農(nóng)桿菌介導(dǎo)法

1、第一頁，共57頁。農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌感染柳樹感染柳樹產(chǎn)生產(chǎn)生冠癭瘤冠癭瘤第二頁，共57頁。原理：原理： 根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌細(xì)胞中分別含有根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌細(xì)胞中分別含有TiTi質(zhì)粒和質(zhì)粒和RiRi質(zhì)粒質(zhì)粒，其上有一段，其上有一段T-DNAT-DNA，農(nóng)桿菌通過侵染植物傷口進(jìn)入細(xì)胞，農(nóng)桿菌通過侵染植物傷口進(jìn)入細(xì)胞后，可將后，可將T-DNAT-DNA插入到植物基因組中。插入到植物基因組中。第三頁，共57頁。 因此，農(nóng)桿菌是一種因此，農(nóng)桿菌是一種天然天然的植物遺傳轉(zhuǎn)化體系。人們將的植物遺傳轉(zhuǎn)化體系。人們將目目的基因的基因插入到經(jīng)過改造的插入到經(jīng)過改造的T-DNAT-DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染實(shí)現(xiàn)區(qū)

2、，借助農(nóng)桿菌的感染實(shí)現(xiàn)外外源基因源基因向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與整合，然后通過細(xì)胞和組織培養(yǎng)向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與整合，然后通過細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，再生出轉(zhuǎn)基因植株。技術(shù)，再生出轉(zhuǎn)基因植株。 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法起初只被用于雙子葉植物中，近年來，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法起初只被用于雙子葉植物中，近年來，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化在一些單子葉植物（尤其是水稻）中也得農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化在一些單子葉植物（尤其是水稻）中也得到了廣泛應(yīng)用。到了廣泛應(yīng)用。第四頁，共57頁。第五頁，共57頁。第六頁，共57頁。Story冠癭瘤病冠癭瘤?。弘p子葉植物經(jīng)常發(fā)生，因腫瘤著生地面在近地面的根莖交界處，形似帽狀而得名。1907年， Smith & Town

3、sent 農(nóng)桿菌誘發(fā)冠癭瘤病。1947年， Braun et al. 證實(shí)倆者的關(guān)系，但發(fā)現(xiàn)有的菌株不 致病。提出了假說：tumour-inducing principle,TIP.腫瘤 誘導(dǎo)因子 。60s , 腫瘤組織中含高濃度的氨基酸（octopine , nopaline） 總稱冠癭堿（opine) 。 Petit et al.證實(shí)腫瘤組織 合成的冠癭堿取決于菌株，而且菌株能專一地利用 冠癭堿作為菌株生存的唯一的碳源和氮源。(證實(shí)了TIP)第七頁，共57頁。1974年，Zaenen et al, Schell, Van Larebeke et al. 從致瘤農(nóng)桿菌中分離出一類巨大的質(zhì)粒

4、(tumor inducing plasmid)，稱為Ti質(zhì)粒。 Ti=TIP1977年，Chilton et al.分子雜交技術(shù)證實(shí)腫瘤細(xì)胞中存 在外源的DNA ,與Ti質(zhì)粒的DNA有同源性，是整 合到了植物染色體的農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA片段， T- DNA (transferred DNA),其內(nèi)有致瘤和冠癭 堿合成酶等基因。1981年，Ooms et al.發(fā)現(xiàn)Ti質(zhì)粒上有致瘤區(qū)(virulence region)，Vir區(qū)。第八頁，共57頁。Ti質(zhì)粒第九頁，共57頁。Ti質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞核外存在的一種環(huán)狀雙鏈DNA分子，長度約200kb，平均周長54.175 .4 um，分子質(zhì)量為（90

5、150）106 Da。在溫度低亍28的 條件下，Ti質(zhì)?？煞€(wěn)定地存在于根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)。第十頁，共57頁。Ti質(zhì)粒除上述上述誘導(dǎo)受侵染的植物組織產(chǎn)生冠癭瘤 外，還具有以下幾種重要功能：1賦予根癌農(nóng)桿菌附著于植物細(xì)胞的能力；2賦予根癌農(nóng)桿菌分解代謝冠癭堿的能力；3根癌農(nóng)桿菌的寄主植物范圍；4決定所誘導(dǎo)的冠癭形態(tài)和冠癭堿的成分；5參與寄主細(xì)胞合成植物激素吲哚乙酸和一些細(xì)胞分裂素 的代謝活.第十一頁，共57頁。1) Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)來自于不同野生型根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)?？筛鶕?jù)其產(chǎn)生的冠癭堿類型分為三類：章魚堿(octopine)類 胭脂堿(nopaline)類 農(nóng)桿堿（agropine） 類。Ti質(zhì)粒攜

6、帶著既能分解又能合成這些化合物的酶類和相應(yīng)基因，然而冠癭堿合成基因卻不能在根癌農(nóng)桿菌中表達(dá)，它們只有進(jìn)入植物細(xì)胞后才能表達(dá)，Ti質(zhì)粒上的冠癭堿分解基因產(chǎn)物卻能分解冠癭堿，為宿主細(xì)胞提供能源、氮源和碳源。第十二頁，共57頁。第十三頁，共57頁。長度：160-250 kb6大功能區(qū)：1)致癌區(qū)，這個(gè)區(qū)主要合成植物 生長素和細(xì)胞分裂素；2)冠癭堿合成區(qū)；3)冠癭堿分解區(qū)；4)Ti質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移區(qū)(tra)；5)毒性區(qū)（Vir）；6)DNA復(fù)制區(qū)（Rep）。第十四頁，共57頁。T-DNA第十五頁，共57頁。在致癌區(qū)和冠癭堿合成區(qū)的兩側(cè)存在著一個(gè)24 bp直接重復(fù)序列，由這三部分所構(gòu)成的DNA區(qū)域叫做T-

7、DNA，插入植物染色體中的Ti質(zhì)粒片段只有T-DNA。由于T-DNA插入植物細(xì)胞染色體中的位置不相同的，因此植物染色體上可能并沒有可供T-DNA插入的專一性DNA序列。第十六頁，共57頁。脂堿型根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒中T-DNA的左右兩側(cè)是一段24bp的重復(fù)序列,構(gòu)成T-DNA的邊界序列(border sequence),分別稱為左邊界(left border,LB)和右邊界(right border,RB).在某些章魚堿型根癌農(nóng)根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒中T-DNA是以兩個(gè)分開的獨(dú)立片段形式存在，即T-DNA左邊區(qū)段和T-DNA右邊區(qū)段。研究表明，插入在T-DNA邊界序列之間的任何DNA都可被轉(zhuǎn)到植物染

8、色體中。因此Ti質(zhì)?？捎米鐾庠茨康幕虻妮d體。第十七頁，共57頁。T-DNA 區(qū)域中的這些基因只有在T-DNA插入到植物基因組后才能激活表達(dá).Tms1、Tms2、Tmr這3 個(gè)基因表達(dá)產(chǎn)物催化生成的植物生長素（ Tms1、Tms2 ）和細(xì)胞分裂素（ Tmr ）,可調(diào)節(jié)植物細(xì)胞的生長和發(fā)育,它們的過量表達(dá)刺激植物細(xì)胞大量快速增長而形成冠癭.冠癭也是在冠癭堿胞內(nèi)合并成分泌出來的,構(gòu)成根癌農(nóng)桿菌生長所須的碳源和氮源.第十八頁，共57頁。Vir區(qū)區(qū)第十九頁，共57頁。Vir區(qū)（Vir-region），即毒性區(qū)，又稱致瘤區(qū)域，其長度約為35kb。它們控制根癌農(nóng)桿菌附著于植物細(xì)胞和Ti質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞有關(guān)部位

9、，與感染后冠癭形成有關(guān)。Vir區(qū)位于T-DNA區(qū)左側(cè)，包含義個(gè)毒性遺傳點(diǎn)（virA、vir、virC、 vir、vir和virG）。vir基因的控制著的轉(zhuǎn)移。virvirvirC virG virvirA第二十頁，共57頁。植物細(xì)胞受傷后，細(xì)胞壁破裂，分泌物中含有高濃度的創(chuàng)傷誘導(dǎo)分子。它們是一些酚類化合物，如乙酰丁酮（acetosyringone，AS）和-羥基酰丁香酮（-hydroxacetosyringone，OH-AS）。根癌農(nóng)桿菌對這一類物質(zhì)具有趨化性，在植物細(xì)胞表面附著后，受這些創(chuàng)傷誘導(dǎo)分子的刺激，Ti質(zhì)粒vir區(qū)毒性基因被激活和表達(dá)。第二十一頁，共57頁。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)9種信號因子，

10、均為水溶性酚類化合物。其中乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）和羥基乙酰丁香酮（OH-AS）的作用較強(qiáng)，兒茶酚、原兒茶酚、沒食子酸、焦性沒食子酸、二羥基苯甲酸、香草酚和對羥基苯酚處理農(nóng)桿菌時(shí)也對Vir區(qū)的基因表達(dá)起促進(jìn)作用。雙子葉植物在在農(nóng)桿菌侵染時(shí)可以形成大量的信號因子，而使T- DNA可以成功的轉(zhuǎn)入；而單子葉植物需要加入外源酚類物質(zhì)，才能激活Vir區(qū)的基因，達(dá)到轉(zhuǎn)基因的目的。第二十二頁，共57頁。最先激活表達(dá)的是virA基因，它編碼感受蛋白，位于細(xì)菌細(xì)胞膜的疏水區(qū)，可接受環(huán)境中的信號分子。在virA蛋白的激活下，virG基因表達(dá)，virG蛋白經(jīng)磷酸化由非活性態(tài)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)，進(jìn)而

11、激活vir區(qū)其他基因表達(dá)。virA基因virG基因第二十三頁，共57頁。其中virD基因產(chǎn)物virD1蛋白是一種DNA松弛酶，它可使DNA從超螺旋型轉(zhuǎn)變?yōu)樗沙谛蜖顟B(tài)；而virD2蛋白則能切割已呈松弛態(tài)的T-DNA，2個(gè)邊界產(chǎn)生缺口，使單鏈T-DNA得以釋放。VirE基因所表達(dá)的virE2蛋白是單鏈T-DNA結(jié)合蛋白?？墒筎-DNA形成1個(gè)細(xì)長的核酸蛋白復(fù)合物（T-復(fù)合體），以此保護(hù)T-DNA不被包內(nèi)外的核酸酶降解。第二十四頁，共57頁。第二十五頁，共57頁。植物細(xì)胞受傷后，細(xì)胞壁破裂，分泌物中含有高濃度的創(chuàng)傷誘導(dǎo)分子。它們是一些酚類化合物，如乙酰丁酮（acetosyringone，AS）和-羥

12、基酰丁香酮（-hydroxacetosyringone，OH-AS）。根癌農(nóng)桿菌對這一類物質(zhì)具有趨化性，在植物細(xì)胞表面附著后，受這些創(chuàng)傷誘導(dǎo)分子的刺激，Ti質(zhì)粒vir區(qū)毒性基因被激活和表達(dá)。第二十六頁，共57頁。最先激活表達(dá)的是virA基因，它編碼感受蛋白，位于細(xì)菌細(xì)胞膜的疏水區(qū)，可接受環(huán)境中的信號分子。在virA蛋白的激活下，virG基因表達(dá)，virG蛋白經(jīng)磷酸化由非活性態(tài)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)，進(jìn)而激活vir區(qū)其他基因表達(dá)。其中virD基因產(chǎn)物virD1蛋白是一種DNA松弛酶，它可使DNA從超螺旋型轉(zhuǎn)變?yōu)樗沙谛蜖顟B(tài)；而virD2蛋白則能切割已呈松弛態(tài)的T-DNA，2個(gè)邊界產(chǎn)生缺口，使單鏈T-DNA得

13、以釋放。VirE基因所表達(dá)的virE2蛋白是單鏈T-DNA結(jié)合蛋白?？墒筎-DNA形成1個(gè)細(xì)長的核酸蛋白復(fù)合物（T-復(fù)合體），以此保護(hù)T-DNA不被包內(nèi)外的核酸酶降解。T-復(fù)合體依次穿過根癌農(nóng)桿菌和植物細(xì)胞膜及細(xì)胞壁。并進(jìn)入植物細(xì)胞核，最終整合進(jìn)入植物核基因組。T-DNA的轉(zhuǎn)移機(jī)理比較復(fù)雜，依賴于T-DNA區(qū)和vir區(qū)共同參與，涉及多個(gè)基因表達(dá)及一系列蛋白質(zhì)和核酸的相互作用。第二十七頁，共57頁。Table1 Summary of vir Gene Products Locus Size(kb) ORFsa Proteins Size(kDa) Locationb FunctionvirA2.

14、0190Mplant signal sensor, protein kinaseVirG1.0130Ctranscriptional activatorVirD4.5416,47,21,75C/M?T-DNA border endonuclease (VirD1 and VirD2); pilot protein?nuclear localization?(VirD2)VirC2.0226,23C?processing of T-DNA(VirC1)VirE2.027, 60.5C/M?single-strand DNA-binding protein (VirE2) virB9.51126,

15、12,11,87,23,32,5.5,25,32,48,38MT-DNA transfer apparatus?第二十八頁，共57頁。T-DNA加工和轉(zhuǎn)移加工和轉(zhuǎn)移 Vir基因表達(dá)調(diào)控的問題，知道基因表達(dá)調(diào)控的問題，知道VirA和和VirG基因誘導(dǎo)其它基因誘導(dǎo)其它Vir基因的基因的表達(dá)，當(dāng)表達(dá)，當(dāng)VirD操縱元的被誘導(dǎo)表達(dá)后，其中的操縱元的被誘導(dǎo)表達(dá)后，其中的VirD1和和VirD2蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)具有核酸內(nèi)切酶的活性具有核酸內(nèi)切酶的活性(Yanofsky MF. 1986)，能夠在，能夠在T-DN A邊界邊界重復(fù)序列的特異位點(diǎn)切開重復(fù)序列的特異位點(diǎn)切開T-DNA單鏈，因此單鏈，因此T-DNA往往

16、以單鏈形式往往以單鏈形式進(jìn)入植物細(xì)胞。但是在植物細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)雙鏈進(jìn)入植物細(xì)胞。但是在植物細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)雙鏈T-DNA分子。分子。第二十九頁，共57頁。切刻位點(diǎn)切刻位點(diǎn)(nick site)可作為可作為DNA從從5向向3合成的起始位點(diǎn)，新合成的起始位點(diǎn)，新的的DNA鏈合成后，鏈合成后，T-DNA單鏈即被替換單鏈即被替換(displacement)釋放釋放出來出來(圖圖2)。當(dāng)然這種缺刻也可通過重組系統(tǒng)把。當(dāng)然這種缺刻也可通過重組系統(tǒng)把T-DNA雙鏈從雙鏈從Ti質(zhì)粒上解離下來。質(zhì)粒上解離下來。第三十頁，共57頁。缺失研究也表明：右邊界重復(fù)序列缺失后，T-DNA不能轉(zhuǎn)移，而左邊界重復(fù)序列的缺失會稍稍降

17、低T-DNA轉(zhuǎn)移頻率(Timmerman B1988)，這進(jìn)一步說明T-DNA單鏈?zhǔn)窃趶挠疫吔绲阶筮吔?向3替換合成中釋放出來的。第三十一頁，共57頁。右邊界的缺失，使得DNA合成不能起始，因而T-DNA不能釋放，所以T-DNA不能轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞。而左邊界的缺失，僅會影響DNA合成過程的終止，可能會降低導(dǎo)致T-DNA單鏈釋放，而不會明顯影響T-DNA單鏈的形成。第三十二頁，共57頁?？梢奣-DNA左邊界序列作為合成DNA的起始位點(diǎn)的效率比右邊界序列低。這種不同不是由于左右邊界的24bp重復(fù)序列核苷酸不同，而是由于靠近右邊界位置有一個(gè)轉(zhuǎn)移增強(qiáng)子(transfer enhancer；overdri

18、verPeralta EG1986)存在。這個(gè)T-DNA轉(zhuǎn)移增強(qiáng)序列能極其明顯的增加農(nóng)桿菌中T-DNA鏈形成，并且這種作用與它的位置、方向及距離均無關(guān)系。增強(qiáng)子的缺失能夠使農(nóng)桿菌對宿主植物的毒性降低。Toro等人發(fā)現(xiàn)VirC1蛋白能特異性的結(jié)合這個(gè)增強(qiáng)子，VirC操縱元的突變也能導(dǎo)致農(nóng)桿菌的毒性減弱。第三十三頁，共57頁。當(dāng)T-DNA單鏈進(jìn)入植物細(xì)胞后，植物細(xì)胞如何處理這些單鏈DNA？Paul等 人利用電轉(zhuǎn)移法把單鏈DNA轉(zhuǎn)化到煙草原生質(zhì)體中，結(jié)果表明，在植物細(xì)胞中， 單鏈DNA迅速轉(zhuǎn)變成雙鏈DNA分子。此外單鏈DNA比雙鏈DNA的轉(zhuǎn)化效率更 高。然而T-DNA分子并非以裸露的單鏈DNA形式進(jìn)

19、入植物細(xì)胞的。T-DNA單鏈 的5端共價(jià)的結(jié)合著VirD2蛋白質(zhì)，從而保護(hù)T-DNA分子免受外切核酸酶的降 解，此外VirD2蛋白質(zhì)上含有核定位的序列，所以結(jié)合在T-DNA 5端的VirD2 蛋白質(zhì)象一個(gè)“導(dǎo)向儀”(pilot)指引并保護(hù)T-DNA進(jìn)入植物細(xì)胞核中。VirE2蛋白 質(zhì)是一種單鏈結(jié)合蛋白質(zhì)，能夠包裹T-DNA單鏈，和其它T-DNA結(jié)合蛋白質(zhì)共 同構(gòu)成了T-復(fù)合體。第三十四頁，共57頁。冠癭堿分解區(qū)第三十五頁，共57頁。冠癭也是在冠癭堿胞內(nèi)合并成分泌出來的,被冠癭堿分解基因分解成根癌農(nóng)桿菌生長所須的碳源和氮源。第三十六頁，共57頁。載體第三十七頁，共57頁。植物是人類和所有動(dòng)物賴以

20、生存的基礎(chǔ)，因此開展植物基因工程的研究，建立起轉(zhuǎn)基因植物新材料是十分重要的。象其它生物一樣，植物的克隆載體對于開展植物基因工程是必須，然而十分遺憾的是，至今仍未建立起植物的自主復(fù)制型載體。第三十八頁，共57頁。Ti質(zhì)粒載體 利用Ti質(zhì)粒構(gòu)建的植物載體種類很多，常用的是雙元載體(binary vector)， 這是一類能在大腸桿菌和根癌農(nóng)桿菌中進(jìn)行復(fù)制的廣譜宿主載體。這類載體所使用的復(fù)制起點(diǎn)來自細(xì)胞質(zhì)粒RK2，攜帶著兩個(gè)T-DNA 邊界順序和各種標(biāo)記基因。當(dāng)外源基因插入后，重組質(zhì)?？稍谳o助質(zhì)粒的幫助下從大腸桿菌轉(zhuǎn)移到根癌農(nóng)桿菌。這種農(nóng)桿菌內(nèi)存在著一種T-DNA已全部丟失的Ti 質(zhì)粒(pAL440

21、4)，它可以幫助重組雙元質(zhì)粒上的T-DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中。由于大腸桿菌和根癌農(nóng)桿菌之間的DNA轉(zhuǎn)移頻率可達(dá)100%，因而整個(gè)基因組文庫或cDNA文庫可以全部轉(zhuǎn)移到農(nóng)桿菌中。 第三十九頁，共57頁。 在這個(gè)載體中，有來自Ti質(zhì)粒的T-DNA兩個(gè)末端的片段TL和TR，其中有適合于植物細(xì)胞的標(biāo)記基因新霉素抗性基因Neor和供外源基因插入的多克隆位點(diǎn)區(qū)（MCS）。用于植物轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇標(biāo)記基因主要是來自細(xì)菌的某些抗藥性基因，因?yàn)橹参锛?xì)胞對某些抗生素十分敏悉，比如卡那霉素、潮霉素、新霉素等。由于這些基因不能直接在植物細(xì)胞中表達(dá)，因此就把這些基因的編碼區(qū)DNA 插入某些植物基因的啟動(dòng)子后面，編碼區(qū)后面則

22、是來自植物基因的3-端DNA順序，其中包括終止子序列。第四十頁，共57頁。第四十一頁，共57頁。早在上世紀(jì)初Smith 等人就發(fā)現(xiàn)作為自然存在的遺傳工程，土壤中生存的根癌農(nóng)桿菌可以將外源基因轉(zhuǎn)入植物而導(dǎo)致根腫瘤的生成。農(nóng)桿菌的致病基因在酸性條件和酚類誘導(dǎo)物（如乙酰丁香酮）的存在下，微生物DNA分子的一部分可以轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞并插入到植物基因組中。這類酚類誘導(dǎo)物是大多數(shù)雙子葉植物在受到傷害時(shí)產(chǎn)生的。在植物轉(zhuǎn)基因早期階段，由于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)即簡單又不需要很多儀器設(shè)備，就成為很多科學(xué)工作者首先研究的熱點(diǎn)。1977年Chilton等人證明根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒的一部分轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，整合進(jìn)植物基因組使植物產(chǎn)生

23、腫瘤。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入植物的DNA片段稱為轉(zhuǎn)移DNA（T- DNA）。Ti質(zhì)粒可以將外源基因轉(zhuǎn)入植物的能力引起人們的廣泛興趣，早期的植物轉(zhuǎn)基因工作既是用它作為植物轉(zhuǎn)基因的載體，進(jìn)行大量轉(zhuǎn)基因研究。第四十二頁，共57頁。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法目前以根癌農(nóng)桿菌使用的較多，尤其在早期的雙子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化研究中上發(fā)揮了重要作用。近年來人們對農(nóng)桿菌介導(dǎo)法機(jī)理作了深入研究，發(fā)現(xiàn)了酚類化合物在外源基因?qū)胫参锛?xì)胞的作用。尤其是日本煙草公司的Hiei等人在水稻遺傳轉(zhuǎn)化上應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得了明顯的進(jìn)展，使這一轉(zhuǎn)化方法在單子葉植物中也有了成功的應(yīng)用。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法與其它方法比較，具有轉(zhuǎn)入的基因經(jīng)常是單拷貝，因而表達(dá)水平高并可以

24、轉(zhuǎn)入大的DNA片段（可達(dá)150 kb）、不需貴重儀器等優(yōu)點(diǎn)。第四十三頁，共57頁。在雙子葉植物的轉(zhuǎn)化研究中，可以用植物的葉片、幼莖、懸浮培養(yǎng)物、及發(fā)芽的種子等作為外植體進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。在進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中常常要對不同的農(nóng)桿菌菌株、農(nóng)桿菌和植物外植體共培養(yǎng)的時(shí)間和溫度及選擇壓力進(jìn)行優(yōu)化，以獲得更高的轉(zhuǎn)化效率。根據(jù)Escudero等人研究結(jié)果，在自然條件下農(nóng)桿菌可以滲入植物細(xì)胞，因而在作農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化時(shí)，沒有必要對植物組織制造傷口。超聲波予處理植物組織，可以提高轉(zhuǎn)化效率。在用農(nóng)桿菌進(jìn)行葡萄轉(zhuǎn)化試驗(yàn)時(shí)，用抗氧化劑如聚乙烯吡咯烷酮（PVP）或二硫蘇糖醇處理可以提高轉(zhuǎn)化效率。第四十四頁，共57頁。Ag

25、robacterium-mediated transformation Advantages:1. Cleaner inserts2. Higher co-expression3. More flexible in tissue types(in planta transformation) almost any type of tissues or cells 4. Mostly widely used system ,both monocot and dicot5. Easy in manipulation ,Disadvantages 1. Only good for nuclear t

26、ransformation2. Limited in host range,genotype-dependent3. Detrimental to some tissues第四十五頁，共57頁。Introduction to AgrobacteriumMoloecular mechanisms of T-DNA transfer into the plant genome Factors influencing the T-DNA delivery Regeneration and selection of transgenic plants第四十六頁，共57頁。TypesA.tumefaci

27、ens : the causative agent of plant disease crowng gall.rhizogenes : provokes hair roots. Both crown gall and root hair are neoplastic diseases (plant tumors), both gram-negative soil bacterium. Based on the opines produced in the tumors,Ti plasmids are divided in four groups,while the Ri plasmids fa

28、ll in three groups.Ti plasmidsu Octopine: pTiAch5,pTiAg57,or pTi19955 Nopaline: pTiC58,pTi1D135,pTi223 Leucinnopine: pTi542,pTiAT4D,L-succinamopine: pTiEU6,pTiAT181 Ri plasmidsu Mannopine: pRi8196,pRiTR7 Agropine: pRi1855,pRi15834,pRiA4 Cucumopine: pRi1659 第四十七頁，共57頁。Strains: Agrobacterium Strains a

29、nd the origins of Agrobacterium strains(see attached table 1 and 2)refernce plasmid1:238-253(1978)Examples:C58 (C58 chromosome,pTi C58)ABI (C58 chromosome,pTiMp90RK,disarmed TiC58)GV3850 (C58 chromosome,pTiGV3850,disarmed TiC58)A281 (C58 chromosome,pTiBo542)EHA101 (C58 chromosome,pTiEHA101,disarmed

30、pTiBo542 EHA105 (C58 chromosome,pTiEHA105,disardisarmed pTiBo542)T37 (T37 chromosome,pTi37)A208 (C58 chromosome,Pti37)Ach5 (Ach5 chromosome,pTiAch5)LBA4404 (Ach5 chromosome,TiAL4404,disarmed pTiAch5)第四十八頁，共57頁。 Strains: Agrobacterium Strains and the origins of Agrobacterium strains(see attached tabl

31、e 1 and 2)refernce plasmid1:238-253(1978)Examples:C58 (C58 chromosome,pTi C58)ABI (C58 chromosome,pTiMp90RK,disarmed TiC58)GV3850 (C58 chromosome,pTiGV3850,disarmed TiC58)A281 (C58 chromosome,pTiBo542)EHA101 (C58 chromosome,pTiEHA101,disarmed pTiBo542 EHA105 (C58 chromosome,pTiEHA105,disardisarmed p

32、TiBo542)T37 (T37 chromosome,pTi37)A208 (C58 chromosome,Pti37)Ach5 (Ach5 chromosome,pTiAch5)LBA4404 (Ach5 chromosome,TiAL4404,disarmed pTiAch5)第四十九頁，共57頁。Molecular mechanisms of T-DNA transfer into plant genome Steps in T-DNA delivery1) host perception2) pre-infection attachment 3) induction and init

33、iation of virulence genes 4) synthesis and assembly of the promiscuous pilus 5) processing and delivery of the T-DNA 6) T-DNA integration第五十頁，共57頁。1)host perception: chemical signals produced naturally by plant roots serve chemoattractants such as sucrose,glucose and fructose as well as amino acids

34、like valine and arginine are good chemoattractants.plant isofolavomoids such as formoneton and coumestrol initiating the transcription of chromosomal genes of Agrobacterium involved in facilitating root colonization.most of the Vir genes except for genes of the virb and vire operons are required for

35、 Agrobacterium motility.第五十一頁，共57頁。2).pre-infection attachment a) Agrobacterium must attach to its host cells before the T-DNA is processed and readied for transfer,following chemotaxis to the host plant .b) attachment is independent of Ti or Ri plasmid.c) A.tumefaciens adherence to plant cells is s

36、aturable .d) The attachment sites are thought to be specific receptors (2,000 such receptors on carrot suspension culture cells)where only live bacterium binds.e) Each plant cell has enough attachment sites for several bacterlum,but plant cells are transformed by only one or a few bacterium .No loss

37、 of competence of plant cell causes by the firsrt agrobacterum infection.f) Chromosomal genes involved in attachment chva,chcb,exoc:synthesis of a cyclic -1,2-glucan, implicated in plant cell binding. cel:cellulose synthesizing genes.agrobacterium cells forms large aggregates microscopically, seen a

38、s clumps tetheted by cellulose fibrils. pscA:exopolisaccharide systhesis and secretion leading to the systhesis of cellulose fibrils. att: root colonization第五十二頁，共57頁。3) induction and initiation of virulence genes a)virA: autophosphorilating protein respond to the environmental signals by transferri

39、ng a phosphate group to VirG protein.The induction of vir genes expression is sensitive to temperature(28).Three types of signals are recognized by virA : u phenols:acetosyringone(stronger inducer) u sugars(arabinose,glucose,xylose,mannose,galactose) and sugar derivatives (galacturonic acid) u low p

40、H (optimum,approximately5.3)b) VirG : transcriptional activator. Rate-limiting protein for vir gene induction, and its transcription increases in response to the presence of : u inducing phenolics u acidic environment u phosphate starvationc)chvE: sugar-binding protein 第五十三頁，共57頁。4)synthesis and ass

41、embly of the promiscuous pilus upon induction of the vir genes ,a systematic set of molecular events leading to the synthesis and assembly of the conjugative pilus take place (see table or figure shown location and function of VirB proteins) low temperature at 19is optimal第五十四頁，共57頁。5) processing and delivery of the T-DNA uT-DNA u left and right borders uimperfect di