復(fù)方鮮石斛片石斛片、復(fù)方鮮、復(fù)方鮮石斛丸石斛丸、納米石斛明目制劑納米石斛明目制劑藥物藥物、鮮石斛晶、納、鮮石斛晶、納米石斛夜光制劑藥物、鐵皮石斛復(fù)方制米石斛夜光制劑藥物、鐵皮石斛復(fù)方制劑等系列劑等系列保健產(chǎn)品

3、保健產(chǎn)品。 更多的產(chǎn)品有待于進(jìn)一步的研究與開更多的產(chǎn)品有待于進(jìn)一步的研究與開發(fā)。發(fā)。前景分析前景分析 從目前的市場看，從目前的市場看，特級純正鐵皮楓斗特級純正鐵皮楓斗價格在價格在每公每公斤十萬元左右斤十萬元左右。一級楓斗價格在。一級楓斗價格在每公斤二到三萬元每公斤二到三萬元，且有價無貨，其產(chǎn)量只有需求量的且有價無貨，其產(chǎn)量只有需求量的0.004% 0.004% ，可謂一，可謂一克難求。預(yù)計在克難求。預(yù)計在1010年內(nèi)鐵皮石斛的產(chǎn)量仍難以滿足市年內(nèi)鐵皮石斛的產(chǎn)量仍難以滿足市場的需求。場的需求。（供不應(yīng)求）（供不應(yīng)求） 據(jù)全國中資源普察統(tǒng)計，目前，整個據(jù)全國中資源普察統(tǒng)計，目前，整個石斛市場石斛市

4、場年年需求總量在需求總量在800080001000010000噸，且以每年噸，且以每年10%10%15%15%的需的需求遞增。而人工種植剛剛起步，再加上其產(chǎn)品的開發(fā)求遞增。而人工種植剛剛起步，再加上其產(chǎn)品的開發(fā)商家逐年增加，導(dǎo)致幾乎已無法獲取到其成品進(jìn)行加商家逐年增加，導(dǎo)致幾乎已無法獲取到其成品進(jìn)行加工，所以許多企業(yè)處于半停產(chǎn)或待料生產(chǎn)狀態(tài)。工，所以許多企業(yè)處于半停產(chǎn)或待料生產(chǎn)狀態(tài)。國內(nèi)石斛研究熱點(diǎn)分析國內(nèi)石斛研究熱點(diǎn)分析 鐵皮石斛原球莖多糖提取最佳工藝研究 超聲法提取鐵皮石斛多糖工藝的研究 正交試驗(yàn)優(yōu)選鐵皮石斛類原球莖多糖的提取純化工藝 石斛中石斛多糖的提取工藝研究 棒節(jié)石斛中的多糖分布及提

5、取工藝研究 超聲波輔助提取金釵石斛多糖工藝優(yōu)化研究 基于正交試驗(yàn)法的鐵皮石斛原球莖生長和多糖合成研究 閃式提取鐵皮石斛多糖熱點(diǎn)分析熱點(diǎn)分析 （一）（一）石斛多糖提取工藝 稀土微肥對鐵皮石斛試管苗壯苗的影響 鐵皮石斛原球莖液體懸浮培養(yǎng)的研究 霍山石斛原球莖液體培養(yǎng)條件的優(yōu)化 大苞鞘石斛胚組織培養(yǎng)及植株再生研究 金釵石斛類原球莖誘導(dǎo)及增殖的正交試驗(yàn) 3種石斛蘭以莖段為外植體的離體快繁技術(shù) 霍山石斛細(xì)胞懸浮培養(yǎng)及條件優(yōu)化 春石斛離體培養(yǎng)條件優(yōu)化及其試管開花研究 金屬離子對霍山石斛類原球莖增殖及植株 再生的影響 不同激素濃度對鐵皮石斛高效快繁體系的影響 正交試驗(yàn)優(yōu)選環(huán)草石斛 不同氮磷鉀營養(yǎng)水平對鐵皮石

6、斛組培苗生長的影響 大苞鞘石斛組織培養(yǎng)快繁研究 不同因素對大苞鞘石斛原球莖分化的影響 金釵石斛原生質(zhì)體的制備與融合 鐵皮石斛組培苗生根條件優(yōu)化研究 石斛ISSR-PCR體系的優(yōu)化 春石斛和鐵皮石斛試管苗壯苗生根條件的優(yōu)化 石斛明目膠囊藥材水煎醇沉工藝的正交試驗(yàn)熱點(diǎn)分析熱點(diǎn)分析 （二）（二）石斛快繁技術(shù)石斛多糖提取工藝優(yōu)化石斛多糖提取工藝優(yōu)化石斛多糖含量的市場調(diào)查石斛多糖含量的市場調(diào)查 趙立，闞趙立，闞(kn)(kn)永軍，龐文生等按照永軍，龐文生等按照 2015 2015 版中國藥典鐵版中國藥典鐵皮石斛項(xiàng)下皮石斛項(xiàng)下多糖及甘露糖含量多糖及甘露糖含量測定方法，隨機(jī)檢測了目前市售鐵皮測定方法，隨機(jī)

7、檢測了目前市售鐵皮石斛的質(zhì)量，結(jié)果顯示不同產(chǎn)地鐵皮石斛石斛的質(zhì)量，結(jié)果顯示不同產(chǎn)地鐵皮石斛多糖含量多糖含量在在 34% 34% 42% 42% 之之間，甘露糖含量在間，甘露糖含量在 19% 19% 27% 27% 之間。市售鐵皮石斛含量差別較大，之間。市售鐵皮石斛含量差別較大，這可能與其這可能與其品種、產(chǎn)地、采收期及種植年限品種、產(chǎn)地、采收期及種植年限有關(guān)，但其含量均符合有關(guān)，但其含量均符合藥典規(guī)定范圍藥典規(guī)定范圍( ( 總多糖含量不低于總多糖含量不低于 25% 25%，甘露糖含量在，甘露糖含量在 13% 13% 37% 37% 之間之間) ) ，可作為鐵皮石斛藥材入藥。，可作為鐵皮石斛藥材入

8、藥。 趙立等. (2017). 市售鐵皮石斛多糖及甘露糖含量比較研究. 海峽藥學(xué), 29(7), 29-31.李彩霞, & 竹劍平. (2010). 不同采收期鐵皮石斛中多糖含量比較. 藥物分析雜志(6), 1138-1139.多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)考查指標(biāo)及方法 多糖得率=提取得到的多糖質(zhì)量/原料質(zhì)量100% 多糖含量： 多糖含量 = 總糖 - 還原糖。石斛多糖含量的測定方法：苯酚硫酸法 苯酚制取:取苯酚200g，加鋁片O.2g和碳酸氫鈉O.1g，蒸餾，收集182攝氏度餾分，稱取一定量重蒸苯酚，加入蒸餾水混勻，溶解即得。置棕色瓶中，放冰箱內(nèi)備用。不同提取方法對石斛多糖含量測定的影響方法：分別采用回流提

9、取、改進(jìn)回流提取、超聲波提取與超聲輔助熱回流提取法對石斛多糖進(jìn)行提取，通過苯酚- 硫酸法檢測其多糖含量。結(jié)果：4種提取方法所測得的多糖含量分別為（13.4730.634）、（15.6920.743）、（11.870.536）、（16.290.407）。結(jié)論：采用超聲輔助熱回流提取法所得含量最高，而且提取時間短、提取較為徹底，該方法比較技術(shù)先進(jìn)，提取效率較高，優(yōu)于水提法，提取過程中能量消耗大，成本相對較高。羅傲雪, 范益軍, 羅傲霜. (2010). 不同提取方法對石斛多糖含量測定的影響. 中國藥房, 21(7), 601-602.多糖工藝流程 熱水法回流提取多糖工藝流程： 原料稱重回流去雜質(zhì)熱

10、水浸提過濾濾液濃縮80乙醇（45倍）沉淀過濾烘干復(fù)溶Sevage法除蛋白（多糖粗品的純化過程）醇沉烘干鐵皮石斛類原球莖多糖。影響因素： 加水量、水溫、浸提時間、提取次數(shù)優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)缺點(diǎn)：是傳統(tǒng)的多糖的提取方法，成本低，取材方便，提取條件易于控制，經(jīng)濟(jì)適用，操作方法相對簡單但是繁雜，重復(fù)提取次數(shù)較多，提取時間過長，提取效率相對較低。試驗(yàn)材料和儀器試驗(yàn)材料 懸浮培養(yǎng)于1/2MS液體培養(yǎng)基的鐵皮石解原球莖，于60度烘干后，經(jīng)粉碎、干燥恒重處理后備用。試劑 氯仿、苯酚、濃硫酸、正丁醇、乙醇、葡萄糖、冰醋酸、胃蛋白酶、考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清蛋白均為分析純。儀器 UV-1700型分光光度計、索氏提取器

11、、HH-S恒溫水浴渦、ZFQ85A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SHZ-200型雙配套循環(huán)水式多用真空泵、冷凍干燥機(jī)。采用L8(24)正交設(shè)計，試驗(yàn)重復(fù)2次，各處理內(nèi)容見表1。多糖提取條件的確立 何鐵光, 楊麗濤, 李揚(yáng)瑞等. (2006). 鐵皮石斛原球莖多糖提取最佳工藝研究. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報, 15(5), 240-243.次數(shù)較少時間提取次數(shù)溫度加水量整體含量小結(jié)果分析：影響響大小順序是:提取次數(shù)溶劑用量提取溫度提取時間，各因素的最佳水平為A1B2C1D2。2h4h1次3次8010010倍20倍 根據(jù)多糖性能，選用水煎煮工藝，選擇提取時的加水量、提取時間、提取次數(shù)、藥材粉碎度4個試驗(yàn)因素，每個因素3個水平進(jìn)

12、行優(yōu)選,采用L9(34)表對石斛進(jìn)行石斛多糖的提取和測定，并作為考察指標(biāo)。因素水平表見表1。錢葉, & 呂不望. (2005). 石斛中石斛多糖的提取工藝研究. 中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué), 22(4), 293-294.結(jié)果分析：影響石斛多糖含量的因素依次為粉碎度提取次數(shù)加水量提取時間。最佳提取條件為A1B3C3D3,但根據(jù)計算，A因素2，3水平間幾乎在同一數(shù)量級，從省時節(jié)能，降低成本的角度考慮，選擇A2B1C2D3，即石斛中石斛多糖的最佳提取條件為將藥材粉碎至粗粉，加水20倍量,提取3次,每次4h。4h6h8h10倍20倍30倍2次3次4次飲片小段粗粉多糖粗品的純化原理：石斛多糖粗品中含有蛋白質(zhì),為

13、進(jìn)一步純化多糖粗品需經(jīng)脫蛋白處理。常用Sevage法即將多糖粗品的水溶液與氯仿和正丁醇混合,使蛋白質(zhì)變性成為不溶性聚集在氯仿和水的界面上,經(jīng)離心后可將蛋白質(zhì)去除。粗多糖脫蛋白時,樣品/氯仿+正丁醇(v/v)為1B0.35,氯仿/正丁醇(v/v)為1B0.4,反應(yīng)時間以5 min最佳。Sevage法脫蛋白的正交試驗(yàn)：除去蛋白質(zhì)采用Sevage方法，按L4(23)正交設(shè)計,試驗(yàn)重復(fù)2次。另外,采用蛋白酶法Sevage法交替數(shù)次脫蛋白。以樣品溶液與Sevage試劑體積比（A）、氯仿與正丁醇體積比（B）、反應(yīng)時間（C）為考察因素。 粗多糖脫蛋白時,樣品/氯仿+正丁醇(v/v)為1：0.35,氯仿/正丁

14、醇(v/v)為1：0.4,反應(yīng)時間以5 min最佳?？偨Y(jié) 通過正交試驗(yàn)對鐵皮石斛原球莖多的提取和蛋白質(zhì)的去除條件進(jìn)行優(yōu)化選擇,可以使分離多糖產(chǎn)品的生產(chǎn)達(dá)到多糖含量高、生產(chǎn)效率高、資源利用高的多糖產(chǎn)品。經(jīng)醇析得到的多糖產(chǎn)品可直接應(yīng)用于飲料、食品中，用Sevage法進(jìn)一步純化后可用于醫(yī)藥、保健品中。 趙立, 闞永軍, 龐文生, & 胡娟. (2017). 市售鐵皮石斛多糖及甘露糖含量比較研究. 海峽藥學(xué), 29(7), 29-31. 劉靜平, 朱先紅, & 賈景明. (2011). 正交試驗(yàn)優(yōu)選鐵皮石斛類原球莖多糖的提取純化工藝. 中國藥房, 22(15), 1378-1380. 尚喜雨. (2010). 水提法酶法提取鐵皮石斛多糖的比較研究. 安徽農(nóng)業(yè)科