生化物質的分離純化技術

1、會計學1生化物質的分離純化技術生化物質的分離純化技術5.對酸性物質的提取，常在什么條件下進行？對堿性物質的提取，常在什么條件下進行？對兩性物質的提取，常在什么條件下進行？6.以細丙為例解釋提取制備每步的基本原理？4.什么叫動態(tài)吸附和靜態(tài)吸附？它們在應用上有何區(qū)別？生生 化化 物物 質質 的的 制制 備備 一般從天然生物材料制作生化物質的過程大體可分為六個階段： 1.1.原料的選擇和預處理原料的選擇和預處理 2.2.原料的粉碎原料的粉碎； 3 3.提取提取，即從原料中經溶劑分離有效成分，制成粗品 的工藝過程； 4 4.純化純化，即粗制品經鹽析、有機溶劑沉淀、吸附、層析、透析、超離心、膜分離、結晶

2、等步驟進行精制的工藝過程； 利用生化制備技術從生物材料中利用生化制備技術從生物材料中獲得特殊的生物活性物質，如蛋白質獲得特殊的生物活性物質，如蛋白質、酶、激素、核酸等生化產品時，通、酶、激素、核酸等生化產品時，通常要注意以下幾個問題：常要注意以下幾個問題： 6.6.成品及成品及. .制劑制劑，即半成品或原料藥經精細加工制成片劑、口服液、針劑、凍干劑等供飲用或臨床應用的各種劑型。5.5.干燥及保存干燥及保存；1生物材料的組成成分非常復雜，有數(shù)百種甚至更多，各種化合物的形狀、大小、相對分子質量和理化性質都各不相同，有的迄今還是未知物，而且這些化合物在分離時仍在不斷的代謝變化中。 2在生物材料中，有

3、些化合物含量很低或極微，有的只有1l0 000，甚至更少。制備時，原材料用量很大，得到產品很少，與投料量相比“虎頭蛇尾”。近年來，用所謂“釣魚法”，利用某些分子特有的專一親和力，將某一化合物從極復雜的體系中“釣”出來，與其他化學分離技術相比具有很大的優(yōu)越性。 3許多生物活性物質，一旦離開了生物體內環(huán)境，很易變性及被破壞，應十分注意保護這些化合物生物的活性，常選擇十分溫和的條件，盡可能在較低溫度和潔凈環(huán)境中進行。一般來說制備的操作時間長、手續(xù)較繁瑣。因為許多大分子在分離過程中，過酸、過堿、重金屬離子、高溫、劇烈的機械作用、強烈的輻射和機體內自身酶的作用，均可破壞這些分子的結構或生理活性。 4生化

4、分離制備過程幾乎都在溶液中進行，各種溫度、pH、離子強度等參數(shù)，對溶液中各種組成的綜合影響，常常無法固定，有些實驗或工藝的設計理論性不強，常帶有很大的經驗成分。因此，要建立重復性好的成熟工藝，對生物材料、各種試劑及其輔助材料等都要嚴格地加以規(guī)定。 5生化制備方法最后均一性的證明與化學上純度的概念并不完全相同，這是由于生物分子對環(huán)境反應十分敏感，結構與功能的關系比較復雜，評定其均一性時，要通過不同角度測定，才能得出相對“均一性”結論，只憑一種方法所得純度的結論，往往是片面的，甚至是錯誤的。原料選擇和預處理原料選擇和預處理 選什么樣的原材料應視生產目的而定。一般要注意以下幾個方面: 1 1要選擇有

5、效成分含量高的新鮮材料要選擇有效成分含量高的新鮮材料； 2 2來源豐富易得；來源豐富易得； 3 3制造工藝簡單易行制造工藝簡單易行； 4 4成本比較低；成本比較低； 5 5經濟效果要好。經濟效果要好。 如蛋白質原料的選擇 蛋白質類生化產品的原料來源有動植物組織和微生物等，原則是要選擇富含所需蛋白質多肽成分的、易于獲得和易于提取的無害生物材料。 對天然蛋白質生化產品，為提高其質量、產量和降低生產成本，對原料的種屬、發(fā)育階段、生物狀態(tài)、來源、解剖部位、生物技術產品的宿主菌或細胞都有一定的要求，了解這些，可使分離純化工作事半功倍，反之則收效甚微。 1 1種屬種屬 牛胰含胰島素（isulin)單位比豬

6、胰高，牛為4000 IUkg胰臟，豬為3000 IUkg胰臟?？乖詣t豬胰島素比牛胰島素低，前者與人胰島素相比，只有1個氨基酸的差異，而牛有3個氨基酸的差異。 2 2發(fā)育生長階段發(fā)育生長階段 幼年動物的胸腺比較發(fā)達，老齡后逐漸萎縮，因此胸腺原料必須采自幼齡動物。 3 3生物狀態(tài)生物狀態(tài) 動物飽食后宰殺，胰臟中的胰島素含量增加，對提取胰島素有利，但膽囊收縮素的分泌使膽汁排空，對膽汁的收集不利。嚴重再生障礙性貧血癥患者尿中的EPO（erythropoietin,紅細胞生成素）含量增加。 4 4原料來源原料來源 血管舒緩素可分別從豬胰臟和豬顎下腺中提取，兩者生物學功能并無二致，而穩(wěn)定性以顎下腺來源為

7、好，因其不含蛋白水解酶。 5 5原料解剖學部位原料解剖學部位 豬胰臟中，胰尾部分含激素較多，而胰頭部分含消化酶較多。如分別摘取則可提高各產品的收率。 胃膜素以采取全胃粘膜為好，胃蛋白酶(pepsin)則以采取胃底部粘膜為好，因胃底部粘膜富含消化酶。 6.6.從簡化提純步驟著手從簡化提純步驟著手 如從鴿肝中提取乙?；?，需將動物饑餓后取材，可減少肝糖原，以簡化純化步驟。7 7對生物技術產品宿主菌或細對生物技術產品宿主菌或細胞的要求胞的要求 選擇生物技術產品的宿主受體菌或細胞也應考慮到后處理的問題。如用大腸桿菌表達，由于其不能將所表達的蛋白質分泌到體外，故提取時必須破壁，增加了提取的困難，而且還可

8、能含有毒素類有害因子；用枯草桿菌 用腫瘤細胞作宿主細胞制成的生化產品還應考慮到其安全性，制造體外診斷用試劑則是很好的高產方法?；蚪湍妇魉拗骶m可解決這一矛盾，但表達的蛋白質成分仍有缺乏糖基化等翻譯及修飾的缺陷；用動物細胞和昆蟲細胞表達則能比較好地解決后處理及完整表達的問題。原料的粉碎原料的粉碎 在提取前先將大塊的原料粉碎或絞碎成適用的粒度，或將細胞破碎，使胞內生物活性物質充分釋放到溶液中，有利于提取或吸附。不同的生物體或同一生物體不同的組織，其破碎的難易不一樣，使用的方法也不完全相同。動物的臟器組織，常用絞肉機機械法粉碎；植物肉質組織可以磨碎；許多微生物均具有堅韌的細胞壁，常用自溶、冷熱交

9、替、加砂研磨、超聲波、加壓處理等破碎方法。如果提取的有效成分是體液或細菌胞外某些多肽激素、酶等，則不需要破碎細胞。 主要通過機械力的作用，使組織粉碎。粉碎少量原料時，可使用高速組織搗碎機（10 000rmin）、勻漿器、研缽、研船等。工業(yè)生產上一般常用的粉碎設備有電磨機、球磨機、萬能粉碎機、絞肉機、擊碎機等。 一、機械法一、機械法 二、物理法二、物理法1.1.反復凍融法反復凍融法 把待破碎的樣品冷至1520，使之凝固，然后緩慢地溶解，如此反復操作，大部分動物性的細胞及細胞內的顆?？梢云扑?。 在細菌或病毒中提取蛋白質和核酸時可用此法。操作時，將材料投入沸水中，在90左右維持數(shù)分鐘，立即置于冰浴中

10、，使之迅速冷卻，絕大部分細胞被破壞。 2.2.冷熱交替法冷熱交替法 3 3超聲波處理法超聲波處理法 多用于微生物材料，處理的效果與樣品濃度、使用頻率有關。用大腸桿菌制備各種酶時，常用50100mgL菌體的濃度，在1KHz10KHz（千赫茲）頻率下處理1015min。對于其他細菌，則視具體情況而定。操作中注意避免溶液中氣泡的存在，制備對超聲波敏感的一些核酸、酶，要慎重使用。 4.4.壓破碎法壓破碎法 加氣壓或水壓（如上海高壓勻漿泵廠生產的高壓勻質機），達20.5934.32（兆帕）MPa（210350kgfcm2）的壓力時，可使90%以上細胞被壓碎。多用于微生物酶制劑的工業(yè)制備。 三、生化及化學

11、法三、生化及化學法 1 1自溶法自溶法 即新鮮的生物材料存放在一定的pH和適當溫度下，利用組織細胞中自身的酶系將細胞破壞，使細胞內含物釋放出來的方法。自溶的溫度，動物材料選在04，微生物材料則多在室溫下進行。 自溶時，需加少量的防腐劑，如甲苯、氯仿等，以防止外界細菌的污染。因自溶的時間較長，不易控制，故制造具有活性的核酸、蛋白質時比較少用。2 2酶處理法酶處理法 用外來酶處理生物材料，如溶菌酶（Lysozyme）是專一地破壞細菌細胞壁的酶。如用噬菌體感染大腸桿菌細胞制造DNA時，采用pH8的0.1molL三羥甲基氨基甲烷（Tris）0.01molL乙二胺四乙酸（EDTA）制成每毫升含2億個細胞

12、的細胞懸液，然后加入100g 1mg的溶菌酶，在37保溫10min，細菌胞壁即被破壞；還有把蝸牛酶用于酵母細胞的破碎；用胰酶處理豬腦制備腦安素。用于專一性分解細胞壁的酶還有纖維素酶（破壞植物細胞）、細菌蛋白酶、酯酶、殼糖酶等。 3. 3.表面活性劑處理法表面活性劑處理法 表面活性劑的分子中，兼有親脂性和親水性基團，能降低水的界面張力，具有乳化、分散、增溶作用。較常用的有十二烷基硫酸鈉(SDS)、氯化十二烷基吡啶、去氧膽酸鈉等。 生化物質的提取生化物質的提取 利用一種溶劑對不同物質溶解度的差異，從混合物中分離出一種或幾種組分的過程稱為提?。╡xtraction），提取又稱萃取或抽提，其含義基本相

13、同。用冷溶劑從固 體 物 質 提 取 的 過 程 可 稱 為 浸 漬 （maceration）；用熱溶劑者可稱為浸提（digestion），也稱浸煮 一、物質的性質與提取一、物質的性質與提?。ㄒ唬┪镔|的性質與提取方法的選擇（一）物質的性質與提取方法的選擇 選擇合適的溶劑系統(tǒng)與提取條件。 （二）活性物質的保護措施二）活性物質的保護措施 1采用緩沖系統(tǒng) 2添加保護劑（半胱氨酸，還原性谷胱甘肽等） 3抑制水解酶的作用(SDS,EDTA) 4其他保護措施(避免過酸過堿和劇烈攪拌 ）（三）生化物質的提?。ㄈ┥镔|的提取 一般生產上多用23次提取。溶劑用量（L）為生物材料的25倍，少數(shù)情況也有用102

14、0倍量溶劑作一次性提取。目的是節(jié)省提取時間，降低有害酶的作用。 二、影響提取的因素二、影響提取的因素 （）溫度（二）酸堿度 （三）鹽濃度 四、提取方法 （）用酸、堿、鹽水溶液提?。ǘ┯帽砻婊钚詣┨崛。ㄈ┯袡C溶劑提取 對酸性物質的提取，常在堿性條件下進行；對堿性物質的提取，常在酸性條件下進行；對兩性物質的提取，則使水溶液的pH值在該兩性物質的等電點附近為佳。三、超臨界氣體的萃取技術三、超臨界氣體的萃取技術 以氣體為萃取劑，當氣體處于超過臨界溫度和臨界壓力時，呈現(xiàn)一種既非液相又非氣相的流體，兼有液體和氣體的特性。如密度接近于液體，粘度卻接近于氣體，具有良好的溶劑性質。 氣體萃取劑必須具有臨界壓

15、力低，臨界溫度接近于室溫，化學穩(wěn)定性好，價廉易得等特點。主要有二氧化碳、氮氣、乙烯、乙烷、丙烯、丙烷等，最常用的是二氧化碳。其方法主要有等溫法和等壓法兩種，借助于壓力或溫度的調節(jié)分離萃取劑與被萃取物。 該技術應用于酶、不飽和脂肪酸的提?。ㄈ玺~油和卵磷脂的提?。?、精制和回收，也可用于生化產品的溶劑脫除。某些生化產品在生產過程中，采用了丙酮和甲醇溶劑，欲脫去溶劑又要避免產品的分解，需選擇超臨界氣體提取。與減壓干燥法相比較，前者不多消耗能源，且縮短脫溶時間。 五、提取液的分離五、提取液的分離 提取所得到的溶液，需與固體或另一液體分離。溶液與固體的分離，一股處理方法有三種：自然沉降、過濾、離心。自然沉

16、降是在液體介質中，固體自然下沉而分離的過程。當混懸液處理量較大，且固體和液體的比重懸殊時，可用此法。沉降分層后，可用虹吸等方法將液體部分移去。過濾系利用多孔材料阻留固體，而使液體 通過，達到固體與液體分離的過程。離心是利用旋轉運動的離心力進行分離物料的一種操作，其中通過過濾介質分離液體和固體者為離心過濾；利用液體比重的大小分離出不同比重的液體者為離心分離；利用液固兩相比重的差異進行沉降分離者為離心沉降。生化物質的分離純化技術生化物質的分離純化技術 生化物質分離純化技術包括：生化生化產品的分離分析和生化產品的制備產品的分離分析和生化產品的制備。前者主要對生物體內各組份加以分離后進行定、定量鑒定，

17、它不一定要把某組分從混合物中分離提取出來；而后者則主要是為了獲得生物體內某一單純組分。 為了保護目的物的生理活性及結構上的完整性，生物產品的制備中的分離方法多采用溫和的“多階式”方法進行，即常說的“逐級分離”方法。為了純化一種生化物質常常要聯(lián)合幾個，甚至十幾個步驟，并不斷變換各種不同類型的分離方法，才能達到目的。因此操的時間長，手續(xù)繁瑣，給制備工作帶來眾多影響。親和層析法具有從復雜生物組成中專一的“釣出”特異生化成分的特點，目前已在生物大分子，如酶、蛋白、抗體和核酸等的純化中得到廣泛應用。一一 分離純化原理分離純化原理 （1）根據(jù)分子形狀和大小不同進行分離。如差速離心與超離心，膜分離（透析、

18、電滲析）與超濾法，凝膠過濾法。 （2）根據(jù)分子電離性質（帶電性）的差異進行分離。如離子交換法，電泳法，等電聚焦法。 （3）根據(jù)分子極性大小及溶解度不同進行分離。如溶劑提取法，逆流分配法，分配層析法，鹽析法，等電點沉淀法及有機溶劑分級沉淀法。（4）根據(jù)物質吸附性質的不同進行分離。如選擇性吸附與吸附層析法。 （5）根據(jù)配體特異性進行分離親和層析法。二二 分離純化的程序和生產設計分離純化的程序和生產設計（1）確定制備物的研究目的及建立相應的分析鑒定方法；（2）制備物的理化性質穩(wěn)定性的預備試驗；（3）材料處理及抽提方法的選擇； （4）分離純化方法的摸索； （5 5）產物的均一性測定。）產物的均一性測定

19、。 1 1分離純化初期使用方法的選擇分離純化初期使用方法的選擇 早期分離純化用萃取，沉淀，吸附等一些分辨力低的方法較為有利，這些方法負荷能力大，分離量多兼有分離提純和濃縮作用，為進一步分離純化創(chuàng)造良好的基礎。 早期分離方法的選擇原則是從低分辨能力到高分辨能力，而且負荷量較大者為合適，但隨著許多新技術的建立，一個特異性方法的分辨力愈高，便意味著提純步驟愈簡化，收率愈高，生化物質的變性危險愈少，因此親和層析法，纖維素離子交換層析法、連續(xù)流動電泳、連續(xù)流動等電聚焦等在一定條件下，也用于從粗提取液中分離制備小量目的物。2 2各種分離純化方法的使用程序各種分離純化方法的使用程序 生化物質的分離都是在液相

20、中進行，故分離方法主要根據(jù)物質的分配系數(shù)，分子量大小，離子電荷性質及數(shù)量和外加環(huán)境條件的差別等因素為基礎。 例如純化其一兩性物質時，前一步已利用該物質的陰離子性質，使用了陰離子交換層析法，下一步提純時再應用其陽離子性質作層析或電泳分離便會取得較好分離效果。 如有些雜質在各種條件下帶電荷性質可能與目的物相似，其分子形狀與大小與目的物相差較大，而另一些雜質的分子形狀與大小可能與目的物相似，但在某條件下與目的物的電荷性質不同，在這種情況下，先用分子篩，用離心或膜過濾法除去分子量相差較大的雜質，然后在一定pH值和離子強度范圍下，使目的物變成有利的離子狀態(tài)，便能有效地進行色層析分離。 在安排純化方法順序

21、時，還要考慮到有利于減少工序，提高效率，如在鹽析后采取吸附法，必然會因離子過多而影響吸附效果，如增加透析除鹽，則使操作大大復雜化。如倒過來進行，先吸附，后鹽析就比較合理。 3 3分離后期的保護性措施分離后期的保護性措施 在分離操作的后期必須注意避免產品的損失，主要損失途徑是器皿的吸附，操作過程樣品液體的殘留，空氣的氧化和某些事先無法了解的因素。為了取得足夠量的樣品，常常需要加大原材料的用量，并在后期純化工序中注意保持樣品溶液有較高的濃度，以防制備物在稀溶液中的變性，有時常加入一些電解質以保護生化物質的活性，減少樣品溶液在器皿中的殘留量。三三 分離純化方法的評估分離純化方法的評估 每一個分離純化

22、步驟的好壞，除了從分辨能力和重現(xiàn)性兩方面考慮外，還要注意方法本身的回收率，特別是制備某些含量很少的物質時，回收率的高低十分重要。一般經過56步提純后，活力回收在25以上。但不同物質的穩(wěn)定性不同、分離難易不同，回收率也不同。 對每一步驟方法的優(yōu)劣的記錄，體現(xiàn)在所得產品重量及活性平衡關系上。這一關系，可通過每一步驟的分析鑒定求出。例如酶的分離純化，每一步驟產物重量與活性關系，通過測定酶的比活力及溶液中蛋白質濃度的比例。其他活性物質也可通過測定總活性的變化與樣品重量或體積與測出的活力列表進行對比分析，算出每步的提純倍數(shù)及回收率。 四四 生化產品純度的鑒定生化產品純度的鑒定 一個制備物是否純，常以“均

23、均一性一性”表示。均一性是指所獲得的制備物只具有一種完全相同的成分，均一性的評價常須經過數(shù)種方法的驗證才能肯定。有時某一種測定方法認為該物質是均一的，但另一種測定方法卻可把它分成兩個甚至更多的組分，這就說明前一種鑒定方法所得的結果是片面的。如果某物質所具有的物理、化學等方面性質經過幾種高靈敏度方法的鑒定都是均一的，那么大致可以認為它是均一的。當然，隨著更好的鑒定方法的出現(xiàn)還可能發(fā)現(xiàn)它不是均一的。絕對的標準只有把制備物的全部結構搞清楚，并經過人工合成證明具有相同生理活性時，才能肯定制備物是絕對純凈的。 生物分子純度的鑒定方法很多，常用的有溶解度法，化學組成分析有溶解度法，化學組成分析法，電泳法，

24、免疫學方法，離心沉法，電泳法，免疫學方法，離心沉降分析法，各種色譜法，生物功能降分析法，各種色譜法，生物功能測定法，以及質譜法測定法，以及質譜法等。等。細胞色素細胞色素C C的制備與測定的制備與測定 細胞色素細胞色素C C的性質的性質 細胞色素（Cytochrome）是包括多種能夠傳遞電子或能夠激活氧的含鐵蛋白質的總稱，廣泛存在于自然界，在各種動物，植物組織和微生物中都能找到。在生物氧化過程中，細胞色素是重要的呼吸傳遞體。細胞色素C（Cytochrome C）又稱細胞色素丙，簡稱細丙。主要存在于線粒體中，需氧多的組織含細胞色素C最多，如心肌及酵母細胞的細胞色素C含量比一般組織細胞的高。所以制備

25、中多采用心肌和酵母作為提取分離細胞色素C的原料。 細胞色素C是含鐵卟啉的結合蛋白質。鐵卟啉和蛋白質部分的比例為1:1。由碳、氫、氧、氮、硫、鐵6種元素組成。牛、馬、豬、人心的細胞色素C蛋白質部分均由104個氨基酸組成，其中只有數(shù)個氨基酸不同，氨基酸中含有較多的精氨酸，故呈鹽基性。豬心肌的細胞色素C含鐵量為0.38 0.43，相對分子質量12200，等電點pI為10.210.8。細胞色素C的結構中的輔基通過卟啉環(huán)上乙烯基的-碳和酶蛋白的一SH基按1:1連接成硫醚鍵，其連接方式見下圖。 圖 細胞色素C的結構式 細胞色素C溶于水，易溶于酸性溶液，故可自酸水中提取。它可分為氧化型和還原型兩種。細胞色素

26、C的傳遞電子作用是由于細胞色素C中的鐵原子可以進行可逆的氧化和還原反應。 R 一Fe3+ RFe2+ 氧化型細胞色素C 還原型細胞色素C 這里R代表細胞色素C分子中鐵原子以外的卟啉蛋白部分。從以上反應式可見，當細胞色素C分子中的鐵原子為三價時(Fe3十)，是氧化型的，但接受一個電子后變成二價鐵（Fe2+），成了還原型的細胞色素c分子，電子一旦給出后又成了氧化型的。兩者在水溶液中的顏色明顯不同：其氧化型水溶液呈深紅色，還原型水溶液呈桃紅色。細胞色素C對熱較穩(wěn)定，不易變性，在pH 7.210.2時，加熱至100 3min，變性才1828%。對酸堿比較穩(wěn)定，可抵抗0.3molL HCl和0.1mol

27、/L KOH的長時間處理。但三氯醋酸和乙酸可使之變性，引起某些失活。其還原型較氧化型穩(wěn)定，不易與一氧化碳（CO）、氰化鉀（KCN）結合，故一般都制成還原型，比較穩(wěn)定，易保存細胞色素C溶液容易染菌，故需加少量氯仿和低溫保存，亦可保存于硫酸銨溶液中或加4倍量冷丙酮沉淀制成凍干粉末，可保持活性數(shù)年。細胞色素細胞色素C C的臨床作用的臨床作用 細胞色素C是一種細胞呼吸激活劑。在臨床上細胞呼吸障礙引起的一系列缺氧狀態(tài)，在使用細胞色素C后就可以糾正其物質的代謝，使細胞恢復正常呼吸，病情得到緩解或痊愈。細胞色素C目前在臨床上雖非特效藥物，但可用于缺氧急救、解毒及其輔助治療，是治療組織缺氧及由缺氧所引起的一系

28、列癥狀的重要生物藥品。如用細胞色素C治療腦血管障礙腦血管障礙、腦軟化、腦出血、中風后遺、腦軟化、腦出血、中風后遺癥、腦動脈硬化癥、腦外傷、癥、腦動脈硬化癥、腦外傷、嬰幼兒百日咳、腦病、不可逆嬰幼兒百日咳、腦病、不可逆休克期缺氧、腦栓塞、腦震蕩休克期缺氧、腦栓塞、腦震蕩后遺癥、乙型腦炎的神經精神后遺癥、乙型腦炎的神經精神癥狀、心代償不全、心肌炎、癥狀、心代償不全、心肌炎、狹心癥、白喉心肌炎、肺心病狹心癥、白喉心肌炎、肺心病、心絞痛、心絞痛、心肌梗塞、肺炎、肺癌、硅肺、喘心肌梗塞、肺炎、肺癌、硅肺、喘息、肺氣腫及支氣管擴張引起的呼息、肺氣腫及支氣管擴張引起的呼吸困難、一氧化碳中毒、安眠藥中吸困難、

29、一氧化碳中毒、安眠藥中毒、麻醉前處理、新生兒假死、神毒、麻醉前處理、新生兒假死、神經麻痹癥等。對抗癌藥物引起的白經麻痹癥等。對抗癌藥物引起的白血球降低、四肢血行障礙、肝疾患血球降低、四肢血行障礙、肝疾患、腎炎、腎炎等亦有一定療效。細胞色素細胞色素C(Cyt.C)C(Cyt.C)的制備及含量測定的制備及含量測定 每組稱心肌碎肉每組稱心肌碎肉150g150g，加自來水，加自來水300mL300mL（水預先用（水預先用6 67mL 1mol/L H7mL 1mol/L H2 2SOSO4 4 酸化）酸化） 用用1mol/L H1mol/L H2 2SOSO4 4調調pH3.8pH3.8 4.04.0

30、（需不斷調整）（需不斷調整） 攪拌提取攪拌提取1.5h 1.5h 用用1mol/L NH1mol/L NH4 4OHOH調調pH6.0pH6.0用四層紗布擠壓過濾，收集濾液（暗紫色，渾濁），肉渣回收用四層紗布擠壓過濾，收集濾液（暗紫色，渾濁），肉渣回收 用用1mol/L NH1mol/L NH4 4OHOH調調pH7.5pH7.5 8.08.0，靜置，靜置101030min30min，使溶液分層，使溶液分層 虹吸上部溶液，過濾除雜質，下部渾濁液離心（虹吸上部溶液，過濾除雜質，下部渾濁液離心（3000rpm3000rpm，15min15min） 每人稱人造沸石每人稱人造沸石4g 4g 合并清液合

31、并清液 浮選浮選 平均分成兩份平均分成兩份 自來水裝柱自來水裝柱 上樣（流速不大于上樣（流速不大于10mL/min10mL/min） Cyt.CCyt.C吸附，沸石呈紅色，流出液為黃色（或淺紅色）吸附，沸石呈紅色，流出液為黃色（或淺紅色） 依次用依次用30mL30mL自來水、去離子水、自來水、去離子水、 0.2% NaCl0.2% NaCl、去離子水洗柱、去離子水洗柱 用用25% (NH25% (NH4 4) )2 2SOSO4 4洗脫（流速小于洗脫（流速小于2mL/min2mL/min） 收集紅色洗脫液，量體積（收集紅色洗脫液，量體積（控制在控制在10mL10mL左右左右） 每每100mL1

32、00mL洗脫液加洗脫液加17g17g固體固體(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4，邊加邊攪拌至，邊加邊攪拌至(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4完全溶解，并有沉淀完全溶解，并有沉淀析出析出 將溶液置于小試劑瓶中，室溫靜置一周將溶液置于小試劑瓶中，室溫靜置一周 （接上周）（接上周） 濾紙過濾，收集濾液，量體積濾紙過濾，收集濾液，量體積 按按8% 8% 體積滴加體積滴加20% TCA20% TCA，邊加邊攪拌，邊加邊攪拌 Cyt.CCyt.C形成可逆沉淀，立即離心（形成可逆沉淀，立即離心（3000rpm3000rpm，15min15min），收集），收集 沉淀沉淀若上清液仍為紅色，

33、倒出后再補加若上清液仍為紅色，倒出后再補加5% 5% 體積的體積的TCATCA，再次離心，收集沉淀，再次離心，收集沉淀 Cyt.CCyt.C沉淀用少量去離子水溶解（體積不超過沉淀用少量去離子水溶解（體積不超過5mL5mL） 溶解液裝入透析袋溶解液裝入透析袋對自來水、去離子水透析，用對自來水、去離子水透析，用Ba(Ac)Ba(Ac)2 2檢測透析袋周圍水的檢測透析袋周圍水的SOSO4 42- 2- 過濾除去不溶物過濾除去不溶物, ,得到得到Cyt.CCyt.C粗品液，量體積，測定其含量粗品液，量體積，測定其含量 取取5 5支試管，按以下步驟操作：支試管，按以下步驟操作：試管編號試管編號12345標準液標準液/mL00.50.500樣品液樣品液/mL0000.5 0.5 dH2O/mL3.02.52.52.52.5還原粉還原粉少許少許少許少許少許少許少許少許少許少許A520nm 注明：依樣品液顏色深淺適當增減所取樣品液的體積，用注明：依樣品液顏色深淺適當增減所取樣品液的體積，用dHdH2 2O O補足補足4mL4mL，使樣，使樣品管與標準管顏色相近，以減少誤差。品管與標準管顏色相近，以減少誤差。計算總含量（