放射性配體及受體結(jié)合分析實驗(RBA)方法

1、放射性配體與受體結(jié)合分析實驗（RBA）方法劉星華2011-5-13藥理室講座藥理室講座內(nèi)容l實驗定義與原理l實驗材料與儀器l實驗方法lScatchard方程與作圖（飽和與競爭實驗）lRBA的安全問題l實驗舉例實驗定義與原理l定義l放射性配基與受體結(jié)合分析簡稱為受體放射分析（radioassay of receptors），它是應用放射性核素標記配基與特異受體相結(jié)合，研究受體的親和力和受體的數(shù)量，以及研究受體亞型的常用方法。 l原理 l放射性標記配基（激動劑或拮抗劑）和組織、細胞，或含有受體的制劑一起溫育，使受體和配基充分結(jié)合，形成受體-配基復合物，終止反應后，用過濾或離心的方法除去未被結(jié)合的標

2、記物，測定濾膜或沉淀物中的放射性，即可計算出和配基結(jié)合的受體的量。RBARBA的分類的分類 RBA RBA用放射性核素來標記配基，與相應的受用放射性核素來標記配基，與相應的受體進行特異性結(jié)合反應，可對受體的性質(zhì)進行定體進行特異性結(jié)合反應，可對受體的性質(zhì)進行定性和定量的分析。性和定量的分析。l 1 1、定性、定性RBARBA：是通過反應的量效關系的變化：是通過反應的量效關系的變化來判斷受體的類型，單位點或多位點結(jié)合式，及來判斷受體的類型，單位點或多位點結(jié)合式，及受體與配體結(jié)合的特點，反應的可逆性、協(xié)作性受體與配體結(jié)合的特點，反應的可逆性、協(xié)作性等。等。l 2 2、定量、定量RBARBA：是在已知

3、配體與受體反應性質(zhì)：是在已知配體與受體反應性質(zhì)的基礎上，通過結(jié)合反應，給出一定量的組織或的基礎上，通過結(jié)合反應，給出一定量的組織或細胞中能與該放射性配體結(jié)合的細胞中能與該放射性配體結(jié)合的受體數(shù)受體數(shù)及結(jié)合的及結(jié)合的平衡解離常數(shù)平衡解離常數(shù)或或結(jié)合位點數(shù)結(jié)合位點數(shù)（最大結(jié)合容量）。（最大結(jié)合容量）。 實驗材料與儀器實驗材料與儀器實驗材料l動物組織（皮層、海馬、紋狀體等）l儀器（組織勻漿機、旋渦混合器、低溫高速離心機、電熱恒溫水溫箱、-80冰箱、制冰機、抽慮瓶、液閃儀等）l材料（ 2ml/6ml分離管、10ul/200ul/1ml槍頭、微纖維濾紙等）l藥品（放射性配基、各種非標計化合物等）實驗儀器

4、l組織勻漿機lIKA，T10B S25 l漩渦混合器lWH-2l低溫高速離心機l凱達，TGL20Ml超低溫冰箱l海爾l數(shù)顯恒溫水浴鍋l金燕，HH-S26Sl制冰機lGELINl型號IMS-50 automatic ice flakes電熱恒溫水溫箱l循環(huán)水式多用真空泵l液閃測定計數(shù)儀lHIDEX， 425-034型實驗材料l2ml離心管l6ml一次性軟試管槍頭1ml10ul200ullTrislPPO與POPOP過濾裝置l砂芯過濾裝置（抽濾瓶） l1000mllWhatman GF/C玻璃微纖維濾紙 l40mm放射性化合物l放射性配體l低溫保存實驗方法流程實驗方法流程實驗方法流程實驗方法流程1

5、 1、制備受體樣品；、制備受體樣品；2 2、加樣、溫育進行結(jié)合反應；、加樣、溫育進行結(jié)合反應；3 3、終止反應，分離結(jié)合物與游離物、終止反應，分離結(jié)合物與游離物4 4、測定結(jié)合物的放射性；、測定結(jié)合物的放射性；5 5、數(shù)據(jù)處理。、數(shù)據(jù)處理。實驗具體操作（D1、D2、5-HT）l1、配制各種緩沖液及試劑 l按處方配比配制各種緩沖液貯備液l配制各種非標記配體溶液l配制各種受試藥物溶液l注意注意：該項操作所需試劑或儀器該項操作所需試劑或儀器l儀器：儀器：分析天平、移液槍、燒杯、量筒、容量瓶、試管、EP管等l試劑：試劑：無水乙醇、超純水、Tris 、抗血酸、優(yōu)降寧、HCl 、NaCl、KCl、CaCl

6、2、MgCl2 、DMSO 、甲苯、PPO 、POPOP、Methysergide 、Butaclamol及5HT 等 2、制備膜受體 l大鼠斷頭取腦 l分離出目標組織 l加10倍體積（V / W）冰冷的緩沖液 l用組織勻漿機勻漿3次，每次數(shù)秒鐘，制成組織勻漿液 l組織勻漿液用低溫高超離心機離心（12000轉(zhuǎn)/分）3次，每次20分鐘l棄上清液，沉淀（膜受體）放-80度超低溫冰箱保存?zhèn)溆?l注意：該項操作所需試劑或儀器注意：該項操作所需試劑或儀器l儀器：儀器：手術(shù)器械、組織勻漿機、制冰機、超低溫冰箱、低溫高超離心機 l試劑：試劑：超純水3、加樣加樣l取出膜受體，加入一定體積的冰冷的緩沖液，混勻，

7、使成一定濃度的膜受體溶液。l取放射性配體母液，用無水乙醇稀釋成實驗所需濃度取放射性配體母液，用無水乙醇稀釋成實驗所需濃度 l按以下順序及比例加入各種反應液。l（1）總結(jié)合管：100ul膜受體 + 200ul緩沖液 + 10 ul 放射性配體l（2）非特異管：100ul膜受體 + 100ul緩沖液 + 100ul非標記配體 + 10 ul 放射性配體l（3）受試物管：100ul膜受體 + 100ul緩沖液 + 100ul藥物溶液 + 10 ul 放射性配體l注意：該項操作所需試劑或儀器注意：該項操作所需試劑或儀器l儀器：儀器：移液槍、燒杯、量筒、EP管等l試劑：試劑：超純水、無水乙醇、放射性配體

8、母液放射性配體母液 4、 受體配體結(jié)合反應受體配體結(jié)合反應l以上各管在加完放射性配體后，立即放入37度的水浴鍋中，孵育20分鐘。20分鐘后把各管放入冰中終止反應。l注意：該項操作所需試劑或儀器注意：該項操作所需試劑或儀器l儀器：儀器：恒溫水浴鍋，制冰機 l試劑：試劑：無 5 、分離游離及結(jié)合的放射性配體、分離游離及結(jié)合的放射性配體l上述各管在反應結(jié)束后，分別倒入抽濾裝置進行過濾，并用5-10ml冰冷的緩沖液沖洗濾膜2次。濾膜放入85度烘箱中烘干，隨后放入測試管中，關加入一定體積的閃爍液，浸泡過夜。 l注意：該項操作所需試劑或儀器注意：該項操作所需試劑或儀器l儀器：儀器： 抽濾器、烘箱、濾紙、移

9、液槍、液閃杯l試劑：試劑： 甲苯、PPO 、POPOP6、 測定結(jié)合型放射配體每分鐘放射計數(shù)測定結(jié)合型放射配體每分鐘放射計數(shù)l采用放射性計數(shù)儀，測定各測試管中結(jié)合型放射配體每分鐘放射計數(shù)l注意：該項操作所需試劑或儀器注意：該項操作所需試劑或儀器l儀器：儀器： 液閃儀l試劑：試劑： 無7、數(shù)據(jù)處理l按以下公式計算各化合物對同位素配基結(jié)合的抑制率百分率：l抑制率(I %)=（總結(jié)合管cpm化合物cpm）/ （總結(jié)合管cpm非特異結(jié)合管cpm）100%l化合物每次實驗做兩復管，進行兩次單獨實驗。8、各種指標lIC50：半數(shù)抑制濃度lKD：平衡解離常數(shù)（mol/L），物理意義為受體有一半結(jié)合配基時所需

10、要的配基濃度。lBmax：受體最大結(jié)合容量（fmol /mg蛋白質(zhì)）lnH：Hill系數(shù)Scatchard方程與作圖（飽和實驗）Scatchard方程與作圖l簡單單位點系統(tǒng)受體和配體結(jié)合反應（簡單單位點系統(tǒng)受體和配體結(jié)合反應（Clark模型）模型）條件：條件：l（1）配基與受體結(jié)合反應為可逆雙分子反應；）配基與受體結(jié)合反應為可逆雙分子反應；l（2）所有受體都是等效和獨立的，同一受體的不）所有受體都是等效和獨立的，同一受體的不同分子對配基的親和力都相等，而且不受鄰近受體同分子對配基的親和力都相等，而且不受鄰近受體分子結(jié)合配基與否的影響；分子結(jié)合配基與否的影響；l（3）配體本身不代謝，也不與其它位

11、置結(jié)合；）配體本身不代謝，也不與其它位置結(jié)合；l（4）生物效應的強度與濃度近似于總配基濃度。）生物效應的強度與濃度近似于總配基濃度。飽和曲線l固定的受體數(shù)量，固定數(shù)量的非標和不同固定的受體數(shù)量，固定數(shù)量的非標和不同濃度體積的放射性配體濃度體積的放射性配體 飽和曲線飽和曲線(saturation curve)1）飽和曲線）飽和曲線 受體數(shù)量一定受體數(shù)量一定，當配體（一般是不同濃度體積的放射當配體（一般是不同濃度體積的放射性配體與固定數(shù)量的非標）的濃度從零開始上升時，形成性配體與固定數(shù)量的非標）的濃度從零開始上升時，形成的復合物也逐漸增多。的復合物也逐漸增多。但由于受體數(shù)量有限，又是可逆反但由于受

12、體數(shù)量有限，又是可逆反應，因此應，因此RL（受體配體復合物）的增加不是直線上升，（受體配體復合物）的增加不是直線上升，而是一條上升先快后慢的曲線，最后絕大部分受體與配體而是一條上升先快后慢的曲線，最后絕大部分受體與配體結(jié)合時，結(jié)合時，RL的增加就非常緩慢，漸趨水平，即受體已經(jīng)的增加就非常緩慢，漸趨水平，即受體已經(jīng)飽和了，此即飽和曲線飽和了，此即飽和曲線 。#飽和曲線的作用？飽和曲線的作用？Scatchard作圖，求得作圖，求得KD與與Bmax 2 2）曲線的高度取決于）曲線的高度取決于RTRT。在曲線起始段，曲線上升的。在曲線起始段，曲線上升的快慢即曲線的斜率取決于配基與受體的親和力，所以，快

13、慢即曲線的斜率取決于配基與受體的親和力，所以，KDKD越小越小 ( (親和力越大親和力越大) )，飽和曲線上升越快，飽和曲線上升越快，KDKD越大越大 ( (親和親和力越小力越小) )，飽和曲線上升越慢。，飽和曲線上升越慢。 （即：親和力越大，受體與配件結(jié)合速度越快，時間越短） k1, v1k1, v1 R+L R+L RL RL k2, v2 k2, v2 KDK2/ K1=RL/RL 飽和曲線的形狀和飽和曲線的形狀和KD有關（如圖有關（如圖1）。圖圖1 KD對飽和曲線的影響對飽和曲線的影響 飽和曲線曲線的高度取決于飽和曲線曲線的高度取決于RT（如圖（如圖2）。）。 圖圖2 RT對飽和曲線影

14、響對飽和曲線影響 質(zhì)量作用定律質(zhì)量作用定律 (Mass action law)(Mass action law)： 受體和配基的結(jié)合反應服從可逆反應的質(zhì)受體和配基的結(jié)合反應服從可逆反應的質(zhì)量作用定律，可用下式表示量作用定律，可用下式表示: : k1, v1 k1, v1 R+L R+L RL RL （1 1） k2, v2k2, v2 上式中，上式中，RR和和L L 為游離受體和游離配基的濃度，為游離受體和游離配基的濃度，RLRL為復合物為復合物濃度，濃度，v1v1和和v2v2為結(jié)合速率和解離速率，為結(jié)合速率和解離速率，k1k1和和k2k2為結(jié)合速率常數(shù)為結(jié)合速率常數(shù) (association

15、 rate constant) (association rate constant) 和解離速率常數(shù)和解離速率常數(shù) (dissociation rate (dissociation rate constant)constant)。 數(shù)學表達數(shù)學表達l根據(jù)質(zhì)量作用定律： v1 = k1 R L ；v2 = k2 RLl當反應達到平衡后， v1 = v2 , 即: k1 RL = k2 RL ,則l平衡解離常數(shù)（KD）的數(shù)學表達式為： KDK2/ K1=RL/RL （2） Scatchard作圖作圖l設LT為配體的初始濃度，RT為受體的初始濃度（即受體總量），則有： L = LT RL R =

16、RT RL由式（由式（2）整理可得）整理可得： KD RT-RLL RL 將上式整理可得將上式整理可得： RL = RT 1_ RL （ Scatchard 方程）方程） L KD KD 變形：RL為受體與配基特異結(jié)合的量，換成B表示，L為自由配基的量，換成F表示，RT為受體總量，也即受體最大結(jié)合量，換成Bmax表示，則上式方程變?yōu)?B/F=Bmax/KD - B/KD（ RT 為受體總量，等于為受體總量，等于R和和RL之和，也是最大結(jié)合量之和，也是最大結(jié)合量Bmax） 以復合物濃度以復合物濃度RL為橫坐標，以復合物濃度和游離配體的濃度比值為橫坐標，以復合物濃度和游離配體的濃度比值RL/L為縱

17、坐為縱坐標作圖，即為標作圖，即為Scatchard作圖。作圖。圖圖3 簡單單位點系統(tǒng)簡單單位點系統(tǒng)RBA的的Scatchard作圖作圖簡單單位點系統(tǒng)簡單單位點系統(tǒng)Scatchard作圖為一條直線，斜率為作圖為一條直線，斜率為 -（1/KD），），橫軸截距為橫軸截距為RT，縱軸截距為，縱軸截距為RT/ KD（見圖（見圖3）。）。由此求得KD與BmaxHill方程與作圖l當一個受體分子可以結(jié)合一個以上的配基時，配基受體結(jié)合反應不是簡單的雙分子反應，而是 k1, v1k1, v1 R+nL R+nL nRL nRL ，根據(jù)質(zhì)量作用定律推導出，根據(jù)質(zhì)量作用定律推導出HillHill方程：方程： k2,

18、 v2k2, v2經(jīng)過變形得其中n為hill系數(shù)，以結(jié)合分數(shù)B/Bmax對游離配基L作圖，得Hill作圖（如右）。（3）l將（3）式兩邊取對數(shù) 非特異性結(jié)合非特異性結(jié)合(non-specific binding，NSB)NSB 在在RBA系統(tǒng)中，放射性配體除與受體特異性結(jié)合外，還可系統(tǒng)中，放射性配體除與受體特異性結(jié)合外，還可與其他成分（如非特異蛋白、反應容器、分離材料等）結(jié)與其他成分（如非特異蛋白、反應容器、分離材料等）結(jié)合。合。NSB的特點的特點 親和力小而結(jié)合容量大，不易被飽和，隨反應系統(tǒng)內(nèi)配親和力小而結(jié)合容量大，不易被飽和，隨反應系統(tǒng)內(nèi)配體濃度增加而線性增大，而且這種結(jié)合與生物效應無關（

19、見體濃度增加而線性增大，而且這種結(jié)合與生物效應無關（見圖圖4）。）。圖圖4 飽和曲線實驗中飽和曲線實驗中TB、SB和和NSB的關系的關系在在RBA的數(shù)據(jù)處理時，測得的總結(jié)合的放射性的數(shù)據(jù)處理時，測得的總結(jié)合的放射性(total binding，TB)，必須減去必須減去NSB，才能得到特異性結(jié)合，才能得到特異性結(jié)合(specific binding，SB)的數(shù)據(jù)。的數(shù)據(jù)。競爭曲線l固定的放射性配基濃度，一定量的受體和不同濃度的未標記化合物數(shù)學表達l此實驗用于測定非標計藥物與放射性配基競爭結(jié)合同一受體的能力。通常用IC50和Ki來表示。閃爍液l包括溶劑、閃爍劑和添加劑l溶劑：溶解閃爍劑和放射性樣品

20、，吸收和傳遞射線能量。l閃爍劑：第一閃爍劑（吸收受激溶劑能量，退激發(fā)光）、第二閃爍劑（波長轉(zhuǎn)移，匹配光電倍增管光譜；提高淬滅耐受）l添加劑：助溶劑、抗淬滅劑各受體的非標與同位素受體非標放射性配基受體組織5-HT1A 5-HT (serotonin) 3H-8-OH-DPAT大鼠紋狀體/皮層5-HT2AMethysergide3H-Ketanserin大鼠紋狀體/皮層D2Butaclamol3H-Spiperone大鼠紋狀體1Prazosin3H-prazosin大鼠皮層2Rauwolscine3H-Rauwolscine大鼠皮層M阿托品3H-QNB（畢茲）大鼠腦去小腦/回腸心得舒3H-DHA鴨

21、紅細胞/大鼠腦RBA的安全問題的安全問題射線射線放射型物質(zhì)發(fā)出的射線有三種：放射型物質(zhì)發(fā)出的射線有三種：三種射線三種射線l射線射線l射線射線 l射線射線 射線射線l根據(jù)射線的偏轉(zhuǎn)方向和磁場方向的關系可以根據(jù)射線的偏轉(zhuǎn)方向和磁場方向的關系可以確定，偏轉(zhuǎn)較小的一束由帶正電荷的粒子組成，確定，偏轉(zhuǎn)較小的一束由帶正電荷的粒子組成，我們把它叫做我們把它叫做射線，射線，射線由帶正電的射線由帶正電的粒子組粒子組成成.科學家們研究發(fā)現(xiàn)每個科學家們研究發(fā)現(xiàn)每個粒子帶的正電荷是電粒子帶的正電荷是電子電荷的子電荷的2倍，倍，粒子質(zhì)量大約等于氦原子的質(zhì)量粒子質(zhì)量大約等于氦原子的質(zhì)量.進一步研究表明進一步研究表明粒子就

22、是氦原子核粒子就是氦原子核.l由于由于粒子的質(zhì)量較大，所以粒子的質(zhì)量較大，所以射線的穿透本射線的穿透本領最小，我們用一張厚紙就能把它擋住領最小，我們用一張厚紙就能把它擋住.射線射線l與與射線偏轉(zhuǎn)方向相反的那束射線帶負射線偏轉(zhuǎn)方向相反的那束射線帶負電荷，我們把它叫做電荷，我們把它叫做射線射線.研究發(fā)現(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)射線射線由帶負電的粒子（由帶負電的粒子（粒子）組成粒子）組成.進一步研進一步研究表明究表明粒子就是電子粒子就是電子.l射線的穿透本領較強，很容易穿透黑射線的穿透本領較強，很容易穿透黑紙，還能穿透幾厘米厚的鋁板紙，還能穿透幾厘米厚的鋁板. 射線射線l 中間不發(fā)生偏轉(zhuǎn)的那束射線叫做中間不發(fā)生偏轉(zhuǎn)

23、的那束射線叫做射線，射線，研究表明，研究表明，射線的實質(zhì)是一種波長極短的射線的實質(zhì)是一種波長極短的電磁波電磁波，它不帶電，是中性的，它不帶電，是中性的.l射線的穿透本領極強，一般薄金屬板射線的穿透本領極強，一般薄金屬板都擋不住它，它能穿透幾十厘米厚的水泥都擋不住它，它能穿透幾十厘米厚的水泥墻和幾厘米厚的鉛板墻和幾厘米厚的鉛板. 射線l在某種核反應中，一個中子變成一個電子和一個質(zhì)子.這就是原子核內(nèi)沒有電子，又會放出電子，這就是產(chǎn)生射線的原因.l射線是一種帶負電荷的、高速運行、從核素放射性衰變中釋放出的粒子。人類受到來源于人造或自然界(氚，C14等)射線的照射，射線比射線更具有穿透力，但在穿過同樣

24、距離，其引起的損傷更小。一些射線能穿透皮膚，引起放射性傷害。但是它一旦進入體內(nèi)引起的危害更大。粒子能被體外衣服消減、阻擋或一張幾毫米厚的鋁箔完全阻擋。 放射防護措施外照防護措施l時間防護：盡量減少受照射時間。l距離防護：距離越遠，輻射能量越低。l屏蔽防護：射線注意防止內(nèi)照射；射線可用鋁、有機玻璃、塑料等原子序數(shù)較低的物質(zhì)；射線可用鉛、鐵、混凝土等高原子序數(shù)物質(zhì)。內(nèi)照射防護措施l圍封隔離防擴散：“三區(qū)配置”法，即清潔區(qū)、中間區(qū)、活性區(qū)；通風良好、獨立的下水處理系統(tǒng)；遵守SOP。l除污保潔防污染l個人防護侵入：穿戴適當?shù)膫€人保護衣具，如工作服、口罩、鞋、帽等。不準在工作場所進食、吸煙。工作結(jié)束后進

25、行衛(wèi)生清洗，并作污染檢測。放射性“三廢”處理l基本方法：放置衰變、濃縮儲存、稀釋排放l固體：一般用放置法（半衰期短）、 焚化法（廢氣的處理）、埋藏法（不可燃/焚化殘渣）l液體：一般用放置法（半衰期短）、稀釋法（量少濃度低）、濃集法（富集掩埋）l氣體：大氣排放（低濃度/氣溶膠）、過濾器或液體吸收（高濃度）表面放射性污染的處理l皮膚：輕度，大量清水和肥皂清洗；嚴重，10%EDTA或6.5%高錳酸鉀浸泡清洗l工作場所表面：輕度，大量清水或洗滌劑清洗；嚴重，挖去再填充或覆蓋油漆/塑料板l工作服：輕度，肥皂水；嚴重，0.02mol/L鹽酸、1%草酸洗滌或廢物處理l儀器及設備：玻璃與陶瓷，3%鹽酸/10%

26、枸櫞酸浸泡1h后沖洗再用洗液浸泡15min后再清洗；金屬，用肥皂、枸櫞酸鈉、EDTA或其它有機溶劑或超聲清洗例子：M膽堿受體配體結(jié)合實驗試劑l放射配體：3H-QNB（比活度：22ci/mmol）l非標：阿托品l0.32mol/L蔗糖溶液l0.05mol/L TrisHCl緩沖液pH7.5。l生理鹽水l甲苯閃爍液 PPO2,5-Diphenyloxazole 【2,5-二甲基惡唑】2.5g加POPOP1,4-Bis(5-phenyloxazol-2-yl)benzene 【1,4-雙（5-苯基惡唑基-2）苯】0.05g，溶于500ml甲苯中。受體組織的制備l中樞：大鼠斷頭取腦，去小腦；20倍0.

27、32mol/L蔗糖制成勻漿；離心，上清液Tris緩沖液懸浮；Lowry法測蛋白。l外周腸平滑?。弘嗍笕』啬c，生理鹽水或Tris緩沖液清洗/保存。受體配體結(jié)合l一、飽和曲線：每個反應管中加入200ul固定濃度的膜蛋白（0.2mg/ml）和50ul不同濃度的3HQNB(0.1、0.25、0.5、1.01、2.15、3.0、4.26、5.48nmol/L),在非特異結(jié)合管中另加入終濃度為10-6mol/L的阿托品，補充Tris緩沖液至總體積1ml，其中之一的操作如下孵育與測量l水溫37孵育30min，5ml冰冷的Tris緩沖液終止反應；抽慮沖洗游離的3HQNB。l濾片80 、30min烘干后置于甲苯閃爍液中，液閃儀測量放射量。下圖為測量結(jié)果之一計算：1