流式細胞儀上機培訓手冊簿

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上流式細胞儀上機操作培訓手冊一、樣本處理以PBMC表面抗原的流式檢測步驟為例1) 取樣。取新鮮提取或凍存后復蘇的PBMC；2) 編號。根據(jù)實驗設計，標記好流式管，如每份PBMC設兩管：a) 1號管：相應同型對照；b) 2號管：CD3,CD4,CD8,CD56四標管；3) 加樣。用移液器取100ul細胞/管（約1×106個細胞/管），分別加到已經(jīng)標記好的流式管底部；4) 洗滌。加入1ml PBS/管，渦旋1600rpm/min，離心6min；5) 染色。棄上清，加入100 l PBS/管渦旋混勻細胞，并根據(jù)實驗設計，向各流式管中加入相應的熒光素標記抗體，混勻，室

2、溫避光孵育30min（操作盡量保持在避光條件下進行。）6) 洗滌。加入1ml PBS/管，渦旋1600rpm/min，離心6min；7) 重懸。棄上清，加入0.5ml PBS/管，混勻，上機檢測(可選擇BD FACSCanto II或BD Accuri C6)。（注：若不能及時上機，應加入4%多聚甲醛固定，并于4避光保存。）8） 試驗結(jié)果分析。 （注：實驗過程中如果進行多色標記，需要調(diào)節(jié)熒光補償）。參考值：CD3+60.8-75.4%CD4+29.4-45.8%CD8+18.2-32.8%NK（CD3-CD56+）9.5-23.5%二、上機檢測BD FACSCanto II簡要操作流程啟動流式

3、細胞儀1 打開流式細胞儀電源2 啟動計算機，打開軟件登錄3 確保軟件連接到流式細胞儀必要時，點擊Cytometer > connect檢查液體水平1 啟動流式細胞儀后，檢查液體水平 低液面水平或者廢液桶滿都用紅色指示。2 如果液流車未自動開啟，選擇Cytometer > Fluidics Startup。3 當液流啟動完成后，點擊OK關閉對話框。檢查氣泡1 在檢查完液體水平后，開啟流動室門，檢查流動室中是否有氣泡。2 如果沒有看到氣泡，進行第5步。如果看到氣泡，點擊Cytometer > Cleaning Modes > De-gas Flow Cell.3 當完成信息

4、出現(xiàn)后，點擊OK。4 如果還可以看到氣泡，重復上述操作。注意：如果打開流動室細胞進口門時出現(xiàn)錯誤信息，通過關閉進口門，并等待30秒關閉該信息。5 當您完成上述操作后，在往下進行之前請先檢查激光預熱是否已經(jīng)完成。創(chuàng)建實驗1 按照需要，在工作區(qū)工具欄中點擊相應的按鈕來顯示瀏覽器、細胞儀、檢測器、工作表、獲取控制板和雙指數(shù)編輯器窗口。2 創(chuàng)建文件夾： A 在瀏覽器中選擇數(shù)據(jù)庫圖標，并點擊瀏覽器工具欄上的New Folder。 B 對該文件夾命名。3 選擇該文件夾，點擊New Experriment來創(chuàng)建一個新實驗。4 對該實驗進行重命名。5 選擇實驗級別的細胞儀設置，然后點擊Inspector(檢測

5、器)中的Parameters(參數(shù))選項卡。6 按照需要變更，添加或者刪除參數(shù)。運行樣本并記錄數(shù)據(jù)1 將樣品管安裝到流式細胞儀中并點擊Aquire Data(獲取數(shù)據(jù))。 A 把抽吸臂向左側(cè)推。B 把流式管放置到SIT上，確保試管豎直，并用力向上推試管直到試管完個停止并完個就位。C 把抽吸臂放置到試管下的中心位置。抽吸臂上有3個傳感器引腳。試管底部應定位在這些引腳的中心位置內(nèi)。2 調(diào)節(jié)FSC和SSC電壓以正確顯示細胞的散射光特征。3 必要時，點擊閾值圖標并對FSC閾值進行調(diào)節(jié)。4 調(diào)節(jié)P1門僅圍繞目的細胞群體。5 調(diào)節(jié)好后，點擊Record Data(記錄數(shù)據(jù))以記錄數(shù)據(jù)。6 獲取停止，取出試

6、管。建立全局工作表1 如果用戶參數(shù)中啟用了Default global worksheet(默認個局工作表)(默認選項)，則全局工作表已經(jīng)存在。展開全局工作表文件夾來定位和重命名工作表。（注：如果Default global worksheet被禁用，則通過點擊瀏覽器工具欄中的New Global Worksheet(新個局工作表)按鈕創(chuàng)建個局工作表。）2 使用設計對話框定義參數(shù)標記并指定各個試管要記錄的細胞顆粒數(shù)。標記會出現(xiàn)在點圖軸上和所有的統(tǒng)計結(jié)果圖中。 A 選擇Experiment(實驗)>Experiment Layout(實驗布局)。 B 在Labels(標簽)選項卡中，為試管

7、輸入適當?shù)臉撕灐＠?，在FITC域中輸入CD3。使用Tab鍵移動到下一個域。3 在該全局工作表中，創(chuàng)建用預覽數(shù)據(jù)的點圖。例如:創(chuàng)建PerCP-Cy5.5對SSC,FITC對APC, FITC對PE, FITC對PE-Cy7和F ITC對APC-Cy7點圖。設門通過設門的方法可以定義細胞亞群的區(qū)域。如：PBMC樣本是混合細胞群，如果想單獨分析淋巴球細胞，可根據(jù)FSC或細胞大小，在 FSC，SSC的散點圖中設門，其數(shù)據(jù)結(jié)果只反映淋巴細胞亞群的熒光特性。關機1選擇Cytometer(細胞儀)>Fluidics Shutdown(液流關閉)，并遵循所有的提示。2關閉細胞儀電源。3退出BD FAC

8、SDiva軟件。C6簡要操作流程開機1. 打開電腦，上樣處放置一管雙蒸水2. 打開C6儀器，其自動執(zhí)行“startup”，時間約5min，期間禁止開蓋3. 當軟件顯示儀器狀態(tài)為“Cytometer Connected and ready”并亮綠燈時，則可以上樣4. （推薦用質(zhì)控微球上機，F(xiàn)L1-H和FL2-H直方圖中必須有八個峰，F(xiàn)L3-H中必須有6-8個峰，即儀器分辨率CV值滿足標準）采集樣品1. 樣品震蕩混勻后置于上樣二檔處2. 設置流速，采樣數(shù)目或時間或體積3. 點擊“Dot Plot”或“Histogram”或“Density Plot”，選擇需要的圖形4. 點擊坐標軸參數(shù)，從下拉菜單

9、中選擇需要的參數(shù)（如：“FL1-A”“FSC-A”）5. 點擊“Plot Spec”，選擇“l(fā)inear”或者“l(fā)og”，設置坐標軸顯示范圍6. 右擊坐標軸參數(shù)，選擇“Rename Parameters”，進行坐標軸重命名7. 選擇“Display”中的“Events Display Settings”，選擇顯示的細胞數(shù)8. 選擇樣品位置，點擊“run”，進行采樣9. 取下樣品10. 取新的流式細胞管置于上樣針處，點擊“backflush”，清洗上樣針11. 樣品命名12. 點擊“Zoom In”，放大指定區(qū)域，設置閾值。點擊“Zoom Out”，返回放大設門1. 在圖像下方點擊設門工具，圈定指定區(qū)域，設置為門2. 點擊相應圖像上方的“Gate”，選擇該圖像需要應用的門設置補償若樣本是雙熒光或三熒光檢測，則實際圖像顯示中會用到熒光補償1. 點擊“Set Color Compensation”2. 選擇需要補償?shù)臒晒鈪?shù)，輸入補償值，點擊“Save & Close”分析統(tǒng)計點擊“Statistic”可選擇預覽選擇的樣品圖形，所有的Plot列表。所有的Plots，Gates以及統(tǒng)計學的列表，從中選擇需要顯示的信息關機清洗1. 放置一管去離子水，運行2min，清洗時10 Event